专利名称：生物材料及其用途的制作方法
生物材料及其用途
本申请是申请日为2006年12月8日，申请号为200680051213. 0，题目为“生物材料及其用途”的分案申请。
本发明涉及与细胞凋亡诱导有关的分子和用于诱导细胞凋亡的药物组合物、方法及其用途。
目前，抗体不但是用于靶向癌症的选择性蛋白治疗剂，也用于治疗其他的症候 (Brekke et al. Nat Rev Drug Discov 2003:2:52-62)。抗体工程的出现为从合成噬菌体文库中产生人抗体提供了工具。由于人源的性质和更好的多样性，其表现出了降低的免疫原性且增高的特异性和亲和性(Weiner et al. Nat Biotechnol 2005 ；23 :556-7) 天然文库(na'ive library)特别引人注目，因为它们不依赖于新文库的免疫和重建，而可用于分离任何特异性的抗体，包括自身抗原(Griffiths et al. Embo J1993 ； 12 :725-34)。细胞表面受体目前组成了最成功的一类被当前治疗剂靶向的抗原，所述治疗剂包括小分子抑制剂和抗体。特别有意思的是细胞表面受体，其在靶细胞中独特表达或表现出增加的表达水平， 并且另外能够向细胞中转死亡或生存信号。这种具有内在信号特性的、差异表达的受体使基于抗体靶向微生物感染的细胞、转化的细胞或其它的功能障碍的细胞成为可能。
对于肿瘤的治疗，能在靶标肿瘤细胞中诱导细胞凋亡但不伤害正常组织的抗体特别有用。几种此类单抗已经被使用，其已在美国食品和药品管理局登记并且为常规的癌症治疗如淋巴瘤(利妥昔单抗(rituximab)靶向⑶20)或乳腺癌(妥珠单抗(trastuzumab) 或西妥昔单抗(cetuximab)分别靶向Her_2和EGFR)提供了替代。
目前，在临床研究中，也存在其他的具有细胞凋亡诱导作用的抗体。然而，即便这些抗体在患者或者动物试验中显示有益作用，但仍然存在未能满足的临床需要。
靶向B细胞肿瘤的抗独特型的免疫球蛋白是第一个实施于人的单克隆抗体治疗(Miller et al. N Engl J Med 1982 ;306 :517-2 。已经表明通过被动抗体施用 (Riechmann et al. Nature 1988 ;332 :323-7)或者用患者自身的肿瘤免疫球蛋白的主动接种(Kwak et al.N Engl J Med 1992 ；327 =1209-15)方法的肿瘤细胞破坏，赋予患有不同类型B细胞恶性肿瘤的患者肿瘤消退(tumour regression)或肿瘤休眠(tumour dormancy) 0最近的一篇文献描述了使用转基因小鼠产生完全的人抗独特型抗体(Suarez et al.Mol Immunol 2004 ;41 :519- )，该小鼠在产生小鼠抗体和表达选择的人抗体链式基因座(human antibody chain loci)方面是有缺陷的。
在本发明中，使用了竞争生物淘洗(competition biopanning)法，其中将全细胞形式的靶细胞抗原和膜囊(membrance vesicles)形式的过量相减细胞抗原 (excess subtracter cell antigen)同时暴露于天然的CoDeR 抗体噬菌体文库(W0 2004/023140 ；Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000 ； 18 :852-6)，以重新得到并随后试验具有良好的B淋巴瘤靶细胞选择性的抗体片段。而且，试验的抗体在靶细胞但不是在非靶细胞中诱导细胞凋亡的能力，证明了所选择的结合分子的功能性。
鉴定的特异性抗体包括HLA-DR/DP(本发明的Bl抗体)和表面IgM(本发明的Cll 抗体)，以及ICAM-I (本发明的Bll抗体)，其是以前与细胞凋亡诱导无关的粘附分子。分离的抗体在亚纳摩尔(subnanomolar)到纳摩尔(nanomolar)的范围内都具有亲和性，直接使他们成为用于靶向抗体治疗法的可能的选择。
发明概述
一方面，本发明提供了在靶细胞中诱导细胞凋亡的方法，其包括下列步骤
a.提供一种或多种展示细胞表面抗原ICAM-I的靶细胞；
b.提供一种或多种结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM-I结合，且一旦结合 ICAM-I，则诱导靶细胞的细胞凋亡；
c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的结合法分子中，诱导靶细胞的细胞凋亡。
优选，结合分子是抗体分子。
第二方面，本发明提供了在靶细胞中诱导细胞凋亡的方法，其包括下列步骤
a.提供一种或多种展示细胞表面抗原HLA-DR/DP和/或表面IgM的靶细胞；
b.提供一种或多种抗体，其选择性地与细胞表面HLA-DR/DP和/或表面IgM结合， 且一旦结合HLA-DR/DP和/或表面IgM，则诱导靶细胞的细胞凋亡；
c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的抗体分子中，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
第三方面，本发明提供了结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM-I结合，一旦结合ICAM-1，则诱导靶细胞的细胞凋亡。或结合分子是选择性地与细胞表面HLA-DR/DP和/ 或表面Ig M结合的抗体分子。
I CAM-1也称为⑶M，但出于本发明的目的，使用I CAM-1。
结合分子可来源于抗体并以在许多文库中已经广泛使用的抗体支架(antibody scaffold)为基础[Clackson T et al, Nature. 1991Aug 15 ；352 (6336) :624-8, Marks JD et al，J MoI Biol. 1991Dec 5 ；222 (3) :581-97]，但结合分子也可以来自其他的分子支架， 如纤连蛋白支架[Weng S et al. ,Proteomics. 2002Jan ；2(1) 48-57]和蛋白 A支架[Nord K,et ah,Nat Biotechnol1997Aug ； 15 (8) :772-7,Hogbom M et al,Proc Natl Acad Sci U S A. 2003Marl8 ； 100 (6) :3191-6]。这些支架中的每一个根据应用，有其自身的优势，例如， 抗体支架可有利地用于产生难以与天然变异区分的变异。
对抗体的基本结构，即最常用的支架，已经了解的相当透彻。大体上，框架区，其包括顺序排列成二个折叠片的β链，表现为一组可变环，就是所谓的互补决定区(CDRs)，其具有结合抗原分子的能力。尽管抗体在支架结构中可以变化，但最广泛的变异性见于CDRs 中。抗体间良好的变异性是它们以特异性方式与大体上所有类型的分子结构相互作用的能力的基础。由于这种能力，抗体已经广泛用于产生在疾病的诊断/预后中具有适用性的特异粘合分子(specific binder)，并作为对确定的靶结构具有特异性的治疗剂[Borrebaeck CA and Carlsson R，Curr Opin Pharmacol. 200IAug ； 1(4) :404-8]。
另外，用于本发明的其他非抗体结合分子，是具有支架结构的分子，所述支架结构具有高度稳定性但允许在某些位置引入变异。另一个结合分子的实例是容忍变异的纤连蛋白结构域和58个氨基酸的大蛋白质A结构域。也有其他的允许某种程度变异的分子折叠。 此类实例包括I型和II型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子，以及最近鉴定的一类新颖的分子，即所谓的防卫素，其在基本结构上相似，而仍然在基因家族成员之间具有广泛的序列变异性，这表明它们适宜作为具有分子多样性的支架。另外，在ICAM-I作为靶分子的情况下，天然配体如LFA-I或其重组变体组成能在靶细胞中诱导细胞凋亡的特异性结合分子。
而且，结合分子可以是选择性结合靶细胞的细胞表面ICAM-I的任何分子，并且一旦结合，则诱导靶细胞的细胞凋亡。
结合分子优选是抗体分子。
在一个实施方案中，细胞表面抗原是ICAM-I。
本发明的筛选重新获得对ICAM-I特异的抗体(B11)，其是一个以前认为与细胞凋亡无关且认为在细胞中无助于固有的负信号特性(intrinsic negative signaling properties)的受体。
