专利名称：生物材料及其用途的制作方法
该要求保护的发明涉及鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法。
当生物学组织损伤时，损伤和相关的炎症反应都可引起细胞死亡。当细胞死亡发生时，合成新组织代替死亡的或垂死的细胞。新组织的合成可分成两种类型，特化细胞的再生和结缔组织的增加。在一些病理情况下，结缔组织的增加在愈合过程中占优势，导致形成纤维变性组织。在纤维变性中，新组织修复组织中的任何结构缺损，但是由结缔组织和结缔组织细胞取代特化细胞损害了其自身的功能。
纤维变性是否发生，或者实际纤维变性的程度，受到各种因素的影响，包括待愈合的损伤的性质，严重性和位置。纤维变性最常见的是皮肤表面的瘢痕，除了大面积的瘢痕形成外，它是相对不令人讨厌的。然而，纤维变性也可在诸如肝脏，肺和肾的内部器官的组织中发生。在大多数情况下，最严重的是在这些区域的纤维变性，因为该器官的特化活性受到损害。在最极端的情况中，由于该损害可出现器官衰竭或死亡。
纤维样变性在疾病状态中的重要性的一个例子可通过在糖尿病，即在全世界现在达到流行比例的一种疾病中出现的肾纤维变性(糖尿病性肾病)来证实。
糖尿病的发病率在最近几年经历了一个全球性的增长。特别是它归因于2型糖尿病(晚期发作(late-onset)的糖尿病)的显著增长(Silink M(2002)，Horm.Res.57(Suppl 1)第1-5页)。糖尿病与许多继发型并发症，特别是微血管相关性并发症密切联系。这些并发症，包括纤维变性情况的肾病，通常在糖尿病开始后的许多年形成。
糖尿病性肾病的特征在于细胞外基质蛋白质在肾小球膜和肾小球基底膜中和在肾管小间隙中细胞外基质蛋白的过多沉积。
在确定糖尿病性肾病(DN)易感性中认为遗传背景是重要的(Quinn M等，(1996)Diabetologica 39第940-945页)，但是据信关键性起动因素是组织暴露于慢性高血糖中(UKPDS Group，(1998)Lancet 352，第837-853页)。肾病的流行随地理位置，糖尿病类型，和诊断后时间的长度而变化。尽管有影响因素，但是预期糖尿病性肾病的流行在前十年中会增长(Bagust A等，(2002)Diabetes Med 19(Suppl 4)第1-5页)。糖尿病性肾病是末期肾病的主要原因(11)，且需要新的治疗方法来限制其发展。
糖尿病性肾病的病理学在1和2型糖尿病中相似。两种类型的糖尿病都与肾小球中存在的相似超微结构改变相关联(Osterby R，(1992)Diabetologica35第803-812页)。肾小球基膜厚度增加，且肾小球膜细胞外基质扩张。据认为是糖尿病性肾病中肾功能下降的主要原因是肾小球膜扩张(Steffes M等(1989)Diabetes 38第1077-1081页)。由于肾小球膜基质扩张，影响肾小球毛细血管，减少了可用于过滤的表面并变窄或阻塞管腔。除了肾小球硬化症外，小管间质纤维变性也在糖尿病性肾病中发生。肾功能的进行性丧失与其它肾病中出现的进行性间隙纤维变性相关联(Risdon R等，(1968)Lancet2 7564第363-366页)。
纤维变性疾病通常与生长因子和激素的不平衡相关联，后者又接着影响蛋白质表达的产量。异常蛋白质表达接着又导致纤维变性形成。例如，纤维变性通常受到纤维变性组织中存在的转化生长因子-β的增加的影响。
纤维变性是无有效疗法的最大疾病群体之一，部分原因是这些疾病的机制受到各种因素的影响且准确的细胞机制未被阐明。因此，对该机制或可提供靶的分子靶的特性缺乏了解，而围绕该靶可作为抗纤维变性疗法的基础。
对于糖尿病性肾病，研究表明葡萄糖可至少部分通过转化生长因子-β(TGF-β)的作用诱导基质合成(Ziyadeh F等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA97第8015-8020页)。
然而，TGF-β具有许多生理学作用，包括涉及免疫和上皮增生(McCartney-Francis N等，(1998)Int.Rev.Immunol.16第553-580页)。这些变化的生理学作用意味着TGF-β不可能是临床上有利的靶。抑制TGF-β的作用可能对生物体具有多种影响，引起不需要的和潜在的严重副作用。
转化生长因子-β通过直接诱导胶原蛋白和基质合成引起纤维变性。另外，TGF-β也能诱导参与和/或影响该途径的其它分子的表达引起纤维变性。一个该蛋白是结缔组织生长因子(CTGF)，它诱导增生，胶原蛋白合成和间充质细胞的趋化性(Moussad E等，(2000)Molec Genet Metab.71第276-292页)。CTGF(CCN2)是具有多个结构域的38kDa的分泌蛋白质，它由立即早期基因编码且是CCN蛋白质家族的一个成员(Bork等，(1993)Febs Lett.327第125-130页；Perbal等，(2001)Mol.Pathol.54第57-79页)。然而，其发挥功能的分子机制尚未完全阐明。CTGF中存在多个结构域表明它与多个其它因子相互作用。已表明CTGF通过其von Willebrand型C结构域直接结合BMP4和TGF-β，导致抑制BMP和增强TGF-β信号传导(Abreu等，(2002)Nat.Cell.Biol.4第599-604页)。
