专利名称：带氨基酸的甘草酸衍生物、其制备方法及含有它们的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有预防及治疗肝损伤及护肝作用的带氨基酸的甘草酸衍生物、其制备方法、含有它们的药物组合物。
背景技术：
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)为豆科植物甘草的根和根状茎，具有和中缓急、润肺、解毒、调和诸药的功效。甘草中含有多种三萜皂苷以及黄酮，其根茎中甘草酸(结构式如下)的含量很高 研究表明，甘草酸类制剂能够有效降低慢性肝炎患者的丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、谷氨酰转肽酶水平，尤其对转氨酶水平降低更为显著，且无明显副作用；草酸类制剂能明显抑制肝纤维化作用。甘草酸类制剂治疗后HA，PC III的血清浓度明显降低，肝中胶原减少，肝纤维化程度减轻，肝脏病理学检查证实有明显好转。甘草酸类制剂在临床已作为治疗各种急、慢性肝炎的常用药物。
药代动力学实验表明，甘草酸由于它们的极性较大，口服吸收不完全，因此目前通常把甘草酸制成相应的盐，如甘草酸单铵盐、甘草酸二铵盐，以增加其水溶性，再制备成各类注射制剂，但是甘草酸的简单盐类的水溶性不是很好，给制剂带来了不便。同时甘草酸具有一定的毒性，静脉注射半数致死量为(LD50)588.84mg/Kg。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中甘草酸水溶性差，提供一种水溶性较好，毒性小、药理作用强的带氨基酸的甘草酸衍生物及其药用盐。
本发明的一个目的是提供一种带氨基酸的甘草酸衍生物及其药用盐。
本发明的另一目的是提供一种制备带氨基酸的甘草酸衍生物及其药用盐的方法。
本发明的再一个目的是提供带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐在制备治疗急慢性肝损伤的药物中的应用。
本发明还一个目的是提供带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐在制备护肝药物中的应用。
本发明提供了一种带氨基酸的甘草酸衍生物及其药用盐，结构式如下 其中R1为氨基酸或OH；R2为氨基酸或OH；条件是R1、R2不能同时为OH。
具体说，本发明的带氨基酸的甘草酸衍生物及其药用盐包括结构式如下的三种类型化合物第一种类型(化合物I)R1＝氨基酸(AA)R2＝OH；第二种类型(化合物II)R1＝R2＝氨基酸(AA)；第三种类型(化合物III)R1＝OH R2＝氨基酸(AA)。
这里所述的氨基酸为鸟氨酸、甲硫氨酸、门冬氨酸、门冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷酰胺、赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸等，优选甲硫氨酸或门冬氨酸。
本发明还提供了一种带氨基酸的甘草酸衍生物的药用盐，如钠盐、镁盐、钾盐、铵盐等，其中优选钠或铵盐。
本发明提供了一种制备甘草酸氨基酸衍生物及其药用盐的方法(1)第一种类型(化合物I)的制备以天然来源丰富的甘草酸为合成原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入活化剂，如乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯等，其中优选乙酰氯或草酰氯，后加入羧基被保护的氨基酸(如把羧基制成甲酯或乙酯)，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物；产物在碱溶液中水解即得化合物I甘草酸单氨基酸。(合成路线见
图1)(2)第二种类型(化合物II)的制备以天然来源丰富的甘草酸为合成原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入混合活化剂，如乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯与二氯亚砜混合物(摩尔比＝10∶1)等，其中优选乙酰氯或草酰氯与二氯亚砜的混合物，后加入羧基被保护的氨基酸(如把羧基制成甲酯或乙酯)，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物；产物在碱溶液中水解即得化合物II甘草酸三氨基酸。(合成路线见图1)(3)第三种类型(化合物III)的制备以天然来源丰富的甘草酸为合成原料，在乙醇或甲醇溶液中加入乙酰氯，制成甘草酸甲酯或乙酯，对30位羧基进行保护。后以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入混合活化剂，如乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯与二氯亚砜混合物(摩尔比＝10∶1)等，其中优选乙酰氯或草酰氯与二氯亚砜的混合物，后加入羧基被保护的氨基酸(如把羧基制成甲酯或乙酯)，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物；产物在碱溶液中水解即得化合物III甘草酸二氨基酸。(合成路线见图2)下图1，2中的GAA表示羧基被保护的氨基酸。