确定ICAM-I作为细胞凋亡诱导分子是经设计以分离针对在靶细胞和非靶细胞之间差异表达的所有表面受体的特异性而筛选的直接结果，而无论并在没有它们各自的同一性的先前了解的情况下。已证实ICAM-I诱导的细胞凋亡为主动凋亡过程，该过程与线粒体膜的去极化有关。对于依赖和不依赖半胱氨酸蛋白酶caspase的细胞凋亡两者的线粒体膜的去极化已有记载(Nagy et al. J MoI Med 2003 ；81 :757-65)。
本发明的发现还表明，被Bll抗体结合的表位在不同来源的B淋巴瘤组织中表达， 并且与其他的外周血白细胞相比，其在某些B淋巴瘤细胞中被上调。重要的是，除了 B淋巴瘤细胞外，表达ICAM-I的癌细胞在体外遭受ICAM-I特异性Bll抗体时也经历了细胞凋亡 (参阅实施例6)。
以前的研究已经证明ICAM-I在正常人组织中的限制表达(Smith et al. J Clin Pathol 1990 ；43 :893-900)。ICAM-I与细胞和细胞的粘附有关，并通过与其受体LFA-I结合在免疫应答和炎症中起重要作用。针对ICAM-I的抗体已用于干扰病理免疫应答和炎症。 已经表明小鼠抗ICAM-ImAb在猕猴(cyhomolgus monkey)的体内施用(Cosimi et al J Immunol 1990 ； 144 :4604-12)，或在患有风湿性关节炎患者或者接受了肾移植患者的临床试验中的使用，没有明显的毒性(Kavanaugh et al. Arthritis Rheuml994 ；37 :992-9 ；Haug et al.Transplantation 1993 ；55 :766-72)。
ICAM-I靶向可导致细胞凋亡这一新的发现表明，只要不同来源的癌症表达抗原， 利用ICAM-I的特异性结合分子如抗体来治疗所述癌症是可能的。
基于ICAM-I的表达，可潜在地用细胞凋亡诱导抗ICAM-I抗体如Bll治疗的癌症类型包括B 淋巴瘤、骨髓瘤(Huang et al. (1993)Hybridoma 12p661-75 ；Huang et al.， (1995)Cancer Res 55p610-6 ；Smallshaw et al, (2004)J Immunother 27p419_24)、胃癌(Maruo et al, (2002) Int J Cancer 100p486_90)、乳腺癌(Rosette et al, (2005) Carcinogenesis 26p943_50)、月干癌(Sun et al, (1999) J Cancer Res Clin Oncol 125p28-34)、肺癌(Grothey et al, (1998)Br J Cancer 77p801_7)、黑色素瘤(Wang et al, (2005) Int J Cancer 27p419_24)、膀胱癌(Roche et al, (2003)Thromb Haemost 891089-97)以及前列腺癌(Aalinkeel et al, (2004)Cancer Res 64p5311_21)。在肿瘤转移中，已确定了 ICAM-I 的表达，如同 Maruo 等(Maruo et al，2002)、Rosette 等(Rosette et al，2005)、Sun 等(Sun et al，1999)、Grothey 等(Grothey et al，1998)、Aalinkeel 等 (Aalinkeel et al,2004)所证明的，指出利用ICAM-I特异性抗体干扰转移过程是可能的。
在另一个实施方案中，细胞表面抗体是HLA-DR/DP。
HLA-DR/DP通常存在于例如B细胞上，并发现在B淋巴瘤细胞中被上调。
到目前为止，三种不同的HLA-DR特异性单克隆抗体已经进入临床试验阶段。其中最近增加的是完整的人IgG4 1D09C3，其分离自与n_CoDeR 相比大小相似的天然噬菌体文库，但对纯化的抗原使用固相淘洗(solid phase panning) (Nagy et at. Nat Med 2002 ； 8 :801-7)。
在本发明中，已经确定了针对HLA-DR/DP的新的人抗体(Bi)，其快速和高效地在血多B淋巴瘤细胞系中诱导细胞凋亡，据此，证明HLA-DR/DP与靶细胞中细胞凋亡的诱导有关。
Bl抗体结合许多不同来源的B淋巴瘤细胞系(参阅实施例1和表1)，并且表示其在表达HLA-DR/DP抗原的细胞中诱导细胞凋亡。而且，当在Raji B淋巴瘤细胞系中试验时， 所述Bl抗体比利妥昔单抗更高效。当使用Bl抗体的IgQB式时，这点特别明显(图8)。
根据已经获得的数据，这种抗体具有治疗表达HLA-DR/DP的B淋巴瘤细胞系的适宜特征。另外，与利妥昔单抗靶向风湿性关节炎和SLE相似，Bl抗体可有效消除处于障碍中的激活的B细胞，其中，表达HLA-DR/DP的B细胞是有害的。
在另一个实施方案中，细胞表面抗原是表面IgM。
游离形式的IgM以大的四聚体结构存在，其较高的分子量倾向于将其限制于血管内。
单聚体IgM可发现于B淋巴细胞的细胞壁上，并且作为抗原识别的抗体受体起作用。
本发明的Cll抗体，一旦和表达在B淋巴细胞上的表面IgM结合，则快速并高效地诱导细胞凋亡(参阅实施例1和表1)。与以前在治疗B淋巴瘤的临床中使用的独特型特异性抗IgM抗体相反，Cll抗体与表达在来自不同供体的B细胞上的非多态性表位结合，因此适宜用于治疗患有B淋巴瘤的患者，而不管B淋巴瘤的独特型。
特别地，效应物分子例如抗IgM抗体也可能是任何类型的特异结合分子，其在不同独特型的表达IgM的细胞中引起细胞凋亡。
Bi、Bll和Cll IgG诱导的细胞凋亡的动力学非常快速，已观察到在一些细胞系中3小时后具有最大功效。快速的效应物功能对治疗功效非常重要，因为其由例如缺乏肿瘤抗原表达(Uyttenhove et al. J. Exp. Med. 1983 ； 157 :1040-52 ；Kennedy et al. Br J Haematol 2002 ； 119 :412-6)或表位突变(Weiner et al. J Immunol 1989 ； 142 :343-51 ； Bai et al. J. Clin. Invest. 2003 ；111 :1487-96)而导致的肿瘤侵入的风险降至最低，并且潜在地限制治疗持续时期和副作用(Robert et al Lancet Oncol 2005 ；6 :491-500)。
优选地，靶细胞是免疫细胞或上皮细胞，并且有利地该免疫细胞是B淋巴细胞。
方便地，该靶细胞与疾病有关。优选地，所述疾病选自下组癌症、自身免疫病(包括但不限于风湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败血症以及包括但不限于HIV 的传染性疾病。
有利地，所述疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脉络丛癌(chorioid cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、结肠癌和前列腺癌中的癌症。
如在本发明的定义部分所限定的，出于方便而使用术语抗体分子，除了其他的以外，还包括抗体、抗体片段和抗体衍生物。
方便地，抗体分子是IgG。IgG可以是任何的IgG^ IgG2, IgG3或IgG4,但优选是任何的IgG1和Ig(i4。抗体分子优选是人源化的或人的。
方便地，本发明的结合分子或抗体分子具有图9-11的可变区序列，或具有其功能上等同的同源物中任一个的序列。
在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有图9的可变区序列，或具有其功能上等同的同源物。
在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有
图10的可变区序列，或具有其功能上等同的同源物。
在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有图11的可变区序列，或具有其功能上等同的同源物。
第四方面，本发明提供了核酸，所述核酸具有编码任何以上的权利要求所要求保护的结合分子或抗体分子的核苷酸序列。
通常，该核酸分子具有图9-11中任一个的核苷酸序列。
第五方面，本发明提供了如本发明的第一或第二方面所限定的结合分子或抗体分子在诊断和/或治疗和/或预防需要破坏靶细胞的疾病中的用途。也提供了如本发明的第一或第二方面所限定的结合分子或抗体分子在制备用于治疗和/或预防需要破坏靶细胞的疾病的药物中的用途。
在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。