已表明CTGF结合整联蛋白(Babic等，(1999)Mol.Cell Biol.19第3811-3815页)且有可能该相互作用在介导CTGF诱导的一些细胞现象中是重要的。
CTGF在包括糖尿病性肾病的各种纤维变性疾病中过量表达(Wahab N等，(2001)Biochem J359第77-87页)。事实上，已表明CTGF表达水平增加与糖尿病性肾病的严重性和进行速度增加相关联(Ito Y等，(1998)KidneyInt.53第853-886页)。
因此，CTGF可以是潜在有用的纤维变性反应的分子指标。尚未证实CTGF直接诱导体内肾纤维变性，但是，当与TGF-β一起皮下注射时，在大鼠中诱导持续皮肤纤维化(Mori T等(1999)J.Cell.Physiol.181第153-159页)。
在正常成纤维细胞中，TGF-β至少部分通过CTGF启动子中的元件直接诱导CTGF表达(Holmes A.等，(2001)J.Biol.Chem.276第10594-10601页)。事实上，据认为CTGF基因表达的控制主要在转录水平上(综述见8)。
一般来说，对于肾中TGF-β信号传导的调节或TGF-β-诱导的CTGF基因表达所知甚少。然而，采用其它细胞类型的研究鉴定了SMADs在TGF-β-诱导的靶基因表达中的重要，一般性作用。当前的观点是SMADs通过作为转录共调节物起作用以招募转录因子形成活性转录复合物来促进基因表达(Roberts A(1999)Microbes Infect 1第1265-1273页和Wrana J(2000)Sci STKE23 RE1)。招募的转录因子依赖于目的基因和细胞类型而变化。换句话说，TGF-β的生物学效果的多样性和特异性部分是由于一般性TGF-β信号传导途径与其它途径的相互作用，其性质依赖于目的细胞类型或靶基因(MulderK(2000)Growth Factor Rev 11第23-35页)。
TGF-β经过Smad信号传导途径产生其细胞效应。Smad途径提供了TGF-β受体下游的主要信号转导途径(Massague等，(2000)Cell 103第295-309页)。结合TGF-β时，TGF-β受体二聚化且自身磷酸化。它再磷酸化Smad2和Smad3(Itoh等，(2000)Eur J.Biochem 267第6954-6967页)。然后Smad2和Smad3与Smad4形成复合物，转运进细胞核，在此它们与其它转录因子共同作用以调节在其启动子中含有Smad结合元件(SBE)的许多TGF-β-应答基因的转录。一个该诱导基因是Smad7。
Smad7蛋白与细胞核中的一个或多个E3-遍在蛋白连接酶，Smurf1和Smurf2相互作用。Smad 7-Smurf复合物转运到细胞质膜，在此Smurf诱导遍在蛋白化且降解TGF-β受体(Kavsak等，(2000)Mol Cell 6第1365-1375页)。TGF-β受体的降解防止Smad2和Smad3进一步磷酸化。因此，Smad7提供了限制TGF-β作用的负反馈应答。
据报道Smad7基因的表达受到与邻近启动子区GC框结合的转录因子，即TIEG的抑制(Johnsen等，(2002)Oncogene 21第5783-5790页)。
TIEG1和2是与Sp1转录因子家族相关的有效转录阻遏物。其基因编码锌指Kruppel-样蛋白，其过量表达模仿不同细胞类型中的TGF-β作用(Cook等，(1998)J.Biol.Chem.)。
在形成本发明的过程中，本发明人证实了CTGF通过依赖于与CTGF反应增加TIEG生产而降低Smad7的可用性来增强TGF-β信号传导途径。
因此，在本发明的第一个方面，提供了一种鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法，包括步骤(a)提供能够表达TIEG和/或Smad-7的细胞类型(b)提供试验化合物(c)提供一定量的CTGF或其功能等价物(d)将该细胞类型与试验化合物接触(e)随后或同时将该细胞类型与CTGF或其功能等价物接触(f)检测和/或测量Smad-7和/或TIEG的表达(g)比较存在试验化合物时表达的Smad-7和/或TIEG的量与不存在试验化合物时检测和/或测量产生的Smad-7和/或TIEG的量(h)根据其引起Smad-7表达无改变或增加和/或TIEG表达无改变或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。
对于“功能等价物”，我们是指在一种或多种下列活性，诱导TIEG表达和/或抑制Smad-7表达上具有与CTGF基本上相同的效果的化合物。使用实施例1提供的检测TIEG和Smad-7表达的方法可容易地证实这一点。
任选该方法还包含分离在根据本发明的第一个方面的方法中能够引起Smad-7表达无改变或增加和/或TIEG表达无改变或减少的试验化合物的步骤。然后该分离的化合物任选可配制成还包含药用上可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂的组合物。
