专利名称：抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，是一种生物药品的制作方法。
背景技术：
从2002年11月16日中国广东佛山发现第一例非典型肺炎(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)的病例以来，SARS首先在广东省传播开来，并迅速蔓延到世界各地，根据世界卫生组织(WHO)的最新统计，截止到4月26日，世界上已经有28国家和地区成为SARS的发病地区，全球共发生SARS病例4836例，死亡293例。中国大陆境内病人已达2753例，死亡122例。我国广东省成为本次SARS的最初发病地和大面积流行地区。从SARS发生的那一刻开始，人们就对其致病的真正元凶-病原体进行了大量的追查，并从SARS病人体内分离到了冠状病毒。荷兰ERASMUS大学实验室的科学家成功完成冠状病毒实验的动物模型，确证导致全球肆虐的SARS病症是由一种新型冠状病毒引起的。这一研究结果证实了全球科学家基于近期研究的主流观点，国际病毒学界确认病原的“科斯假设”(KOCH’POSTULATES)四条件全部满足。4月16日，WHO在日内瓦正式宣布，SARS病原已经找到，正式命名为SARS冠状病毒。同时各国的科学家通过夜以继日的工作，已成功破译了SARS冠状病毒全部基因组序列。根据SARS病毒的全基因序列分析结果，SARS病毒基因组结构与其他冠状病毒的结构相似。预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，纤突蛋白(Spike protein，S)，小膜蛋白(small membrane protein，E)，膜蛋白(Membrane protein，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)等。根据核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较结果，发现SARS冠状病毒不属于已知的冠状病毒三个群中的任何一群，与已知的人与动物的冠状病毒均不同，为一种新的冠状病毒。
在美国国家生物信息中心(NCBI)，以SARS病毒为查询序列进行搜索，发现下列几种病毒和SARS病毒的序列相似性较高人的冠状病毒(Humancoronavirus 229E)，小鼠的肝炎病毒(Murine hepatitis virus，MHV)，禽的传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)，牛的冠状病毒(Bovine coronavirus，BCV)，猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)。总体上看，几种病毒的基因组结构非常相似。通过病毒基因组之间的比较，发现在14k-16k的位置是所有冠状病毒都较为保守的区域。这一区域编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RDRP)。同时WHO公布的研究结果证明，用TGEV、HCoV 229E、MHV和猫腹膜炎病毒(Feline InfectiousPeritonitis virus，FIPV)的高免血清可以抑制SARS病毒的增殖。从高免动物(如兔、鸡、牛、羊等)的血清或初乳中分离IgG，在被动免疫治疗中有很重要的意义和价值。但这些来源提供的IgG产量低，成本高，通常只能局限于实验室的免疫学诊断和基础研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，以降低成本，提高抗体的稳定性，预防多种疾病，提高生物药品的性能。
上述的目的通过以下的技术方案实现抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，所述的方法包括制作疫苗原，抗体制备、卵黄匀浆、稀释、低温过夜、过滤纯化，制粉，其中所述的抗SARS禽卵黄抗体的制备方法是选择100-140日龄SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4个部位，间隔2-4周重复加强免疫，每周采血监测抗体效价，二免1-2周后收集经抗体检验合格的禽卵，每周采血检测抗体，中和抗体效价不低于1:256为合格，三免时间依据抗体监测情况决定，注射量与二免相同。
这个技术方案有以下有益效果1.近几十年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发作了许多工作，证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG的最方便、最廉价的来源。鸡卵黄IgG是一种7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白的分子量约为180kDa，含两个亚单位，即67-70kDa的重链和22-30kDa的轻链，又称IgY(Yolk Immunoglobulin)。
2.卵黄中IgG的含量实际上等于甚至要高于母禽血清中的IgG。一只母禽在一个月中生产蛋制备卵黄抗体相当于500ml血清抗体。母禽通过两种途径将其全部同型抗体转移到禽蛋首先是循环血液中的血浆将抗体转移到成熟的卵泡中(也就是进入到卵黄中)，这种选择性转移到卵巢滤泡的a-球蛋白主要是IgG，这种由IgG受体决定的抗体转移决定着母源血液中存在的全部IgG亚群选择性向卵巢滤泡转移。在输卵管中进行的抗体转移过程的第二个途径只涉及到IgM和IgA，转移的部位在蛋清，这为我们制备和利用卵黄IgG提供了方便条件。
3.IgY的生物学特性决定了它广泛的应用领域。在免疫诊断方面，禽IgY具有不激活人类补体，不与蛋白A、蛋白G、哺乳动物Fc受体、补体以及类风湿因子结合等免疫学特性，与IgG几无交叉反应，所以早就在医学领域得到了广泛应用。在免疫治疗方面，因IgY耐热、耐酸且性能稳定，水溶剂4℃保存120天、-20℃保存180天抗体效价不变，如果冻干或喷雾干燥则保存期可大大延长，可经过口服途径治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品，龋齿预防，以及婴幼儿轮状病毒、人流感、弓形虫病的防治等等。在国外，已经有应用抗猪致病性大肠杆菌卵黄抗体和抗犊牛沙门氏菌卵黄抗体治疗猪致病性大肠杆菌和犊牛沙门氏菌感染的报道，国内也有相似的研究。国内广泛使用的有鸡传染性法氏囊病、鸡新城疫、小鹅瘟、鸭瘟、鸡减蛋综合症、鸭肝炎、鸡病毒性关节炎、鸡传染性喉气管炎卵黄抗体等等。卵黄抗体对鸡、鸭、鹅、猪、牛的治疗实践证明，对机体无任何毒副作用。