方便地，待治疗的疾病选自下组癌症、自身免疫疾病(包括但不限于风湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败血症和包括但不限于HIV的传染性疾病。
方便地，待治疗的疾病选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、 黑色素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列腺癌中的癌症。
在本发明的一个实施方案中，所述结合分子或抗体分子特异性地与ICAM-I结合和/或具有图10的序列并且用于上文所述的疾病。
在本发明的另一个实施方案中，该抗体分子特异性地与HLA-DR/DP结合，和/或具有图9的序列，并且用于淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列腺癌疾病中。
第六方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的结合分子或抗体分子和药学可接受载体、赋形剂或稀释剂。
在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。
第七方面，本发明提供了体外诱导靶细胞细胞凋亡的方法，其包括下列步骤
(i)提供一种或多种靶细胞；
(ii)提供一种或多种如本发明的第一个实施方案所限定的结合分子或抗体分子；
(iii)将(i)的靶细胞暴露于(ii)的结合分子或抗体分子中，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。
优选地，(i)中提供的靶细胞是面向细胞或上皮细胞。有力地，所述免疫细胞是B 淋巴细胞。
方便地，靶细胞与疾病有关，并且其中所述疾病选自下组癌症、自身免疫疾病 (包括但不限于风湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败血症和包括但不限于HIV 的传染性疾病。
通常，所述疾病选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列腺癌中的癌症。
所用术语的涵义
术语“抗体分子”用于指抗体、抗体片段或抗体衍生物中的任何一种。其意在包括野生型抗体、合成抗体、重组抗体或杂交抗体(antibody hybrids)，例如，但不限于，由免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示(phage-display)所产生的单链修饰抗体分子，或其它的能在本领域技术人员熟知的免疫测定模式中与抗原结合的免疫相互作用分子。
术语“抗体片段”用于指抗体、抗体片段或抗体衍生物中的任何一种。其意在包括野生型抗体(即包含4条多肽链的分子)、合成抗体、重组抗体或杂交抗体，例如，但不限于， 由免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示所产生的单链修饰抗体分子， 或其它的能在本领域技术人员熟知的免疫测定模式中与抗原结合的免疫相互作用分子。
术语“抗体衍生物”指任何修饰的抗体分子，其能在本领域技术人员所熟知的免疫测定模式中与抗原结合，如抗体片段(如Fab或Fv片段)，或通过加入一个或多个氨基酸而修饰的修饰抗体分子，或促进抗体与另一个肽或多肽、与大的载体蛋白或与固体支持体(如氨基酸酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和其衍生物，除其它以外还包括 NH2-乙酰基或COOH-末端氨基)偶联的其他分子。
术语“kFv分子”指任何分子，其中Vh和\伴侣结构域经通过弹性寡肽而连接。
术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，指核苷酸或这些核苷酸的序列的杂聚物。这些术语也指基因组来源或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链的或双链的，并且代表肽核酸或任何DNA样或RNA样材料的有义链或反义链。在本发明的序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，N是A、C、G或T(U)。 可预期到是，当多核苷酸是RNA时，在本发明提供的序列中的T(胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶) 取代。通常，由本发明提供的核酸片段可由基因组的片段或短的寡核苷酸连接体、或由一系列寡核苷酸、或由单独的核苷酸组装，来提供能在重组的转录单元中表达的合成的核酸，所述重组的转录单元包括来源于微生物或病毒操纵子或真核基因的调控元件。
术语“多肽”或“肽”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列或其片段，并且指天然存在的或合成的分子。多肽“片段”、“部分”或“片段”是至少5个氨基酸，优选至少约7个氨基酸，更优选至少约9个氨基酸，最优选至少约17个或更多个氨基酸的氨基酸残基的一段。为了具有活性，任何多肽必须具有足够的长度来展示生物学和/或免疫学活性。
如本文中所用的，术语“纯化的”或“基本上纯化的”表示指定的核酸或多肽基本上不含有其他的生物大分子，如多核苷酸、蛋白质等。在一个实施方案中，纯化该多核苷酸或多肽，使其组成指定的生物大分子重量的至少95%，更优选重量的至少99% (但水、缓冲液和其他的小分子，特别是具有小于1000道尔顿分子量的分子可以存在)。
如本文中所用的术语“分离的”指分离于至少一种其他组分(例如核酸或多肽的核酸或多肽，该组分与其天然来源中的核酸或多肽一起存在。在一个实施方案中，仅存在(如果有什么区别的话)溶剂、缓冲液、离子或正常存在于其溶液中的其他组分时，通常可在该溶液中发现核酸或多肽。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
术语“重组体”，当在本发明中用于指多肽或蛋白质时，其意指来自重组(如微生物的、昆虫的或哺乳动物的)表达体系的多肽或蛋白质。“微生物的”指在细菌或真菌(如酵母)表达系统中产生的重组多肽或蛋白质。作为产物，“重组微生物的”指基本上不含天然内源性物质的多肽或蛋白质，并且不伴随相关的天然糖基化。在大多数细菌培养物(如 E. coli)中表达的多肽或蛋白质没有糖基化修饰；酵母中表达的多肽或蛋白质具有通常不同于哺乳动物细胞中表达的那些多肽或蛋白的糖基化模式。
术语“选择性结合”和“结合选择性”表示，本发明的抗体的可变区专有地识别和结合本发明的多肽(即，不管在多肽家族中发现的序列的同一性、同源性或相似性如何， 能从其他相似的多肽中区分本发明的多肽)，但通过与抗体可变区外的序列(特别是该分子的恒定区中的序列)相互作用，其也可与其他的蛋白质相互作用(如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A或ELISA技术中的其他抗体)。测定本发明抗体的结合选择性的筛选分析在本领域中是熟知的并且是按常规实施的。对于此类分析的广泛讨论，参阅 Harlow 等编辑的，Antibodies A Laboratory Manual ； Co Id Spring Harbor Laboratory ； Co Id Spring Harbor, N. Y. (1988)，第6章。也思考了识别和结合本发明多肽片段的抗体，只要所述抗体对上述本发明的全长多肽是首先选择的。因为抗体对本发明的全长多肽是选择性的，因此，能识别片段的本发明的抗体是不管于蛋白家族中发现的固有的序列同一性、同源性或相似性如何，而能从多肽的同一个多肽家族中区分多肽的抗体。
术语“结合亲和性”包括抗体分子和抗原之间的结合强度的涵义。
通过术语“免疫细胞”，我们意指与宿主免疫应答或炎症应答有关的任何细胞，包括但不限于B细胞和T细胞。
通过术语“上皮细胞”，我们意指上皮的细胞。上皮是由一层细胞组成的组织。上皮可发现附在身体的内自由表面(如内皮，其附在血管内侧直线排列)或外自由表面(如皮肤)上。
我们皮肤的最外层是由鳞状上皮细胞组成的，如同衬在口和体腔(body cavities)内侧的粘膜一样。其他的上皮细胞衬在肺、胃肠道、生殖道和尿道的内侧，并且构成外分泌腺和内分泌腺。上皮细胞的功能包括分泌、吸收和保护。上皮细胞位于基膜(basal lamina)上。
优选的实施方式
体现本发明某些优选方面的实施例将参考附图进描述，其中
图1 通过差异的全细胞/细胞膜囊生物淘洗分离的scFv表现出了高度的靶细胞特异性
