专利名称：一种肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及蛋白质多肽，具体涉及一种可与肝癌肿瘤血管特异性结合的多肽。
背景技术：
我国是全球肝癌高发区，据统计，每年约20万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的一半左右。现代医学对肝癌进行科学研究已百余年，虽然取得了不少成绩，但肝癌人群的总体5年生存率至今仍只有3％左右，而提高肝癌预后的最大障碍是其极高的侵袭和转移率，即使是根治性手术切除，仍有50％的病人会在5年内出现转移或复发。因此，深入研究肝癌转移复发的内在机制及其相应的干预治疗，已成为进一步改善肝癌预后的关键。已有研究表明，肿瘤血管形成在肝癌生长、转移、复发的各个环节均产生重要作用。近年来，在肿瘤血管干预治疗上虽有进展，但仍缺乏特异而有效的治疗手段。迄今为止，能特异性针对肝癌肿瘤血管的靶向分子在国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质多肽，特别是能特异针对肝癌肿瘤血管的靶向多肽。
本发明采用噬菌体随机肽库体内展示技术及激光显微切割技术在高转移人肝癌裸鼠模型上筛选能与肝癌肿瘤血管内皮细胞特异结合的靶向多肽，得到特异性高的7肽，具有序列“LPNISKP”，命名为“LCI-X7肽”，经体内及体外实验证实，所述7肽与肝癌肿瘤血管内皮结合的特异性高。
经原位种植人肝癌裸鼠体内实验及组织标本体外实验鉴定证实，本发明LCI-X7肽具有以下特点1.LCI-X7肽可与原位种植人肝癌裸鼠的肝脏原位肿瘤血管高度特异结合，而对乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌等肿瘤血管无特异性结合作用；2.LCI-X7肽可与原位种植人肝癌裸鼠的肝外转移灶肿瘤血管特异结合，从而实现了对肝癌转移灶的示踪；3.LCI-X7肽可与大部分临床病人肝癌组织中的肿瘤血管特异性结合，显示在人体肝癌肿瘤血管表面也存在有LCI-X7肽的同源性受体。
结果表明，本发明LCI-X7肽可特异性结合于原位种植人肝癌裸鼠的肝脏原位肿瘤及转移灶的肿瘤血管上，并可与大部分人体肝癌肿瘤血管特异结合，LCI-X7肽为肝癌转移复发诊断、靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔地应用前景。
图1是LCI-X7肽结合特异性鉴定结果其中A裸鼠原位肝癌抗CD31免疫荧光染色，绿色荧光为原位肝癌组织，红色荧光为抗D31染色显示的肿瘤血管；B黄色荧光标记的LCI-X7肽特异结合于原位肝癌肿瘤血管；CLCI-X7肽特异结合于肝癌肺转移灶的肿瘤血管；DLCI-X7肽特异结合于人肝癌肿瘤血管，荧光显微镜，200×。
具体实施例方式
实施例1本发明通过下述方法和步骤筛选得到LCI-X7肽。
1.建立人肝癌原位种植裸鼠模型采用高转移人肝癌细胞系MHCC97-H(World J Gastroenterol2001，7630-636)1×107在雄性BALB/c nu/nu裸鼠(购自中科院药物所)皮下注射成瘤，在皮下瘤长到1～1.5cm后取出皮下瘤，切割成1mm×1mm×1mm，原位种植于裸鼠肝脏，待肿瘤生长至1cm左右；2.随机噬菌体文库体内筛选小鼠尾静脉注入f1噬菌体1012Pfu，5min后注入噬菌体肽库，5min后开胸，活体心脏灌注20ml PBS其中含肝素抗凝血，门静脉及肝下下腔静脉插管补充灌注20ml PBS，收获肿瘤组织及对照组织，匀浆并反复洗涤取下的组织，复苏组织中结合的噬菌体并测定滴度，扩增、纯化肿瘤组织中复苏的噬菌体，重复以上体内筛选步骤10次，得到100个左右特异的噬菌体克隆。
本发明所述随机噬菌体7肽库购自PhD7，NEB公司，f1噬菌体购自中科院上海细胞所。
3、融合基因测序分别扩增上述获得的噬菌体克隆，抽提噬菌体DNA，测序(上海申友公司)，获噬菌体中展示的7肽序列，其中LCI-X7肽(序列“LPNISKP”)出现频度为96％。
4、人工多肽合成及标记人工合成出现频度最高的LCI-X7肽及其对照肽在氨基端标记DNS黄色荧光。