图1化合物I，II的合成路线
图2化合物III的合成路线将本发明的衍生物溶于适量的水中，与金属盐如Na2CO3、NaHCO3、MgCO3、K2CO3、(NH4)2CO3等无机盐反应，使溶液PH在8.0-8.2之间，制成该金属的盐，其钠、钾、镁、铵盐均易溶于水。
本发明还提供了一种药物组合物，其中含带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐作为有效成分，并含有药学上可接受的赋形剂。其中，带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐在药物组合物中的含量，按重量百分比计为0.25-100％，药学上可接受的赋形剂的含量为0-99.75％。具体的含量可以视剂型及制剂规格的不同而不同。
其中所说的药学上可接受的赋形剂是指药学领域常规的药物赋形剂，例如填充剂如蔗糖、淀粉、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、硫酸钙、糊精或磷酸钙等；粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素或糊精等；崩解剂如低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠或交联聚乙烯吡咯烷酮等；润滑剂、防粘剂如硬脂酸镁或滑石粉等；稀释剂；注射用水；注射用溶剂如乙醇、甘油、丙二醇或聚乙二醇等；增溶剂、湿润剂或乳化剂如聚山梨酯80或卵磷脂；稳定剂如肌酐或烟酰胺等；缓冲剂如乳酸或酒石酸等；针用填充剂、金属络合剂等。必要时，还可以在组合物中加入其它附加剂，如矫味剂、抗氧化剂等。
本发明公开的组合物的给药形式可以通过口服给药，可将其制成常规的固体制剂或液体制剂，如片剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸、散剂、口服液、冲剂、悬浮剂、颗粒剂或糖浆等。
本发明公开的带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐易溶水，所以更适合于制备成注射剂，如水针、冻干粉针剂、分装粉针剂。在临床可以静脉注射剂、肌内注射、皮下注射等方式给药，其中优选水针、冻干粉针剂。
例如，本发明化合物甘草酸单门冬氨酸的冻干粉针可由甘草酸单门冬氨酸5-100重量％，辅料0-95重量％组成，所述的辅料选自甘露醇、乳糖、氯化钠、低分子右旋糖苷等。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明还提供了带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐在制备治疗急慢性肝损伤的药物中的应用。同时还提供了带氨基酸的甘草酸衍生物或其药物在制备护肝药物中的应用。通过实验表明，带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐在相等的剂量比甘草酸简单盐类具有更好的药效。
本发明的带氨基酸的甘草酸衍生物和甘草酸同类药物相比较，增加了水溶性(以利于制成注射剂，提高生物利用度)，也增加活性，同时本发明的带氨基酸的甘草酸衍生物具有良好的安全性，具有比较小的毒性，由于护肝类药物一般治疗周期比较长，因而本发明对于肝病病人的治疗具有很大意义。因此本发明公开的带氨基酸的甘草酸衍生物及药用盐是一类具有良好开发前景的安全有效的护肝药物。
具体实施例方式
下面将描述本发明的几个实施例，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1化合物A(甘草酸单门冬氨酸)及其钠盐的制备 甘草酸单门冬氨酸氨基酸的缩合将甘草酸0.02mol(16.4g)溶解在500ml的无水二甲基甲酰胺(DMF)，加入缩合剂乙酰氯0.04mol，在室温下充分搅拌1小时后，加入0.04mol的门冬氨酸二甲酯(6.5g)，点板跟踪，约1小时反应完毕，加入0.5L水，用NaHCO3调节PH值至中性，冷却放置析出白色固体，过滤得到粗品17.4g(得率93％)，粗品无需进一步分离，可用于下一步反应。
甘草酸单门冬氨酸的制备将上述粗品加到500ml NaOH的水溶液(0.1mol/L)中，在室温下水解1小时，加酸调PH至6，产品上大孔树脂柱，用乙醇水溶液(50％)洗脱，产品用95％的乙醇重结晶得到白色粉末A，得率90％。
将甘草酸单门冬氨酸溶于适量的水中，缓慢加入4倍摩尔量的NaHCO3或2倍摩尔量的Na2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸单门冬氨酸钠盐。
化合物AC46H67NO19，白色粉末；m.p.253-254℃；ESI-MS m/z938[M+H]+；1H NMR(D2O)δppm0.82，0.83，1.04，1.17，1.41，1.13，1.14(3H，each，s)，4.53(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.64(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.32(1H，m)，5.58(1H，s，H-12).