通过差异生物淘洗而分离的scFv克隆在大肠杆菌T0P10细胞中表达并与Ramos 细胞或Jurkat细胞和(A)为进行初级筛选而表达的scFv克隆或(B) 72个随机选择并再表达的scFv克隆一起温育。用抗His MAb和Cy5-抗小鼠多克隆Ab检测结合的scFv。用 FMAT Macroconfocal Hight Throughput Screening仪检测细胞的结合。细胞结合图示为靶Ramos细胞(Y轴)对非靶Jurkat细胞(X轴)的平均荧光强度。(C) 7种独特的scFv克隆与Ramos细胞(实心柱)和Jurkat细胞(空心柱)的结合。对照ScFV(ctrl)未与任何细胞结合。
图2 抗Ramos scFv的细胞凋亡诱导
将Ramos淋巴细胞与抗Ramos scFv、抗His mAb和抗小鼠多克隆Ab在冰上顺序温育(并不间断洗涤以除去过量的未结合抗体)，并在5% C02、37°C的湿润空气中温育M小时。随后收获细胞，并用膜联蛋白V-AF488(AV) (Armexin V-AF488 (AV))和碘化丙啶(PI) 进行组合染色。根据不同的AV和PI染色阳性(如图2B中正方形通道(square gates)所定义)，将细胞评价为存活(AV-PI-实心圆，图2C)、早期细胞凋亡(AV+PI-，空心三角形，图 2C)或晚期细胞凋亡/坏死(AV+PI+，空心菱形图2C)。通过图示(A)针对Side Scatter的 Forward Scatter (FSC-Height)以及(B)针对 PI (FL-3)的 AV(FL-I)来表示结果。也表示了 scFv Bl和Fl的滴定效果(C)。将7种独特的scFv与各种浓度的(D)Ramos或(E)Raji B淋巴细胞在37°C —起温育M小时，并研究对细胞凋亡诱导的作用。三种scFv，Bl、Bll和 Cll表现出了对两种细胞系的滴定活性，而scFv BlOXlO和G12的细胞凋亡诱导能力局限于Ramos B淋巴瘤细胞。
图3 分离的抗体的特异性包括HLA-DR/DP、IgM和ICAM-I
A)用 0. 5% ν/ν 的非离子去污剂 Triton X-1000 裂解 50-600 X IO6 个 Raji B 淋巴瘤细胞，并用100 Ug Bl(泳道1)和Bll (泳道11)的完整人IgGl形式免疫沉淀，随后用蛋白A琼脂糖(Protein A Sepharose)进行交联。来自50X IO6个细胞的Ramos B淋巴瘤细胞裂解物用于沉淀20 μ g Cll (泳道3)。切除抗体特异性条带并进行胰蛋白酶消化并通过MALDI-T0F进行分析。
B)分别通过与抗HLA-DR/DP、抗ICAM-I或抗IgM抗体一起预温育封闭与B淋巴瘤细胞结合的 Bl IgG、Bll IgG 和 Cll IgG0
为了证实抗体克隆B1、B11和Cll的重新得到的MALDI-T0F抗原的同一性，进行用购买的抗体进行的封闭研究，并用流式细胞术进行分析。与多于10倍摩尔(与人抗体相比) 的物种匹配的封闭抗体(species-matched blocking antibodies) 一起预温育1小时，随后加入任何分离的人抗体克隆。30分钟后，洗涤细胞，并通过PE-共轭的羊抗人IgG(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)，检测人抗体与细胞的结合。在该研究中，对于Bi，所用的封闭抗体是小鼠单克隆抗HLA DR (Sigma, clone HK14)或抗CD40 (Beckton Dickinson, clone 5C3)；对于B11，所用封闭抗体是兔多克隆抗ICAM-I (Abeam，ab7815_250)或抗 CD22 (Abeam，ab25135-100)；对于 C11，所用的封闭抗体是羊多克隆抗 IgM (Zymed，South San Francisco, CA, USA, 62-7500)或抗 IgG(Zymed, 62-8400)。
图4 =ICAM-I是能介导细胞程序性死亡的B淋巴瘤相关的细胞表面受体
A.将2yg/ml Bll或抗FITC-8 (对照)IgG1加入至4X IO5个CL-01B淋巴瘤细胞， 在冰上温育2小时，随后加入10 μ g/ml交联的第二 Fab' 2羊抗人Fc抗体。细胞在37°C 下温育6小时，通过两个独立的细胞凋亡分析，测定抗体温育的效果。通过与上文所述相似的AV/PI (上组)或通过与5 μ g/ml线粒体膜区极化试剂JC-I在RT下一起温育30分(下组)，来染色细胞。通过红(y轴)/绿(χ轴)荧光强度比的降低，可检测细胞凋亡的诱导。 (B)显示了 Bll抗体与B淋巴瘤组织代表性结合的组织切片。将从患有间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic Large Cell B Lymphoma)获得的冰冻保存的组织用Bll或FITC-8 (对照)12scFv抗体染色。用DAB(褐色)检测抗体的结合。插入的图片显示用对照scFv进行的染色。(C)将CD45-PerCp-Cy5. 5mAb预标记的Ramos细胞与供给来源的PBMCs混合，并用荧光燃料共轭的CD特异抗体和Alexa Flour 647Zenon预标记的Bll IgGl或对照FITC_8IgGl 对不同的细胞群进行染色。在FL-4通道中记录与不同细胞群结合的IgG Bll0
图5 :IgG Bl和IgG Bll对B淋巴瘤细胞的亲和性
在存在或不存在0. 2mg/ml对应的未标记IgG蛋白的情况下，将Raji (左组，IgG Bi)或Ramos细胞(右组，IgG Bll)与渐增量的放射性碘标记IgG Bl或放射性碘标记的 IgG Bll蛋白一起温育。通过从总的结合中减去在存在未标记的竞争性蛋白情况下的结合， 测定特异性结合。结合的IgG Bl或IgG Bll蛋白的量随着游离IgG蛋白量的增加而增加， 分别在 30nM IgG Bl和 InMIgG Bll时(上组)，达到饱和结合。Rosenthal-Scatchard 图分析(较下的组)证明了对于IgG Bi， 30nM的解离常数和每一个Raji细胞400，000 个功能结合位点，以及对于IgG BlKRaji细胞)， 0. 3nM的解离常数和每一个Raji细胞 47，400个功能结合位点，
图6 =BuBiucilIgG1与不同来源的肿瘤细胞系的结合
通过流式细胞术，研究了 Bi、BlU Cll抗体靶向的抗原在不同癌细胞系中的抗原分布。柱状图显示了利妥昔单抗抗⑶20Mab (第一行前面的大部分峰)、B1 IgG1 (第二行的峰)、B11 IgG1 (第三行的峰)或Cll IgG1 (第四行后面大部分的峰)与MCF-7乳腺癌细胞、 HPAC胰腺癌、PC-3前列腺癌细胞、LS174T结肠直肠癌细胞以及THP-I单细胞白血病细胞的结合，如所示的。
图7 :B11 IgG1在癌细胞中的细胞凋亡诱导
在6 孔板中，在完全培养基(Complete Growth Medium, RPMI 1640，补充了 10% FCSUOmM HEPES以及2mM L-谷氨酸)内将前列腺癌细胞系培养至80 %的融合 (confluency)。将前列腺癌细胞系DU145培养于具有Earl，s盐的MEM中，其补充了 10% FCS、lmM丙酮酸钠以及ImM非必须氨基酸，并且将癌细胞系MDA MB 435的衍生物培养于补充了 10% FCS 的 DMEM 中。
对于细胞凋亡分析，在PBS中洗涤细胞，并将连续稀释的Bll IgGJ或Bl 18&、妥珠单抗或用于对照的阴性对照抗体)加入到每个孔中，并且使结合在4°C下1-2个小时的温育。洗涤细胞，加入完全培养基，该培养基含有10yg/ml的交联抗体、Fab’2羊抗人Fab’2。 将细胞在37°C、具有5%的(X)2的空气中温育16- 小时。通过胰蛋白酶化作用，收集细胞， 并用Alexa FlUor488-膜联蛋白V(AF488_AV)和碘化丙啶(PI)根据制造商的说明书进行染色。以下列公式，计算凋亡细胞的百分比％凋亡细胞=100-% AF488-AV/PV-/-。
A)等高图(contour plots)显示用2 μ g/ml IgG Bll或IgG Bl如上述温育后，作为膜联蛋白V和碘化丙啶阳性的函数的PC-3细胞的相对分布。
B)柱状图显示，与连续稀释的Bll 1861或2(^8/1111 Bl IgG1—起温育后，凋亡的 PC-3细胞的平均百分比。
C)柱状图显示，与无抗体的对照、10 μ g/ml阴性对照抗体、连续稀释的Bll IgG1或 10 μ g/ml妥珠单抗IgG1 —起温育后，凋亡的MDA MB435细胞的平均百分比。
D)柱状图显示，与无抗体的对照、10 μ g/ml阴性对照抗体、连续稀释的Bll IgG1或 10 μ g/ml妥珠单抗IgG1 —起温育后，凋亡的DU145细胞的平均百分比。