所述人工合成LCI-X7肽由上海生工公司按已知方法合成，所述对照肽为氨基酸组分相同但随机组合的7肽。
5.特异性鉴定1)体内结合实验将上述“LCI-X7噬菌体”(展示LCI-X7的噬菌体)及LCI-X7肽分别注入人肝癌原位种植裸鼠体内以及或荷乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤等对照裸鼠，3min后心脏灌洗，收获肿瘤组织及对照组织，冰冻切片后荧光显微镜下观察DNS黄色荧光分布情况和抗噬菌体免疫组化鉴定结合特异性。结果显示LCI-X7肽可特异性结合于原位种植人肝癌裸鼠的肝脏原位肿瘤及转移灶的肿瘤血管上，而对乳腺癌、恶性黑色素瘤和肺癌等肿瘤血管无特异性结合作用；2)体外及体内结合抑制实验将LCI-X7噬菌体及LCI-X7肽依次注射入荷瘤裸鼠体内，观察两者是否有竞争抑制作用。结果显示，LCI-X7噬菌体及LCI-X7肽可竞争结合肝癌肿瘤血管上的结合位点，其与肝癌肿瘤血管的结合具有高度特异性；3)人肝癌肿瘤血管结合实验取人肝癌肿瘤组织及癌旁正常肝脏组织冰冻切片，抗噬菌体免疫组化或LCI-X7肽免疫荧光实验鉴定其结合特异性。结果显示LCI-X7肽可与大部分人肝癌肿瘤血管特异结合，结合率达85％，与癌旁正常肝组织无特异性结合作用。
表1是不同肿瘤裸鼠模型“LCI-X7肽”结合鉴定(免疫荧光染色)结果。表2是临床病人肝癌组织标本“LCI-X7肽”结合鉴定(免疫荧光染色)结果。
表1恶性黑肺腺 乳腺 结肠肿瘤肝细胞癌色素瘤 癌 癌 腺癌SMMC MHCC MHCCBcap Ls-17细胞系 D35 D20LM6A375 A5497721 97-H 97-L-37 4-T祼鼠数888 88 8 888 8阳性率 8/8 7/8 6/8 8/8 7/8 8/8 0/8 0/8 0/8 3/8表2组织切片肝癌癌旁肝No40 40阳性率 82.5％ 22.5％
权利要求
1.一种肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽，其特征是具有序列“LPNISKP”的7肽，命名为“LCI-X7肽，能与肝癌肿瘤血管内皮细胞特异结合。
2.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽，其特征是通过下述方法和步骤制备，采用噬菌体随机肽库体内展示技术和激光显微切割技术在高转移人肝癌裸鼠模型上筛选出与肝癌肿瘤血管内皮细胞特异结合的靶向多肽，经基因测序及原位种植人肝癌裸鼠体内实验及组织标本体外实验鉴定后，得与肝癌肿瘤血管内皮结合的特异性高的7肽。
3.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽，其特征是所述LCI-X7肽在氨基端标记DNS黄色荧光。
4.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽，其特征是所述LCI-X7肽对乳腺癌、恶性黑色素瘤和肺癌肿瘤血管无特异性结合。
5.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽，其特征是所述LCI-X7肽与人肝癌癌旁正常肝组织无特异性结合。
6.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽在制备诊断肝癌转移复发示踪制剂中的用途。、
7.权利要求1的肝癌肿瘤血管特异性靶向多肽在制备靶向治疗肝癌药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及蛋白质多肽生物技术领域，具体涉及一种可与肝癌肿瘤血管特异性结合的多肽。本发明采用噬菌体随机肽库体内展示技术和激光显微切割技术在高转移人肝癌裸鼠模型上筛选出与肝癌肿瘤血管内皮细胞特异结合的靶向多肽LCI－X
文档编号A61P1/16GK1552727SQ20031012261
公开日2004年12月8日 申请日期2003年12月19日 优先权日2003年12月19日
发明者徐泱, 孙惠川, 汤钊猷, 钦伦秀, 刘银坤, 徐 泱 申请人:复旦大学附属中山医院