实施例2化合物B(甘草酸单甲硫氨酸)及其钠盐的制备 甘草酸单甲硫氨酸按实施例1的合成方法，将门冬氨酸二甲酯用甲硫氨酸单甲酯替换，可以得到化合物B及其钠盐。
化合物BC47H71NO17S，白色针状结晶；m.p.213-214℃；ESI-MS m/z954[M+H]+；1H NMR(D2O)δppm0.82，0.84，1.04，1.18，1.40，1.13，1.14(3H，each，s)，2.27(3H，s，SMe)，4.53(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.64(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.40(1H，m)，5.57(1H，s，H-12).
实施例3化合物C(甘草酸三门冬氨酸)及其钠盐的制备氨基酸的缩合将甘草酸0.02mol(16.4g)溶解在500ml的无水二甲基甲酰胺(DMF)，加入缩合剂乙酰氯和二氯亚砜的混合物(0.2mol+0.02mol)，在室温下充分搅拌1小时后，加入0.3mol的门冬氨酸二甲酯(48.3g)，点板跟踪，约1小时反应完毕，加入0.5L水，用NaHCO3调节PH值至中性，冷却放置析出白色固体，过滤得到粗品20.6g(得率85％)，粗品无需进一步分离，可用于下一步反应。
甘草酸三门冬氨酸的制备将上述粗品加到1500ml NaOH的水溶液(0.1mol/L)中，在室温下水解1小时，加酸调PH至6，产品上大孔树脂柱，用乙醇水溶液(60％)洗脱，产品用95％的乙醇重结晶得到白色粉末C，得率82％。
将甘草酸三门冬氨酸溶于适量的水中，缓慢加入6倍摩尔量的NaHCO3或3倍摩尔量的Na2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸三门冬氨酸钠盐。
化合物CC54H77N3O25，白色粉末；m.p.307-309℃；ESI-MS m/z1168[M+H]+；1H NMR(D2O)δppm0.82，0.84，1.04，1.18，1.41，1.13，1.14(3H，each，s)，4.50(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.67(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.27-4.33(3H，m)，5.60(1H，s，H-12).
实施例4化合物D(甘草酸三甲硫氨酸)及其钠盐的制备
按实施例3的合成方法，将门冬氨酸二甲酯用甲硫氨酸单甲酯替换，可以得到化合物D及其钠盐。
化合物DC57H89N3O19S3，白色针状结晶；m.p.332-334℃；ESI-MS m/z1216[M+H]+；1HNMR(D2O)δppm0.81，0.84，1.04，1.20，1.41，1.13，1.15(3H，each，s)，2.27-2.30(9H，3×SMe)，4.53(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.66(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.40-4.45(3H，m)，5.72(1H，s，H-12).
实施例5化合物E(甘草酸二门冬氨酸)及其钠盐的制备 30位羧基的保护将甘草酸溶于500ml的无水的甲醇中，加入0.03mol缩合剂乙酰氯，减压浓缩至100ml，冷却放置析出白色针晶，重复上述操作，得到甘草酸单甲酯，得率80％。
氨基酸的缩合将甘草酸单甲酯0.02mol(16.7g)溶解在500ml的无水二甲基甲酰胺(DMF)，加入缩合剂乙酰氯和二氯亚砜的混合物(0.2mol+0.02mol)，在室温下充分搅拌1小时后，加入0.3mol的门冬氨酸二甲酯(48.3g)，点板跟踪，约1小时反应完毕，加入0.5L水，用NaHCO3调节PH值至中性，冷却放置析出白色固体，过滤得到粗品19.5g(得率87％)，粗品无需进一步分离，可用于下一步反应。
甘草酸二门冬氨酸的制备将上述粗品加到1500ml NaOH的水溶液(0.1mol/L)中，在室温下水解1小时，加酸调PH至6，产品上大孔树脂柱，用乙醇水溶液(60％)洗脱，产品用95％的乙醇重结晶得到白色粉末C，得率90％。
将甘草酸二门冬氨酸溶于适量的水中，缓慢加入5倍摩尔量的NaHCO3或2.5倍摩尔量的Na2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸二门冬氨酸钠盐。
化合物EC50H72N2O22。白色粉末；m.p.277-279℃；ESI-MS m/z1053[M+H]+；1H NMR(D2O)δppm0.80，0.86，1.04，1.18，1.41，1.12，1.14(3H，each，s)，4.53(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.62(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.30-4.33(2H，m)，5.63(1H，s，H-12).