图8 在缺少交联剂的情况下，Bl IgG1和Bl IgG4诱导对Raji B淋巴瘤细胞的直接细胞毒性
将Raji细胞与20,6. 7或2. 2 μ g/ml的Bl IgG、Bl IgG4、利妥昔单抗IgG1或对照 CT-HIgG1 —起温育M小时。收获细胞，并将存活力测定为膜联蛋白V和碘化丙啶的双重阴性细胞(double negative cells)。
图9 =Bl抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
图10 =Bll抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
图11 =Cll抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
实施例1 具有对与细胞表面受体有关的B淋巴瘤特异性的细胞凋亡诱导抗体的切片和筛选(生物淘洗)
细胞培养
除非另有说明，在本研究中所用的细胞系是从ATCC(Manassas, VA, USA)或 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) GmbH(Braunschweig, Germany)获得的，并培养于补充了 10% FCS、2mM L-谷氨酸、IOmM HEPES和ImM丙酮酸钠 (均来自 hvitrogen，Carlsbad，CA，USA)的 RPMI 1640 培养基中。Jurkat T 白血病细胞系 (clone E6-1、TIB-152、ATCC)、B 淋巴瘤细胞系 D0HH-2 (ACC47，DSMZ)、SC-I (ACC558, DSMZ)、 WSU-NHL (ACC58, DSMZ)、JVM-2 (ACC12, DSMZ)、Jeko-I (ACC553, DSMZ,培养于 20% FCS 中)、 Rec-I(ACC 584，DSMZ)、SP-53 (Daibata et al Cancer 1989 ;64 :1248-53)、RL(CRL_2261， ATCC)、Granta 519 (DSMZ)、NCEB-I (Saltman et al. Blood 1988 ；72 :2026-30)、BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975 ；22 :276-84)、Ramos (CRL-1596，ATCC)、Raji (CCL-86， ATCC)、Daudi (CCL-213，ATCC)、CL-Ol (Cerutti et al. J Immunol 1998 ；160 :2145-57)、前 B细胞淋巴瘤KM-3/Reh(CRL-^86，ATCC)以及多发性骨髓瘤UCICAK (CRL-8083，ATCC，培养于补充了 20% FCS的IMDM(Invitrogen)中)均不含支原体，将其培养于37°C、5% CO2的湿润空气中。将细胞维持在2X IO5-IX IO6个细胞/ml之间。
Juarkat细胞膜囊的制备
通过在500ml 桶(bucket) (Corning Inc. Life Sciences, New York, USA)中，以 300Xg离心15分钟，收获细胞，在Dulbecco，s PBS(Invitrogen)中洗涤，并重悬浮于缓冲液A(lmM NaHCO3,1. 5mM MgAc, pH 7.4)中。细胞的浓度大约是5X IO7个Jurkat细胞/ ml (在IOOml缓冲液A中，是5 X IO9个细胞)。
通过在冰上10-30分钟的高渗透性休克处理(缓冲液A)，实现细胞破碎，随后用氮空化弹(Nitrogen cavilation bomb, (Parr Instrument Company, Moline, IL, USA)对其进行氮空化。将细胞置于0°C、40baH4，000kPa)的恒压下15分钟。
将破碎的细胞收集于含有500 μ 1的0. 5Μ EDTA的50ml Sarstedt管(SarstedtAG & Co，Niimbrecht, Germany)中，来产生终浓度为2. 5nM的EDTA。加入EDTA预防膜囊的聚集。将均菜(100ml)分配于4X25ml的Beckman厚壁离心管(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton，CA，USA)中，将其在 4°C 以 1900 X g (在 Sorvall SS!34 离心机中 4，OOOrpm)离心 10分钟，以除去未破碎的细胞、细胞核以及重线粒体。
收集上清液，并将颗粒状物重悬浮于含有ImM EDTA的25ml NaHCO3缓冲液中，并再次离心(进一步回收颗粒状的粗Jurkat膜)。将Jurkat膜与来自第一次离心的膜合并。用Beckman 45Τ 型离心机40，OOOrpm(约200，OOOXg)在4°C，将含有粗Jurkat膜囊的上清液超离心2.5小时。倒出上清液，通过依靠着棉纸(例如Kleenex )倾斜试管的边缘，除去剩余的缓冲液。
在金属棒的辅助下，将粗膜颗粒物转移至Doimce勻浆机中，并通过在勻浆机中几次小心的敲打，将其重悬浮于2. 5mlHES缓冲液(IOmM Hepes, ImM EDTA，0. 25M蔗糖，pH 7.4)中。从而获得含有SO-IOOmg蛋白质的、浓度相当于2X109cellS/ml的膜悬浮物。
通过全细胞/细胞膜囊竞争生物淘洗选择噬菌体Abs
将约2 X IO13个噬菌体颗粒在37°C预热15分钟，并间断地混合，14，000 X g离心15 分钟以除去沉淀，将上清液转移至新鲜的Eppendorf管中。加入脱脂奶，至2%的终浓度(w/ ν)。将来源于2 X IO9个细胞(第一轮选择；第二轮和第三轮选择，2 X IO8个细胞)的Jurkat 膜囊制备物在冰上解冻，并与封闭的噬菌体颗粒混合。将该混合物在冰上温育15分钟。
通过4°C、1，200rpm离心6分钟，收获5 X IO7 (5 X IO6第二轮和第三轮)个Ramos 细胞。丢弃上清液并将Ramos细胞重悬浮于奶-噬菌体-Jurkat膜囊混合物中。将悬浮液在10°C、缓慢完全旋转的条件下温育4小时。
将细胞/细胞膜囊/噬菌体混合物转移至15ml的!^alcon管(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)中，该Falcon管含有在底部的0. 5ml 100 % (台盼蓝染色的) Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)以及 2 % (w/ν)BSA/ PBS(Ficoll-柱)中覆盖的 40% (ν/ν)的 Ficoll 9.5ml。于 4°C、1，500rmp，将试管离心 10 分钟。将试管从离心机中拿走并旋上试管的盖子并进行不透气密封。
使用雪茄切碎机(cigar-chopper)切掉含有100% Ficoll的i^ilcon管的底部尖端。从而，从试管中除去了包括膜囊片和细胞核的密度非常高的物质。随后，小心地打开试管的盖子，从而破坏试管内的真空并打开(切割)使得液体通过在试管底部开孔逐滴排出。
将收获的细胞悬浮液在PBS中洗涤一次，以除去多余的Ficoll。将颗粒物重悬浮于Iml的PBS中(不要在最终的洗涤后进行)，并将悬浮液重新装载于新鲜Ficoll柱的上部，重复洗涤方法(在第二轮和第三轮中2次)。
通过在PBS中加入150 μ 1 76mM的柠檬酸(pH 2. 5)，从细胞中洗提噬菌体，随后在室温下温育5分钟。通过加入200 μ 1的IM Tris-HCl, Ph 7. 4，中和该混合物。在将细胞200Xg沉淀5分钟后，保存洗提的噬菌体的上清液。通过在Iml胰蛋白酶中，在室温下将细胞颗粒物重悬浮并温育10分钟进一步洗提噬菌体。
在用40μ llmg/ml抑酶肽灭活后，离心细胞，保存含有洗提的噬菌体的上清液。洗提的噬菌体用于感染大肠杆菌HB101F’，并将该细菌涂布于含有适当抗生素和葡萄糖的TB 培养基上。计数细菌的菌落，从平板中刮下，并用作下一轮淘洗的接种体。
向scFv模式的转化、scFv的表达、纯化以及细胞结合的分析
将三轮选择后获得的噬菌粒库用fegl消化，以除去基因III。将所得的载体再连接。通过用EcoRI酶消化，将含有再连接的、未切割的基因III的片段线性化。用由此而产生的scFv载体库基本上按更早时的描述(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000 ； 18 852-6)转化 E. coli T0P10 细胞。