优选的是，该化合物直接影响CTGF与TIEG之间的相互作用。换句话说，该化合物与CTGF和/或TIEG相互作用以减少和/或防止CTGF对TIEG和/或Smad-7表达的影响。
作为选择，该化合物可间接影响CTGF与TIEG之间的相互作用。换句话说，该化合物与至少一种其它化合物相互作用，后者又与CTGF或TIEG相互作用以减少和/或防止CTGF对TIEG和/或Smad-7表达的影响。
在本发明的第二个方面，提供了一种化合物在制备用于减少和/或防止纤维变性的药物中的用途，其特征在于该化合物减少和/或防止CTGF对Smad 7表达的抑制和/或减少和/或防止诱导TIEG表达。
优选的是通过本发明第一个方面的方法鉴定和/或制备该化合物。
合适的是，该化合物是选自多肽，抗体分子和反义多核苷酸的至少一种。优选的是，该化合物是抗体分子。
术语“抗体分子”用于指任何一种抗体，抗体片断，或抗体衍生物。它打算包含野生型抗体，合成抗体，重组抗体或抗体杂合体，例如，但不限于，通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示产生的单链修饰的抗体分子，或在本领域的技术人员已知的免疫测定方式中能够与抗原结合的其它免疫活性分子。
术语“抗体衍生物”是指在本领域的技术人员已知的免疫测定方式中能够与抗原结合的任何修饰的抗体分子，例如抗体的片断(例如Fab或Fv片断)，或者通过添加一个或多个氨基酸或其它分子以帮助将抗体偶连到另一肽或多肽，大型载体蛋白或固相支持物上(例如，氨基酸酪氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸及其衍生物，NH2-乙酰基团或COOH-末端氨基基团，等等)进行修饰的修饰抗体分子。
对于“反义寡核苷酸”，我们是指能够与互补核酸序列特异性结合的单链核酸。通过与合适的靶序列结合，形成RNA-RNA，DNA-DNA，或RNA-DNA双链。这些核酸通常称为“反义”，因为它们与该基因的有义或编码链互补。最近，证实了寡核苷酸与DNA双链结合时形成三螺旋是可能的。发现了寡核苷酸可识别DNA双螺旋大沟中的序列。从而形成三螺旋。这表明可以合成通过识别大沟氢结合位点特异性结合双链DNA的序列特异性分子。
通过与靶核酸结合，上述寡核苷酸可抑制靶核酸的功能。这可能是例如，抑制转录，加工，poly(A)添加，复制，翻译，或者促进细胞的抑制机制，例如促进RNA降解的结果。
反义寡核苷酸可在实验室制备，然后通过例如，显微注射或从细胞培养基吸收进细胞中导入细胞，或者可用携带反义基因的质粒或逆转录病毒或其它载体转染后在细胞中表达它们。
在本发明的第三个方面，提供了本发明第二个方面的化合物在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
优选的是，该化合物用于制备治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物。
合适的是，该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾衰竭，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemic sclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成(keloid scar formation)和癌症相关性纤维变性中的一种。
优选的是，该疾病是糖尿病性肾病。
在本发明的第四个方面，提供了一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的根据本发明第一个方面的方法鉴定和/或制备的化合物。
合适的是，该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种。
优选的是，该疾病是糖尿病性肾病。
实施本发明的某些优选方面的例子现在将参照下面附图进行描述，其中-
图1-CTGF抑制HMC中的Smad 7表达血清饥饿的人肾小球膜细胞(HMC)与rCTGF/V5融合蛋白接触不同的时间，之后制备细胞裂解物(lysates)且通过Western印迹分析Smad 7和β-肌动蛋白水平。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
图2-CTGF增强HMC中Smad 2和Smad 3的磷酸化和核转运血清饥饿的HMC与TGF-β，rCTGF/V5融合蛋白，或两种生长因子接触2小时，之后使用磷酸丝氨酸亲和珠免疫沉淀(IP)核提取物(30μg)。然后使用Smad 2和Smad 3抗体对结合的蛋白质进行SDS-PAGE和Western印迹(WB)。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
图3-CTGF刺激HMC中的TIEG水平血清饥饿的HMC与rCTGF/V5融合蛋白接触不同的时间，之后制备细胞溶胞产物且通过Western印迹分析TIEG和β-肌动蛋白水平。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