实施例6化合物F(甘草酸二甲硫氨酸)及其钠盐的制备 按实施例5的合成方法，将门冬氨酸二甲酯用甲硫氨酸单甲酯替换，可以得到化合物F及其钠盐。
化合物FC52H80N2O18S2，白色粉末；m.p.306-308℃；ESI-MS m/z1085[M+H]+；1H NMR(D2O)δppm0.82，0.84，1.04，1.18，1.41，1.13，1.14(3H，each，s)，2.27(3H，s，SMe)，2.30(3H，s，SMe)，4.53(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.64(1H，d，J＝7.5Hz，H-1″)，4.37-4.43(2H，m)，5.57(1H，s，H-12).
实施例7甘草酸单门冬氨酸钠盐(以下简称化合物ANa)的药效学和毒性实验以常规方法进行药效学与毒性试验，其中化合物ANa对D-氨基半乳糖引起的大鼠急性肝损伤的治疗作用见表1，实验表明化合物ANa能明显抑制血清转氨酶增高和肝细胞坏死，且呈剂量依赖性关系，并且在同等剂量下优于天然甘草酸单氨盐。
表1化合物C对D-氨基半乳糖引起的大鼠急性肝损伤的治疗作用
AlaAT谷丙转氨酶；AspAT谷酰转氨酶；AP＜0.01；BP＞0.05与中毒组对照组比较CP＜0.05与甘草酸单氨盐对照组比较表2、3为化合物ANa对CCl4引起大鼠慢性肝损伤的治疗作用，实验表明，化合物ANa能明显抑制慢性肝损伤的进展，使血清转氨酶降低、白蛋白增高，并抑制血清唾液酸/透明质酸及肝组织羟脯氨酸的水平，且呈剂量依赖。实验数据表明化合物ANa对慢性肝损伤具有保护作用，且作用强于相同剂量的甘草酸单铵盐。
表2为化合物ANa对CCl4引起的大鼠慢性肝损伤的治疗作用
AlaAT谷丙转氨酶；AspAT谷酰转氨酶；AP＜0.01；BP＜0.05与中毒对照组比较CP＜0.05与甘草酸单氨盐对照组比较表3为化合物ANa对CCl4致大鼠肝硬化的治疗作用
NANA唾液酸；HA透明质酸；Hyp羟脯氨酸；S纤维化程度；AP＜0.01；BP＜0.05与中毒对照组比较；CP＜0.05与甘草酸单氨盐对照组比较表4、5为化合物ANa对D-氨基半乳糖(Gal)联用福氏全佐剂(FCA)诱发黑小鼠免疫性甘损伤的治疗作用。实验表明，化合物ANa能明显降低黑小鼠的死亡率，抑制血清转氨酶增高、γ-球蛋白水平及血浆NO浓度，并能改善肝细胞代谢障碍，促进白蛋白合成，且呈剂量依赖。实验表明，化合物ANa对宿主免疫反应形成的慢性肝炎具有良好的疗效，也优于相同剂量的甘草酸单铵盐。
表4为化合物ANa对Gal/FCA诱发黑小鼠免疫性肝损伤的治疗作用
AP＜0.01；BP＜0.05与中毒对照组比；表5为化合物ANa对Gal/FCA诱发黑小鼠免疫性肝损伤的治疗作用
NO一氧化氮；AP＜0.01；BP＜0.05与中毒对照组比较CP＜0.05与甘草酸单氨盐对照组比较表6的急性毒性实验数据表明，化合物ANa具有良好的安全性，其毒性小于甘草酸单铵盐。
表6化合物ANa的急性毒性
实施例7化合物甘草酸单门冬氨酸的冻干粉针50.0g化合物甘草酸单门冬氨酸，5.0g甘露醇，用注射用水溶解，用适量酸或碱调pH至3-7，加1‰活性炭(煮沸1h)除热原，过滤，继续加注射用水至规定体积，粗过滤后用0.22μ微孔无菌膜过滤，至溶液澄清度合格后，测定含量，计算每瓶装量约2ml，分装成1000瓶，灌装后按冻干工艺冷冻干燥，压盖、密封后包装。每瓶以甘草酸计50mg。经检验，标示含量为99.8％，水份小于3.0％，澄清度与澄明度均符合规定。
权利要求
1.一种结构式如下的带氨基酸的甘草酸化合物及其药用盐 其中R1为氨基酸或OH；R2为氨基酸或OH；条件是R1、R2不能同时为OH。
2.根据权利要求1所述的化合物及其药用盐，其中R1＝氨基酸，R2＝OH；R1＝R2＝氨基酸；或者R1＝OH，R2＝氨基酸。