将细菌涂布于大的500cm2琼脂平板上，挑选单个克隆，转移至96孔板中，并使用自动化的系统(Hallborn Biotechniques 2002 ;Suppl :30_7)，通过 37°C、220rpm 过夜培养，在TB培养基上表达。在含有适当抗生素的TB培养基中产生重组scFv片段。
对于与 Raomos 革巴细胞(target Raomos cells)禾口 Jurkat 非革巴细胞(Jurkat non-target cells)结合的sc Fv克隆的初级筛选，将5，000个Ramos细胞或Jurkat细胞与960个scFv克隆的任一个一起温育，所述scFv来自第三轮选择并如上文所述而产生。 将细胞与 0. 5 μ g/ml 抗 6xHis mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN5 USA)和 0. 7 μ g/ml Cy5-共轭的羊抗小鼠试剂(Amersham Biosciences) 一起温育。在8200Cellular Detection System Fluorescence Macroconfocal High Throughput Screening(FMAT)仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中检测细胞的结合。
初级筛选后，随机挑选(即，不管在初级筛选中，靶细胞对非靶细胞的反应性)72 个细菌克隆用于如以前所述的DNA测序(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000，18 852-6.) (Soderlind et al，2000)。为了通过流式细胞术评估细胞表面结合，将Ramos细胞和Jurkat细胞(每个试验，两者都加入2X IO5个细胞)与在含有0. 5% w/v BSA(DPBS-B) 的PBS(Invitrogen)中、浓度为2-10 μ g/ml的单个scFv克隆一起温育1小时。
通过在300 Xg离心60分钟，洗涤细胞。随后将细胞分别与FITC共轭的⑶19mAb 和PE共轭的CD3mAb(BD) —起温育，从而使随后的靶细胞和非靶细胞的鉴定成为可能。在与生物素化的抗6xHis mAb—起温育后，通过与RPE-Cy5_链霉抗生素(Dako Cytomation, Glostrup,Denmark) 一起温育，实现scFv结合的检测。将细胞与第二和第三试剂分别一起温育40分钟和15分钟。所有的温育在冰上使用冰冷的溶液进行。
差异的全细胞/细胞膜囊淘洗
本研究利用了新的淘洗方案，以分离靶向在其天然细胞表面构型中差异表达的抗原的抗体。三轮竞争生物淘洗后，利用来源于Jurkat T白血病细胞的全Ramos B淋巴瘤细胞和膜囊，分离重组的噬菌体scFv。将它们转化为可溶的scFv并在E. coli TOPlO细胞中表达。
将重组scFv与靶(Ramos)或非靶(Jurkat)全细胞一起温育，并检测细胞的结合。 抗体克隆对靶细胞抗原的特异性是显著的，因为已显示表达的482个scFv克隆以微弱至非常强烈范围内的强度选择性地与Ramos靶细胞结合(图1A)。仅确定了微弱地染色Jurkat 非靶细胞的两个克隆(图1A)。
我们接下来测定分离的噬菌体展示的scFv的基因型多样性。随机挑选(即，不管如初级筛选中所测定的结合取向)72个scFv克隆用于DNA测序。
通过FMAT技术，以靶细胞的特异性(Ramos对Jurkat)同时对克隆进行再表达和再评估，如图18所述。通过它们不同的CDRH3和CDRL3序列(数据为显示)所测定，鉴定了 7种不同的抗体基因型。
与等量的Ramos细胞和Jurkat细胞一起温育并通过抗标签抗体的方式检测scFv 的结合后，通过三色流式细胞术分析，证实了抗Ramos scFv的高度特异性(图1C)。
使用荧光染料共轭的⑶特异性单克隆抗体，分别通过⑶19和⑶3的表达，鉴定靶细胞和非靶细胞。当与阴性对照scFv相比时，7种基因型独特的scFv显示了与Ramos靶细胞的高度且可变的结合强度，但与Jurkat非靶细胞没有结合。
细胞凋亡分析
使用Detoxigel 柱，根据制造商的说明书(Pierce Biotechnology, Rockford, IL,USA)，降低重组产生的scFv片段的脂多糖水平。通过LAL阿米巴样细胞的溶解产物分析 (Cambrex Bioscience, ffalkersville, MD, USA)，对剩余的内毒素水平进行定量。
发现所有的样品含有不到0. lIU/ml的脂多糖。嵌合的抗⑶20抗体Mabthera (利妥昔单抗)购买自隆德大学医院(Lund University Hospital (Lund, Sweden)) 将 2X IO5个B淋巴瘤细胞(Raji或Ramos)或Jurkat T细胞与连续稀释且消毒的scFv，s 一起在在培养基中，冰上温育1小时。
将细胞顺序地与第二抗6xHis mAb (5 μ g/ml)和第三羊Fab' 2抗小鼠Fab' 2抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ,West Grove, PA, USA) 一起温育。间断地洗涤确保除去过量的未结合的抗体试剂。在37°C、5% CO2的湿润空气中温育细胞M小时。
当用全Ig(iS进行细胞凋亡诱导时，用与非IgG抗体同种型具有最小交叉反应性的羊Fab' 2抗人Fc γ抗体(Jackson ImmunoResearch)取代交联剂(为了避免内源性B淋巴瘤相关的表面免疫球蛋白的非特异性交联)，并如上文所述温育6小时。
除非另有说明，通过用膜联蛋白V Alexa Fluor 4S8 (AV)和碘化丙啶(PI)(两者都来自^witrogen的分子探针)组合染色以及随后的流式细胞术分析，来检测凋亡的细胞。将细胞鉴定为可变的(AV-/PI-)、早期凋亡的(AV+/PI-)晚期凋亡的/坏死的(AV+/ PI+)。使用 FACSCAlibur 仪(BD Biosciences)，分别在 FLl 和 FL2 或 FL3 通道中记录 AV 和 PI信号(如在下文中所表示的)。
为了研究分离的scFv的功能性，基于用scFv和交联剂顺序地温育和洗涤细胞，我们建立了高通量细胞凋亡筛选分析。在图2A-C中，证明了在细胞凋亡分析中对scFv克隆和浓度的依赖，其中，将选择的scFv克隆Bl的凋亡作用和scFv克隆Fl的凋亡作用做了比较，该scFv克隆Fl未显示细胞凋亡诱导。在用任何检查的scFv处理后，缺乏靶抗原表达的Jurkat细胞未死于细胞凋亡，证明细胞凋亡诱导依赖于与靶抗原的结合(未显示数据)。
利用已建立的scFv-细胞凋亡分析，我们对Ramos和Raji B淋巴瘤细胞以细胞调亡筛选克隆。将scFv诱导的凋亡作用与利妥昔单抗抗CD20mAb诱导的凋亡作用进行了比较(图2D)。鉴定三个scFv克隆-B1、B11和C11，其诱导Ramos细胞和Raji细胞两者的显著细胞凋亡(图2D和E)。通过scFv诱导Raji细胞的细胞凋亡和与这些细胞的结合相关 (图2D)，因为不能结合Raji细胞的scFv克隆未诱导细胞凋亡。
将Bi、Bll和Cll克隆转化至完整的人IgGl抗体。重构型后，它们的特异性和功能性保持完整，如通过它们对广泛的B淋巴瘤细胞系的强烈结合和有力的细胞毒性(表1) 所证明。值得注意的是，细胞凋亡的诱导是快速的，几个细胞系在3-6小时后就达到膜联蛋白V阳性凋亡细胞的最大百分数(表1以及未显示的数据)。
IgG的产生和内毒素筛选分析
通过克隆至修饰的ρ⑶NA3载体将scFv抗体片段转化为全长的人IgGl λ形式 (Norderhaug et al, J Immunol Methods 1997 ；204 :77-87), Lipofectamine 2000 剂根据制造商(Invitrogen)说明书转染至HEK293细胞。
在Mabklect蛋白 A 柱(Amersham Biosciences)上，从失去效能的培养基(spent cultivation medium)中纯化人IgG。通过SDS-PAGE分析所测定的制剂的纯度> 98%。筛选抗体制剂，并通过LAL阿米巴样细胞溶解产物试验所测定的(Cambrex Bioscience)发现其在本发明所用的浓度中含有< 0. lIU/ml的内毒素。
实施例2 抗体特异性分析
抗原鉴定