图4-TIEG介导Smad 7表达水平的CTGF-依赖型下调血清饥饿的HMC暴露于图中所示的条件下。24小时后，制备细胞溶胞产物，且通过Western印迹分析TIEG，Smad 7，和β-肌动蛋白水平。显示了进行的3个独立实验的代表性印迹(每个实验每种条件重复3份培养物)。
图5-CTGF增强HMC中SBE-luc报告基因的TGF-β-诱导的转录活性用SBE-Luc转染细胞。转染6小时后，细胞在含有所示处理的无血清培养基中再培养48小时。测量萤光素酶活性并对β-半乳糖苷酶活性归一化(normalised)。结果(平均值±SEM)代表了三个独立的实验，每个实验每种条件重复4份。
图6-Smad7的CTGF-依赖型抑制与TGF-β-应答基因的上调直接相关血清饥饿的细胞在图中所示的条件下培养48小时。提取RNA并用于对Smad 7，P15INK4，PAI-1，Col III和GAPDH的半定量RT-PCR分析。
(A)实验条件和PCR产物的代表性琼脂糖凝胶分析。
(B)通过光密度测定法定量PCR产物。各基因的表达显示为与GAPDH表达的比率。
进行了3个独立的实验(每个实验每种条件重复4份培养物)。
实施例实施例1-CTGF-TIEG-Smad 7相互作用的鉴定材料和方法细胞培养物，抗体和试剂原代正常成人肾小球膜细胞(HMC)(CC-2259，lot 3F1510)(Biowhittaker，Wokingham，Berkshire，UK)按以前所述在培养基中维持(Wahab N等，(1996)Biochem J.316，第985-992页)。
抗Smad 2，Smad 3和Smad 7的抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，(Autogen Bioclear，Calne，Wilts.，UK)。TGF-β诱导型早期基因(TIEG)抗体由Dr.Steven Johnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)惠赠。重组CTGF在转化的HMC中表达且按以前的报道使用Talon金属亲和树脂从培养基中纯化(Wahab等，(2001)Biochem J.359第77-87页)。TGF-β从R&DSystems(Abingdon，Oxfordshire，U.K.)购买。设计针对CTGF的硫代磷酸反义(TGG GCA GAC GAA CG)和对照寡核苷酸(ACC GAC CGA CGT GT)和针对TIEG的反义(TGT GTC TGG ACA GTT CAT)和对照寡核苷酸(ACT ACTACA CTA GAC TAC)并由Biognostik GmbH(Gttingen，Germany)制备。SBE4-Luc报告基因由Dr.B.Vogelstein惠赠(Zawel等，(1998)Mol Cell 1第611-617页)。
表1-引物序列
Western印迹细胞在还原SDS-PAGE上样缓冲液中裂解且立即从平板上刮下。细胞溶胞产物超声处理10秒以剪切DNA。将样品煮沸5分钟并通过SDS-PAGE在4-12％梯度凝胶上分辨。使用BioRad转移装置将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯滤膜(Immobilin-P，Millipore，Bedford，UK)上。印迹在含有1xTBS，0.1％Tween-20且含5％(w/v)脱脂奶粉的封闭缓冲液中温育1小时。
通过在抗体稀释缓冲液(1xTBS，0.1％Tween-20且含5％BSA)中适当稀释的第一抗体中4℃下温育印迹过夜进行免疫检测。然后用洗涤缓冲液(1xTBS，0.1％Tween-20)洗涤印迹3次并用第二辣根过氧化物酶(HRP)-偶连的抗体室温下温育1小时。结合的抗体使用增强的化学发光试剂Luminol(Autogen Bioclear UK Ltd，Wiltshire，UK)显色。预染的分子量标准(Amersham International PLC，Amersham，UK)用于监测蛋白质迁移。
核成份制备细胞在冰冷的PBS中刮下，以500xg离心10分钟回收并重悬于500μl缓冲液A[10mM Hepes，pH7.4，1.5mM MgCl2，10mM NaCl，1x蛋白酶抑制剂混合物(1mM EDTA，1mM EGTA，0.2mM TLCK，1mM N-乙基马来酰亚胺，0.1mM TPCK，和2mM PMSF，Sigma)，1mM NaF，1mM Na3VO4]中。
在冰上温育20分钟后，加入Nonidet P40至终浓度为0.6％(v/v)并剧烈涡旋混合10秒。以12000xg离心5分钟在4℃下沉淀核。核沉淀用缓冲液A洗涤一次并离心收集。
然后将沉淀重悬于500μl缓冲液B(10mM Hepes，pH7.4，1.5mMMgCl2，450mM NaCl，1x蛋白酶抑制剂混合物，1mM NaF，1mM Na3VO4，20％(v/v)甘油)中并在4℃下涡旋混合15分钟。溶胞产物在4℃下以12000xg离心5分钟并将含有核蛋白的上清转移进干净小瓶中。通过Bradford试验测量蛋白质浓度。提取物贮存于-70℃备用。