4.卵黄作为特异性抗体IgY的来源有许多优点。如母禽易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便；无须抽取动物血液，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效的抗体反应所需抗原量小；在国内，禽是率先实现SPF化和产业化的实验动物，有利于规模化生产；禽类与以人为代表的哺乳动物亲缘关系较远，有利于疾病控制，用禽生产人用的免疫球蛋白，不会将导致人类疾病的病原微生物引入到病人的体内，可以解决治疗上的后顾之忧。家禽作为一个有效的抗体生产者，在用单一佐剂抗原免疫后，可长期维持抗体效价，在免疫后1周血清抗体的水平即反应到卵黄中，而且IgG只被分泌到卵黄中，快速、特异、持续时间长、对外界因素抗性强的特点使卵黄抗体十分适应当前“非典”防疫上的迫切需要，可以为“非典”治疗和控制发挥重要作用。
附图1是本发明的技术路线图。
本发明的
具体实施例方式实施例1抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，所述的方法包括制作疫苗原，抗体制备、卵黄匀浆、稀释、低温过夜、过滤纯化，制粉。
本发明根据附图1给出的具体的工艺路线完成，具体过程详细解释如下1.免疫原的制备。选择SARS病毒培养物经β-丙内脂灭活，聚乙二醇-6000浓缩8-15倍做水相。MAUTAMIDEISA-70为油相，按15-20∶50-80高速乳化成油包水型免疫原。
2.抗SARS禽卵黄抗体的制备。选择100-140日龄的SPF禽，例如120日龄SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4个部位。间隔2-4周重复加强免疫(二免)。每周采血监测抗体效价，二免1-2周后收集经抗体检验合格的禽卵。每周采血检测抗体，中和抗体效价不低于1∶256为合格。三免时间依据抗体监测情况决定，注射量与二免相同。
3.抗SARS禽卵黄抗体的提纯。
抗SARS禽卵黄抗体合格蛋，用1∶1000-1500稀释的金碘水溶液将禽卵洗净、凉干，于超净工作台分离蛋黄。分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟备用。
(1)将上述制备的卵黄液与溶剂(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速搅拌(8000-20000转/分，1-4分钟)后离心10000克10-15分钟，如此重复2-4次，保留水相弃油相和沉淀。
(2)将上述制备的卵黄液中加入海藻酸钠使其终浓度为0.14-0.2％并调PH为6.0-7.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2-4分钟)，离心10000克10-15分钟，140-150目铜网过滤、弃沉淀。用饱和硫酸铵溶液与滤液混合制成50-60％的硫酸铵溶液并调PH至7.0-8.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-15分钟弃上清，沉淀用20-40％硫酸铵溶解并调PH7.0-8.0高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-20分钟，如此重复二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
4.SARS卵黄粉的制备工艺。
经测定卵黄和血清的中和抗体效价256倍以上为合格蛋，用1∶1000稀释的金碘水溶液将禽蛋洗净、凉干，于超净工作台分离卵黄。分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟，放于-10℃以下冰柜备用。将1∶2-4比例稀释的卵黄液10000克4℃离心30-40分钟弃沉淀，140-150目铜网过滤，滤液浓缩2-4倍。喷雾干燥入口温度120-160℃、出口温度55-85℃。喷雾干燥蛋黄粉密封保存于2-8℃冷库中，有效期1年，10-20℃保存有效期1个月。
5.病毒中和试验。
病毒的禽胚半数感染量(ELD50)测定将SARS病毒用生理盐水按浓度梯度10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13进行稀释，分别接种10-20日龄SPF禽胚，每个稀释度一组，每组4-8只禽胚，接种量0.1-0.5ml/胚。弃去接种后48小时前死亡胚，记录48-120小时感染数和未感染数，按Reed-Muech法计算鸡胚半数感染量。
病毒中和试验将病毒分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，分别与等量的抗体原液混合，充分混匀后，置4℃反应2-4小时。将10-20日龄的SPF禽胚分成三组接种病毒第一组为正常血清对照组，接种正常血清；第二组为抗体毒性对照组，只接种抗体；第三组接种病毒和抗体的混合液，接种剂量0.1-05ml/胚。接种后，37℃培养，统计24小时后感染和未感染的鸡胚，直至130-150小时，计算高免卵黄提纯抗体的病毒中和指数，1∶256以上合格。
权利要求
1.一种抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的方法包括制作疫苗原，抗体制备、卵黄匀浆、稀释、低温过夜、过滤纯化，制粉，其中所述的抗SARS禽卵黄抗体的制备方法是选择100-140日龄SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4个部位，间隔2-4周重复加强免疫，每周采血监测抗体效价，二免1-2周后收集经抗体检验合格的禽卵，每周采血检测抗体，中和抗体效价不低于1∶256为合格，三免注射量与二免相同。
2.根据权利要求1所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的免疫原的制备是选择SARS病毒培养物经β-丙内脂灭活，聚乙二醇-6000浓缩8-15倍做水相。MAUTAMIDEISA-70为油相，按15-20∶50-80高速乳化成油包水型免疫原。