通过B淋巴瘤细胞裂解物的免疫沉淀鉴定靶向抗原的特性。通过离心收获细胞 (根据抗体和细胞系50-600 X IO6个/ml溶解缓冲液)，在PBS中冲洗两次，并温育于含有 0. 5% ν/ν 去污剂 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, USA)的裂解缓冲液(Lysis Buffer, (25mM Tris-HCl, pH 7. 5,150mM NaCl,5mM EDTA，以及完全的 EDTA-free 蛋白酶抑 ^MWM^ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany))巾。
将细胞碎片在常规的台式离心机中以16，000Xg、15分钟旋转沉降，通过旋转，用 Protein A Sepharose 4Fast Flow (Amersham Biosciences) (1/10 反应体禾只)予页先除去杂质。对于每一个样品，用20-100 μ g任何人抗体将Iml预先除去杂质的细胞溶解产物免疫沉淀2小时。再次加入ftOtein A Sepharose4Fast Flow，并温育30分钟，其中，在裂解缓冲液中对免疫复合物(immimo-complexes)彻底洗涤后，煮沸5分钟，最后重悬浮于样品缓冲液(IXNuPAGE LDS Sample Buffer, IX NuPAGE Sample Reducing Agent)中，并在NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel(均来自 hvitrogen)中进行分离。
染色(SimplyBlue Safestain, Invitrogen)后，将目标蛋白条带从 SDS-PAGE 中切除并进行胰蛋白酶消化，如Edvardsson等所述(Edvardsson et al. Electrophoresis 1999；20 :935-42)。
简单来说，对凝胶块(gel plugs)脱色，并通过在搅拌的情况下，用200 μ 150%乙腈(ACN)洗涤 3 次来平衡。在 SpeedVac 浓缩器(Savant,Farmingdale,NY,USA)中干燥 15 分钟后，通过加入25μ1 IOmM DTT/100mM NH4HCO3，还原样品，并在56°C温育1小时，并且通过加入25 μ 1 55mM乙酰胺/IOOmMNH4HCO3进行烷基化，随后在室温下温育45分钟。
两次在IOOmM NH4HCO3中洗涤10分钟的额外步骤，随后在50% v/vCAN洗涤一次后，在SpeedVac浓缩器内干燥凝胶块，并再膨大，并在含有15 μ 1 15ng/y 1胰蛋白酶 (Promega Corporation，Madison，WI，USA)的 25mMNH4HC03 中 37°C消化过夜。通过加入 50% v/v ACN/1% v/v TFA并在室温下温育10分钟，来提取肽。将1 μ 1提取物点样于MALDI样品平板上并进行干燥。将1 μ 1基质溶液(5mg/ml α -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)溶解于 75% v/v ACN/1% v/v TFA中)点样于肽的上面。
用Applied Biosystems 4700Maldi Workstation 测定肽质量。使用 Mascot 搜索工具(Matrixscience，UK)，通过肽质量指纹数据搜索，鉴定肽。使用相似的方法，鉴定 B10、C10和G12克隆的抗原特异性，除了 scFv，s和抗His包被的磁微珠(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)用于免疫沉淀外。
转化为完整的抗体形式后，Bi、Bll和Cll IgG用于从Raji和Ramos B淋巴瘤细胞中沉淀抗原。IgG Bl沉淀了分别为大约^kDa和34kDa的两条带(图3A，泳道1)。制备含有这些条带的凝胶切片，用胰蛋白酶消化，并通过质谱测定法(mass spectrometry)进行分析，从而将HLADR/DP鉴定为靶抗原。
通过使用购买获得的单克隆抗体的western印迹法和HLA-DR/DP蛋白检测，以及通过将细胞与商业上购买的HLA-DR特异性单克隆抗体一起预温育后，阻抑Bl IgG的结合， 都证明了 IgG Bl对HLA-DR/DP的特异性(图。
用相似的方法，确定IgG Bll和Cll限定的抗原的特性。发现IgG Cll沉淀68kDa 的蛋白带，其被鉴定为B细胞受体μ链的膜结合形式(图3Α，泳道幻。IgG Bll沉淀90kDa 的蛋白带，其被鉴定为细胞内细胞粘附分子I(ICAM-I)(图3A，泳道2)。利用购买获得的抗体，通过MS-MS分析、抗体阻抑研究(图3B)和western印迹分析(数据未显示)，证实了 IgG Bll对ICAM-I以及Cll IgG对IgM的特异性。
利用scFv和用于免疫沉淀的抗His包被的磁微珠，测定克隆B10、C10和G12的特异性。三个scFv克隆沉淀了 68kDa的蛋白条带，而且含有这些条带的胰蛋白酶消化的凝胶切片的MS分析，表明它们对表面IgM的特异性。推测这些抗体识别Ramos IgM独特型，因为它们中的任何一个都不与外周血B淋巴细胞或其他的IgM阳性B细胞系交叉反应。
实施例3 抗体的亲和性分析
Bl和Bll免疫球蛋白的体外碘化
用Iodogen 预包被的碘化管(Pierce)，在 PBS 中用[125IjNaI 碘化 lmg/ml 的 IgG1 Bl或IgG1 Bll蛋白10分钟。通过在PD-IO柱(Amersham Biosciences)上脱盐，除去游离的[125I]NaI，产生 1000-1600Cpm/ng 蛋白的特异放射活性。[125IjIgG1 Bl 和[125IjIgG1 Bll 用于测定抗体的亲和性。
IgG Bl和IgG Bll亲和性常数的测定
放射性碘标记的IgG Bl或IgG Bll与B淋巴瘤细胞DPBS_B_hIgG(含有0. 2mg/ml 人IgG的DPBS-B)在间断混合的情况下一起在冰上温育2小时。如果适合，在存在0. 2mg/ ml未标记的IgG Bl或IgG Bll蛋白的情况下，测定非特异性结合。分析进行3次重复。
将细胞装载于单个试管中的40% v/v Ficoll/DPBS-B垫(cushion)上，4°C、 400Xg离心6分钟。将样品在-80°C冰冻。将试管切割为两半后，分离细胞颗粒物和细胞上清液，并在在Y计数器(gamma counter)中分别分析125I-IgG蛋白含量。
如之前所述(Brixet al. J. Clin. Invest. 1998 ；102 :283-93)，依照 Rosenthal 等 (Anal Biochem 1967 ；20 :525-32)、Bylund 禾口 Yamamura (Methods in Neurotransmitter Analysed. New York Raven Press Ltd. , 1990)以及 Marquardt (J. Soc. Indust. App 1. Math 1963 ；11 :431-41),根据 Scatchard 图法分析(Scatchard plot analysis)，测定每个细胞的抗体亲和性常数(Kd值)和表位数。
在存在或不存在0. 2mg/ml对应的未标记的IgG蛋白的情况下，通过在4°C时，将放射性碘标记的蛋白与Raji细胞或Ramos细胞一起温育，表征与HLA-DR和ICAM-I结合的 IgG1和IgG Bll0通过从总的结合中减去非特异性结合(存在过量的未标记的IgG时的结合)，计算[125I] IgG与细胞表面的特异性结合。
在 30nM IgG Bl时，达到与Raji细胞的特异性IgG Bl结合的饱和。 Rosenthal-Scatchard 图分析(Rosenthal-Scatchard plot analysis)表明， 3nM解离常数和4000，000功能结合位点/Raji细胞，呈现二价表位-IgG相互作用(图5)。同样，测定 IgG Bll的解离常数为 0. 2nM和47，400个受体/Ramos细胞。
表1.完整的人Bi、Blljncil IgG抗体显示动态结合模式以及在各种B淋巴瘤细胞系中诱导细胞凋亡
权利要求
1.诱导靶细胞细胞凋亡的方法，包括下列步骤a.提供一种或多种展示细胞表面抗原ICAM-I的靶细胞；b.提供一种或多种结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM-I结合，且一旦结合 ICAM-I，则诱导所述靶细胞的细胞凋亡；c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的结合分子，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的结合分子是抗体分子。