使用反义寡核苷酸TIEG和CTGF反义寡核苷酸(2μM)或CG-匹配的随机序列寡核苷酸(阴性对照)在任何其它处理前30分钟直接加入培养物中(Wahab等，(2002)J AmSoc Nephrol.13第2437-2445页)。
瞬时转染和报告基因试验将SBE4-luc报告基因构建体通过电穿孔以15μg的浓度与5μg pSV-β-半乳糖苷酶对照载体(Promega，Southampton，UK)一起使用以前所述的条件转染进25×106个转化的人肾小球膜细胞(THMC)中(Wahab等，(2001)Biochem J.359第77-87页)。
转染6小时后，用PBS洗涤细胞3次，然后在含有不同处理条件的无血清培养基中再培养48小时。然后在报告裂解缓冲液(Reporter Lysis Buffer)(RLB)中裂解细胞，它允许使用Promega试剂盒进行萤光素酶和β-半乳糖苷酶试验。萤光素酶活性对β-半乳糖苷酶活性正态化以校正任何转染效率的差异。
RNA提取和RT-PCR分析使用RNAzol B方法(AMS Biotechnology(UK)Ltd.，Oxfordshire，UK)从6×106个肾小球膜细胞提取总RNA。将RNA溶于DEPC-dH20中，定量并贮存于-70℃。来自各样品的等量总RNA(2μg)使用SuperScript II RNase H+逆转录酶(Gibco BRL，Paisley，Scotland，UK)和随机引物逆转录成cDNAs。
等量(0.5μl)的逆转录反应物(20μl)在含有10μl的10xPCR缓冲液，16μldNTPs(各1.25mM)，2mM MgCl2，0.5μM各特定引物和1.25U AmplitaqDNA聚合酶(Gibco BRL)的100μl体积中进行PCR扩增。
在94℃下变性5分钟开始扩增，接着对所有基因进行27个PCR循环，使用24个PCR循环的管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)除外。每个循环由94℃下60秒，55℃下60秒和72℃下60秒组成。最后在72℃下延伸10分钟。共扩增GAPDH以允许半定量(semi-quantitative)比较PCR产物并证实等量使用总RNAs。
用于扩增的逆转录反应的量(0.5μl)选择为在固定数目的扩增循环后所研究的全部基因的PCR产物为非饱和。从公开的人基因的序列设计引物序列且在表1中列出。
扩增后，10μl各PCR反应产物通过含溴化乙锭(0.5μg/ml)的1.2％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳。凝胶使用Epson GT-8000扫描仪和Adobe PhotoShop软件扫描。结果对GAPDH带的强度正态化。
统计学分析使用Student′s无配对(unpaired)t-检验比较结果。p值为0.05或更小认定为差异显著。
结果CTGF对HMC中Smads表达的影响为了鉴定TGF-β与CTGF之间关系的分子基础，研究了CTGF对Smad信号传导途径的影响。血清饥饿的HMC与20-40ng/ml重组CTGF/V5融合蛋白接触达24小时。图1显示了抑制型Smad7的表达在加入CTGF后30-60分钟内减少到几乎不可检测的水平。
通过在存在或没有CTGF，TGF-β，或者在CTGF和TGF-β两者都存在的条件下培养血清饥饿的HMC 2小时研究CTGF对受体调节的Smads(Smad 2和Smad 3)活化的影响。
然后裂解细胞并制备核成份蛋白。使用抗磷酸丝氨酸亲和珠(Sigma)免疫沉淀等量的核蛋白成份。使用抗-Smad 2和抗-Smad 3抗体对免疫沉淀的蛋白质进行Western印迹。图2显示了TGF-β增加两种Smads的磷酸化和核转运(泳道2)。CTGF也增加Smad 2和Smad 3的磷酸化和核转运(泳道3)。CTGF和TGF-β两者一起以协同的方式增加两种Smads的磷酸化和核转运(泳道4)。因此图2表明Smad 7表达的CTGF-依赖型减少导致增强Smad 2和3的活化。
CTGF调节TIEG然后研究了CTGF对TIEG表达水平的影响。图3显示了CTGF接触引起TIEG的表达水平迅速升高。
通过用TIEG反义和对照寡核苷酸处理细胞研究了TIEG直接介导Smad 7水平的CTGF-依赖型下调的能力。图4显示了HMC中的TIEG和Smad 7蛋白的组成型水平都低(泳道1)。
用CTGF培养细胞24小时显著提高TIEG水平而Smad 7降低到几乎不可检测的水平(泳道2)。在TIEG反义寡核苷酸存在时该影响完全消除(泳道5)，但是对照寡核苷酸不能消除该影响(泳道6)。
用TGF-β单独培养细胞相同的时间导致TIEG和Smad 7都适度增加(泳道3)。然而，在CTGF反义寡核苷酸存在的条件下用TGF-β培养细胞完全消除对TIEG的适度诱导且导致Smad 7的诱导增加(泳道7)。在对照反义寡核苷酸存在的条件下没有观察到这一点(泳道8)且与TGF-β-诱导的CTGF导致观察到的TIEG表达水平适度增加一致。
通过用TIEG反义和对照反义寡核苷酸处理细胞也获得了相似的结果(泳道9和10)。用TGF-β和CTGF两者培养细胞(泳道4)显著增加TIEG的表达水平而降低Smad7的表达水平。这些结果清楚地表明TIEG介导Smad7表达的CTGF-依赖型下调。