3.根据权利要求1或2所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的均浆方式为用1∶1000-1500稀释的金碘水溶液将禽卵洗净、凉干，于超净工作台分离蛋黄，分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟。
4.根据权利要求1或2所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的过滤纯化过程包括(1)将上述制备的卵黄液与溶剂(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速搅拌(8000-20000转/分，1-4分钟)后离心10000克10-15分钟，如此重复2-4次，保留水相弃油相和沉淀；(2)将上述制备的卵黄液中加入海藻酸钠使其终浓度为0.14-0.2％并调PH为6.0-7.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2-4分钟)，离心10000克10-15分钟，140-150目铜网过滤、弃沉淀。用饱和硫酸铵溶液与滤液混合制成50-60％的硫酸铵溶液并调PH至7.0-8.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-15分钟弃上清，沉淀用20-40％硫酸铵溶解并调PH7.0-8.0高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-20分钟，如此重复二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
5.根据权利要求3所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的过滤纯化过程包括(1)将上述制备的卵黄液与溶剂(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速搅拌(8000-20000转/分，1-4分钟)后离心10000克10-15分钟，如此重复2-4次，保留水相弃油相和沉淀；(2)将上述制备的卵黄液中加入海藻酸钠使其终浓度为0.14-0.2％并调PH为6.0-7.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2-4分钟)，离心10000克10-15分钟，140-150目铜网过滤、弃沉淀。用饱和硫酸铵溶液与滤液混合制成50-60％的硫酸铵溶液并调PH至7.0-8.0，高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-15分钟弃上清，沉淀用20-40％硫酸铵溶解并调PH7.0-8.0高速搅拌(8000-20000转/分，2分钟)后离心10000克10-20分钟，如此重复二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
6.根据权利要求1或2或5所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的SARS卵黄粉的制备工艺过程包括经测定卵黄和血清的中和抗体效价256倍以上为合格蛋，用1∶1000稀释的金碘水溶液将禽蛋洗净、凉干，于超净工作台分离卵黄。分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟，放于-10℃以下冰柜备用。将1∶2-4比例稀释的卵黄液10000克4℃离心30-40分钟弃沉淀，140-150目铜网过滤，滤液浓缩2-4倍。喷雾干燥入口温度120-160℃、出口温度55-85℃。
7.根据权利要求3所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的SARS卵黄粉的制备工艺过程包括经测定卵黄和血清的中和抗体效价256倍以上为合格蛋，用1∶1000稀释的金碘水溶液将禽蛋洗净、凉干，于超净工作台分离卵黄。分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟，放于-10℃以下冰柜备用。将1∶2-4比例稀释的卵黄液10000克4℃离心30-40分钟弃沉淀，140-150目铜网过滤，滤液浓缩2-4倍。喷雾干燥入口温度120-160℃、出口温度55-85℃。
8.根据权利要求4所述的抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，其特征是所述的SARS卵黄粉的制备工艺过程包括经测定卵黄和血清的中和抗体效价256倍以上为合格蛋，用1∶1000稀释的金碘水溶液将禽蛋洗净、凉干，于超净工作台分离卵黄。分离的蛋黄与双蒸水按1∶2-4比例混合，放入捣碎机中以8000-20000/分的转速搅拌2-4分钟，放于-10℃以下冰柜备用。将1∶2-4比例稀释的卵黄液10000克4℃离心30-40分钟弃沉淀，140-150目铜网过滤，滤液浓缩2-4倍。喷雾干燥入口温度120-160℃、出口温度55-85℃。
全文摘要
抗非典型肺炎卵黄抗体的制作方法，本发明涉及一种抗非典的生物药品的制作方法。我们发现有几种高免动物的IgG和SARS病毒的序列相似性较高，基因组结构非常相似。但从高免动物的血清或初乳中分离IgG，产量低，成本高。本产品的制作方法包括制作疫苗原，抗体制备、卵黄匀浆、稀释、低温过夜、过滤纯化，制粉，其中所述的抗体的制备方法是选择100－140日龄SPF禽，首次免疫1.5－3.5ml，胸部肌肉注射2－4个部位，间隔2－4周重复加强免疫，每周采血监测抗体效价，二免1－2周后收集经抗体检验合格的禽卵，每周采血检测抗体，中和抗体效价不低于1∶256为合格，三免时间依据抗体监测情况决定，注射量与二免相同。本方法用于制作抗SARS生物药品。
文档编号A61P11/00GK1546526SQ20031010773
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者孔宪刚, 王治国, 付朝阳, 王笑梅, 高洪雷, 周琦 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所