3.根据权利要求2所述的化合物及其药用盐，其中所述的氨基酸为鸟氨酸、甲硫氨酸、门冬氨酸、门冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷酰胺、赖氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸等，优选甲硫氨酸或门冬氨酸。
4.根据权利要求3所述的化合物及其药用盐，其中R1为甲硫氨酸，R2为OH；R1为OH，R2为甲硫氨酸；R1和R2均为甲硫氨酸；R1为门冬氨酸，R2为OH；R1为OH，R2为门冬氨酸；R1和R2均为门冬氨酸。
5.根据权利要求1所述的化合物及其药用盐，其中所述的药用盐为钠盐、镁盐、钾盐、或铵盐。
6.一种制备根据权利要求1-5的化合物及其药用盐的方法，其包括以下步骤对于甘草酸单氨基酸合成而言，以天然来源的甘草酸为合成原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯活化剂，后加入羧基被保护的氨基酸，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物，产物在碱溶液中水解即得甘草酸单氨基酸，将甘草酸单氨基酸溶于水中，加入Na2CO3、NaHCO3、MgCO3、KxCO3或(NH4)2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸单氨基酸盐；对于甘草酸三氨基酸合成而言，以天然来源的甘草酸为合成原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯与二氯亚砜以摩尔比为10∶1的混合物活化剂，后加入羧基被保护的氨基酸，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物，产物在碱溶液中水解即得甘草酸三氨基酸，将甘草酸三氨基酸溶于水中，加入Na2CO3、NaHCO3、MgCO3、K2CO3或(NH4)2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸三氨基酸盐；对于甘草酸二氨基酸合成而言，以天然来源的甘草酸为合成原料，在醇溶液加入乙酰氯，使甘草酸的30位羧基酯化，后以二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入乙酰氯、草酰氯或苯甲酰氯与二氯亚砜以摩尔比＝10∶1的混合活化剂，后加入羧基被保护的氨基酸，在室温下反应完后，即可得甘草酸氨基酸缩合的产物，产物在碱溶液中水解即得甘草酸二氨基酸，将甘草酸二氨基酸溶于水中，加入Na2CO3、NaHCO3、MgCO3、K2CO3或(NH4)2CO3，使溶液PH在8.0-8.2之间，蒸去水即得甘草酸二氨基酸盐。
7.一种药物组合物，其含根据权利要求1-5的化合物或其药用盐作为有效成分，并含有药学上可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其为片剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸、散剂、口服液、冲剂、悬浮剂、颗粒剂、糖浆剂或注射剂剂型。
9.根据权利要求1-5所述的化合物及其药用盐在制备治疗急慢性肝损伤的药物中的应用。
10.根据权利要求1-5所述的化合物及其药用盐在制备护肝药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有预防及治疗肝损伤及护肝作用的新的带氨基酸的甘草酸衍生物、其制备方法、含有它们的药物组合物。本发明的带氨基酸的甘草酸衍生物或其药用盐易溶水，更适合于制备成注射剂，其药理作用强、毒性小，疗效显著。
文档编号A61P1/00GK1911954SQ20061012732
公开日2007年2月14日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者金耀, 占扎君, 张小永, 谭梓骏, 刘展欣 申请人:杭州耀恒医药科技有限公司