CTGF增强TGF-β的转录活性使用含有回文Smad-结合元件的TGF-b-调节的SBE-4报道构建体研究了CTGF对TGF-β转录活性的影响。研究了在不同条件下培养48小时的HMC中驱动萤光素酶转录的SBE启动子的相对活性。图5概括了三个独立实验的结果。
单独用CTGF处理导致该启动子的基础活性提高2.4-倍，而TGFβ导致增加7-倍。
在CTGF或TIEG反义寡核苷酸存在的条件下TGF-β-增强的活性显著下降(3-2倍)，但是用对照寡核苷酸不能。当TGF-β和CTGF一起存在时反义寡核苷酸也显著降低报告基因活性，但是对照寡核苷酸不能。
还研究了与TGF-β-应答基因，p15INK4，PAI-1，和胶原蛋白III的上调相关的Smad 7的CTGF-依赖型下调。在CTGF，TGF-β，CTGF+TGF-β，CTGF+TIEG反义和对照寡核苷酸和TGF-β+TGF反义和对照寡核苷酸或TIEG反义和对照寡核苷酸的不同组合存在的条件下培养血清饥饿的细胞48小时。提取RNA并用于半定量RT-PCR分析。
图6A和B证实了CTGF导致Smad 7表达水平降低60％。然而，CTGF对PAI-1或者胶原蛋白III基因转录没有明显的影响。相反，在相同条件下p15表达水平似乎增强(5-倍)。
TGF-β的存在导致诱导所有4个基因的转录，因为它们在其启动子中含有一个或多个SBE。CTGF与TGF-β一起存在导致Smad 7降低(55％)和p15，PAI-1和胶原蛋白III转录的最大诱导。在CTGF或TIEG反义寡核苷酸存在的条件下这些基因的TGF-β-依赖型转录增加被抑制30-50％，而对照寡核苷酸不能。这些结果与TGF-β诱导内源性CTGF一致。
在生理学条件下，TGF-β活性受到Smad 7提供的信号传导途径的负反馈循环的限制。相反，在病理条件下，如果CTGF表达水平升高，通过以TIEG抑制Smad 7表达，CTGF抑制该负反馈循环，使得TGF-9信号传导途径继续活化。
实施例2-用于鉴定抑制CTGF诱导的纤维变性的化合物的筛选方法通过在用CTGF处理的HMC中试验各化合物抑制，例如，TIEG诱导的能力实施筛选具有纤维变性抑制特性的化合物。
使用含有或不含潜在抑制剂预培养30分钟的人肾小球膜细胞(HMC)实施该筛选方法。然后在存在或没有潜在抑制剂的条件下用CTGF-V5融合蛋白(40ng/ml)刺激这些细胞2小时。用冷PBS洗涤细胞层后，在RIPA缓冲液中裂解细胞并通过ELISA测定溶胞产物的TIEG。
对于ELISA试验(Voller A等，(1976)，in Manual of Clinical Immunology(Rose，N和Fishman H，编)第506-512页，American Society of Microbiology，Washington，DC.)，用溶胞产物或提供标准曲线的r-TIEG标准稀释液在4℃下覆盖NUNC微量滴定板过夜。
去掉覆盖溶液并用PBS简单(briefly)洗涤孔后，通过用含1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在37℃下温育孔1小时封闭非特异性蛋白。然后用最佳稀释的抗-TIEG抗体温育孔60分钟，接着用过氧化物酶偶连的第二抗体在37℃下温育60分钟。用PBS洗涤孔3次后，用底物2，2′-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉6-磺酸(2，2′-azinobis-3-ethylbenzthazoline 6-sulphonic acid)检测结合的抗体并读取405nm下的吸光度。
通过克隆进PcDNA 3.1/V5-His Topo载体(InVitrogen)从全长TIEGcDNA产生重组TIEG蛋白。该载体可转染进哺乳动物细胞系以表达TIEG-融合蛋白。
使用预结合的镍螯合树脂从细胞溶胞产物纯化TIEG融合蛋白。抗-TIEG抗体可从Dr.Steven Johnson(Mayo Foundation，Minnesota，USA)获得或者可使用常规方法在兔中针对TIEG融合蛋白产生。
实施例3-药物制剂和给药本发明的化合物正常情况下通过口服或通过任一肠胃外途径以包含活性成份的药物制剂形式，任选以无毒有机，或无机，酸，或碱，加成盐的形式，以药用上可接受的剂型给药。依赖于所治疗的疾病和患者，以及给药途径，该组合物可按各种剂量给药。
在人类治疗中，本发明的化合物可单独给药，但是一般与根据目的给药途径和标准药学实践选定的合适的药用赋形剂，稀释剂或载体混合给药。
例如，本发明的化合物可通过口服，含服或舌下以可含有调味或染色剂的片剂，胶囊，卵状体，酏剂，溶液或悬液的形式给药用于立即-，延迟-或控制-释放应用。本发明的化合物也可通过海绵体内(intracavernosal)注射给药。