3.诱导靶细胞细胞凋亡的方法，包括下列步骤a.提供一种或多种展示细胞表面抗原HLA-DR/DP和/或表面IgM的靶细胞；b.提供一种或多种抗体分子，其选择性地与细胞表面HLA-DR/DP和/或表面IgM结合， 且一旦结合HLA-DR/DP和/或表面IgM，则诱导所述靶细胞的细胞凋亡；c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的抗体分子，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
4.用于权利要求1或2所述方法中的结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM-I结合， 且一旦结合ICAM-I，则诱导所述靶细胞的细胞凋亡。
5.用于权利要求3所述方法中的抗体分子，其选择性地与靶细胞的细胞表面抗原结合，且一旦结合所述细胞表面抗原，则诱导所述靶细胞的细胞凋亡，其中所述细胞表面抗原是HLA-DR/DP和/或表面1#。
6.根据权利要求4所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体分子。
7.根据权利要求4或6所述的结合分子，其中所述细胞表面抗原是ICAM-I。
8.根据权利要求5所述的抗体分子，其中所述细胞表面抗原是HLA-DR/DP。
9.根据权利要求5所述的抗体分子，其中所述细胞表面抗原是表面IgM。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的结合分子或抗体分子，其中所述靶细胞是免疫细胞或上皮细胞。
11.根据权利要求10所述的结合分子或抗体分子，其中所述免疫细胞是B淋巴细胞。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的结合分子或抗体分子，其中所述靶细胞与疾病有关。
13.根据权利要求12所述的结合分子或抗体分子，其中所述疾病选自下组癌症；自身免疫病，其包括但不限于风湿性关节炎和SLE ；急性和慢性炎症性疾病；败血症以及包括但不限于HIV的传染性疾病。
14.根据权利要求13所述的结合分子或抗体分子，其中所述疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的癌症。
15.根据权利要求6-14中任一项所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体分子是IgG0
16.根据权利要求15所述的结合分子或抗体分子，其中所述单链抗体选自下组=IgGp IgG2、IgG3 或 IgG40
17.根据权利要求6-16中任一项所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体分子是人抗体或人源化抗体。
18.根据权利要求6-17中任一项所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体具有可变区，所述可变区具有图9-11中任一图的序列或具有其功能等同的同源物。
19.根据权利要求18所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体具有可变区，所述可变区具有图9的序列或其功能等同的同源物。
20.根据权利要求18所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体具有可变区，所述可变区具有图10的序列或其功能等同的同源物。
21.根据权利要求18所述的结合分子或抗体分子，其中所述抗体具有可变区，所述可变区具有图11的序列或其功能等同的同源物。
22.核酸，其具有编码权利要求4-21中任一项所述抗体分子的核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的核酸，其具有图9-11中任一图的核苷酸序列。
24.权利要求4-21中任一项所述的结合分子或抗体分子在诊断和/或治疗和/或预防疾病中的用途，所述诊断和/或治疗和/或预防要求破坏靶细胞。
25.权利要求4-21中任一项所述的结合分子或抗体分子在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，所述诊断和/或治疗和/或预防要求破坏靶细胞。
26.根据权利要求M或25所述的用途，其中所述待治疗的疾病选自下组癌症；自身免疫病，其包括但不限于风湿性关节炎和SLE ；急性和慢性炎症性疾病；败血症以及包括但不限于HIV的传染性疾病。
27.根据权利要求沈所述的用途，其中所述待治疗的疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的癌症。
28.根据权利要求M-27中任一项所述用途，其中所述结合分子或抗体分子如权利要求8或19所定义，所述待治疗的疾病如权利要求M或25所定义。
29.根据权利要求M-27中任一项所述的用途，其中所述的结合分子或抗体分子如权利要求7或20所定义，所述待治疗疾病是如权利要求27所定义的淋巴瘤。
30.根据权利要求M-27中任一项所述的用途，其中所述的结合分子或抗体分子如权利要求9或21所定义，所述待治疗疾病是如权利要求27所定义的淋巴瘤。
31.药物组合物，其包含权利要求4-21中任一项所定义的结合分子或抗体分子以及药学可接受载体、赋形剂或稀释剂。
32.体外诱导靶细胞细胞凋亡的方法，包括下列步骤a.提供一种或多种靶细胞；b.提供权利要求4-21中任一项所述的一种或多种结合分子或抗体分子；c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的结合分子或抗体分子，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)中提供的所述靶细胞是免疫细胞或上皮细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫细胞是B淋巴细胞。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述靶细胞与疾病有关。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病选自下组癌症；自身免疫病，其包括但不限于风湿性关节炎和SLE ；急性和慢性炎症性疾病；败血症以及包括但不限于HIV的传染性疾病。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的癌症。
38.体内诱导靶细胞细胞凋亡的方法，包括下列步骤a.提供一种或多种靶细胞；b.提供一种或多种权利要求4-21中任一项所述的结合分子或抗体分子；c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的结合分子或抗体分子，以诱导靶细胞的细胞凋亡。
39.根据权利要求38所述的方法，其中(a)中提供的所述的靶细胞是免疫细胞或上皮细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述免疫细胞是B淋巴细胞。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述靶细胞与疾病有关。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病选自下组癌症；自身免疫病，其包括但不限于风湿性关节炎和SLE ；急性和慢性炎症性疾病；败血症以及包括但不限于HIV的传染性疾病。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的癌症。
44.诱导细胞凋亡的方法，其基本上参照实施例和附图如本文所述。
45.诱导细胞凋亡的结合分子或抗体分子，其基本上参照实施例和附图如本文所述。
46.诱导细胞凋亡的结合分子或抗体分子的用途，其基本上参照实施例和附图如本文所述。
47.诱导细胞凋亡的药物组合物，其基本上参照实施例和附图如本文所述。
全文摘要
本发明涉及一种生物材料及其用途。本发明提供了结合分子，包括与靶细胞的细胞表面抗原选择性结合的抗体分子，其中，一旦结合分子结合细胞表面的抗原，则诱导靶细胞的凋亡。也提供了用于诱导细胞凋亡的药物组合物、方法，以及其用途。
文档编号C12N5/07GK102517252SQ20111035626
公开日2012年6月27日 申请日期2006年12月8日 优先权日2005年12月12日
发明者比约恩·弗伦多斯, 罗兰·卡尔松 申请人:生物发明国际公司