该片剂可含有诸如微晶纤维素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙和甘氨酸的赋形剂，诸如淀粉(优选玉米，马铃薯或木薯淀粉)，淀粉乙醇酸钠，croscarmellose sodium和某些复合硅酸盐的崩解剂，和诸如聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，明胶和阿拉伯胶的颗粒粘合剂。另外，可包含诸如硬脂酸镁，硬脂酸，榆树酸甘油酯(glyceryl behenate)和滑石的润滑剂。
也可采用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊的填充物。在这方面优选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水悬液和/或酏剂，本发明的化合物可与各种甜味剂或调味剂，染色物质或染料，与乳化剂和/或悬浮剂和与诸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其组合的稀释剂混合。
本发明的化合物也可通过肠胃外，例如，静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内，颅内，肌肉内或皮下给药，或者它们可通过输注技术给药。它们最好以可含有其它物质，例如，足够的盐或葡萄糖使得该溶液与血液等渗的无菌水溶液的形式使用。如果需要，该水溶液应当是适当缓冲的(优选pH从3到9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂可通过本领域的技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。
适合于肠胃外给药的制剂包括可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂(bacteriostats)和使得该制剂与目的受体血液等渗的溶质的含水和无水无菌注射液；和可包含悬浮剂和增稠剂的含水和无水无菌悬液。该制剂可存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，使用前仅需即时加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬液可从以前描述的无菌粉末，颗粒和片剂类型制备。
对于病人的口服和肠胃外给药，本发明的化合物的日剂量水平通常从1mg/kg到30mg/kg。因此，例如，本发明的化合物的片剂或胶囊可含有一个剂量的活性化合物，如果合适可一次施用单个或两个或多个剂量。在任何情况下医生可确定最适合于任一患者个体的实际剂量且它可随年龄，体重和特定患者的反应而变化。上述剂量是平均情况的举例。当然，存在应接受更高或更低剂量范围的个体情况且它在本发明的范围内。
本发明的化合物也可通过鼻内或通过吸入给药且可方便地以干粉吸入器的形式给药或使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，氟代烷烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)，二氧化碳或其它合适的气体从加压容器，泵，喷雾器或雾化器提供气溶胶喷雾。对于加压的气溶胶，通过提供阀门给予标定量可测定剂量单位。加压的容器，泵，喷雾器或雾化器可含有活性化合物的溶液或悬液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，它还可含有润滑剂，例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如，明胶制成)可配制成含有本发明化合物的粉末混合物和诸如乳糖或淀粉的合适粉末基质。
优选排列气溶胶或干粉制剂使得每次标定的剂量或“喷出”给予合适剂量的本发明的化合物用于患者的给药。可预料到气溶胶的总日剂量可随患者而变化，且在全天可用单次剂量或者，更常见的是，用分开的剂量给药。
作为选择，本发明的化合物可作为栓剂或阴道栓的形式给药，或者它们可作为洗剂，溶液，乳膏，软膏，扑粉的形式局部应用。本发明的化合物也可经过皮肤给药，例如，通过使用皮肤膏药。它们也可通过眼途径给药，特别是用于治疗眼病。
对于眼科用途，本发明的化合物可在等渗，调节了pH的，无菌盐水中配制成微粉化的悬液，或者，优选的是，作为在等渗，调节了pH的，无菌盐水中的溶液，任选与诸如benzylalkonium chloride的防腐剂混合。作为选择，它们可在诸如凡士林的软膏中配制。
为了局部应用于皮肤，本发明的化合物可配制成含有悬浮于或溶于，例如一种混合物中的活性化合物的合适软膏，该混合物具有一种或多种下列物质矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。作为选择，它们可配制成悬浮于或溶于，例如，一种混合物中的合适的洗剂或乳膏，该混合物含有一种或多种下列物质矿物油，山梨聚糖单硬脂酸酯，聚乙二醇，液体石蜡，聚山梨醇酯60，鲸蜡基酯蜡，cetearyl alcohol，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
适合于在口中局部给药的配制品包括在调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中含有活性成份的锭剂；在诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中含有活性成份的锭剂；和在合适的液体载体中含有活性成份的漱口水。
一般来说，在人类，本发明化合物的口服或局部给药是优选的途径，因为它最方便。在接受者患有吞咽障碍或口服给药后药物吸收受损的情况下，该药物可通过非肠道，例如，舌下或含服给药。
对于兽医用途，本发明的化合物可根据正常兽医实践以合适的可接受的剂型给药且兽医医生会确定最适合于特定动物的给药方案和给药途径。
权利要求
1.一种鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维样变性的化合物的方法，包括步骤(a)提供能够表达TIEG和/或Smad-7的细胞类型；(b)提供试验化合物；(c)提供一定量的CTGF或其功能等价物；(d)将该细胞类型与试验化合物接触；(e)随后或同时将该细胞类型与CTGF或其功能等价物接触；(f)检测和/或测量Smad-7和/或TIEG的产量；(g)比较存在试验化合物时表达的Smad-7和/或TIEG的量与不存在试验化合物时检测和/或测量表达的Smad-7和/或TIEG的量；和(h)根据其引起Smad-7表达无改变或增加和/或TIEG表达无改变或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。
2.权利要求1的方法，还包含步骤(i)分离导致Smad-7表达无改变或增加和/或TIEG表达无改变或减少的试验化合物。
3.权利要求2的方法，还包含步骤(j)将该分离的化合物配制成还包含药用上可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂的组合物。
4.任一上述权利要求的方法，其中该化合物直接影响CTGF与TIEG之间的相互作用。
5.权利要求1至3中任一项的方法，其中该化合物间接影响CTGF与TIEG之间的相互作用。
6.一种化合物，它能够减少和/或防止在TIEG表达的诱导和/或Smad 7表达的抑制中的CTGF活性。
7.以权利要求1至5中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物，用于减少和/或防止在TIEG表达的诱导和/或Smad 7表达的抑制中的CTGF活性。
8.权利要求6和7中任一项要求保护的化合物，它是选自多肽，抗体分子，反义核苷酸的至少一种。
9.权利要求8要求保护的化合物，其中该化合物是抗体分子。
10.权利要求8要求保护的化合物，其中该化合物是反义核苷酸。
11.以权利要求1至5中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物在治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病中的用途。
12.以权利要求1至5中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断纤维变性疾病的药物中的用途。
13.权利要求11或12中任一项要求保护的用途，其中该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种。
14.权利要求13要求保护的用途，其中该疾病是糖尿病性肾病。
15.一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的以权利要求1至5中任一项的方法鉴定和/或制备的化合物。
16.一种治疗和/或预防纤维变性疾病的方法，包含施用治疗上或预防上有效剂量，或多个剂量的在权利要求6至10中任一项要求保护的化合物。
17.权利要求15或16要求保护的方法，其中该纤维变性疾病是选自糖尿病性肾病，非糖尿病性肾纤维变性，肺纤维变性，肝纤维变性(肝硬化)，骨骼肌纤维变性，心肌纤维变性，动脉粥样硬化，全身性硬化(systemicsclerosis)，硬皮病，视网膜纤维变性，辐射纤维变性，瘢痕疙瘩瘢痕形成和癌症相关性纤维变性中的一种。
18.权利要求17要求保护的用途，其中该疾病是糖尿病性肾病。
全文摘要
本发明提供了鉴定和/或制备用于减少和/或防止纤维变性的化合物的方法，包含步骤提供能够表达TIEG和/或Smad－7的细胞类型；提供试验化合物；提供一定量的CTGF或其功能等价物；将该细胞类型与试验化合物接触；随后或同时将该细胞类型与CTGF或其功能等价物接触；检测和/或测量Smad－7和TIEG的表达；比较存在试验化合物时表达的Smad－7和/或TIEG的量与不存在试验化合物时检测和/或测量产生的Smad－7和/或TIEG的量；根据其引起Smad－7表达无改变或增加和/或TIEG表达无改变或减少来确定化合物是否降低和/或防止纤维变性。还提供了用于减少和/或防止纤维变性的化合物以及该化合物的用途。
文档编号A61K39/00GK1906490SQ200480040636
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月18日
发明者纳迪亚·A·韦哈布, 罗杰·M·马森 申请人:帝国大学改革有限公司