稳定的il-21组合物的制作方法

专利名称：：稳定的il-21组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包括IL-21和硫酸盐的组合物，例如药物组合物，和稳定IL-21的方法，该方法包括向包含所述肽的溶液中加入石克酸盐。
背景技术：
：IL-21首次公开于WO00/53761中。所述前肽为162个氨基酸残基的肽，公开的其序列作为在所述申请中的SEQIDNo:2。为方便起见，在本申请中重复该序列作为SEQIDNo:l。最初认为所述成熟肽为由SEQIDNo:l的氨基酸no32至162组成，然而，最近(WO04/112703)已经提出所述成熟肽实际上为氨基酸no30至162。IL-21为一种能活化B细胞、T细胞和NK细胞的细胞因子，并且已经提出IL-21及其变异体和类似物已经作为有效地治疗多种癌症类型的治疗剂，WO00/53761和WO03/103589。肽通常在液态经延长的时间是不稳定的，大量研究致力于提供满足药物组合物的稳定性需要的药物肽的制备。提供稳定的包括肽的药物组合物不容易，因此，仍然有发现提供包括IL-21的稳定的制剂的方法的组合物。WO04/112703公开了例如SEQIDNo:l的氨基酸30至162可以通过包括用高浓度的硫酸铵沉淀所述肽的方法分离。WO04/055168公开了用载体转染的细胞可以在包括硫酸铵的培养基中发酵，所述载体包括编码SEQIDNo:l的氨基酸no30至的聚核苦酸，所述聚核苦酸具有另外的N-末端Met。国际申请WO2004DK000686(/>开为WO05/35565)/>开了在功能化的PEG和功能化的IL-21之间的反应中使用硫酸铜作为催化剂以提供PEG基化的IL-21。发明概述本发明人出人意外地发现硫酸盐离子(SOr)的存在稳定了IL-21的结构，并增加了包括IL-21的组合物的稳定性。因此，在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐离子的组合物，特别是药物组合物，提供的任意铵离子(NH4+)在所述组合物中不能以硫酸盐的摩尔量的两倍摩尔量存在。在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐离子的组合物，特别是药物组合物，提供的任意铵离子(NH4+)在所述组合物中不能以硫酸盐的摩尔量的两倍摩尔量存在，并且条件是所述组合物不包括铜。在一个实施方案中，本发明提供稳定包括IL-21的组合物的方法，所述方法包括向所述组合物中加入石克酸盐。在一个实施方案中，本发明提供折叠或重折叠IL-21的方法，所述方法包括向未折叠的或部分折叠的IL-21中加入石克酸盐。在一个实施方案中，本发明提供纯化IL-21的方法，所述方法包括使色谱材料与包括IL-21和硫酸盐的组合物接触。在一个实施方案中，本发明提供结晶IL-21的方法，所述方法包括向包括IL-21的组合物中加入辟,酸盐。在一个实施方案中，本发明涉及治疗方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及IL-21和^L酸盐在制备药物中的用途。在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐离子的药物组合物。图1:结合在不同的pH的IL-21的1-苯胺萘基(Amlmonaphtalene)-8-磺酸(ANS)。所有的样品包含0.05mg/ml(3.2^M)IL-21、10mM緩冲齐'J(其中缓冲剂和pH显示在图中)，和当指出时，50mM的Na2S〇4。恰在测定前加入16jiM的ANS。图2:在pH2.0的加入或不加入50mM的硫酸盐的磷酸盐緩冲液中，IL-21的Far-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图3A:在pH5.3的或不加入50mM的石克酸盐的组氨酸li冲液中，IL-21的Far-UV圓二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图3B:在pH5.3的加入或不加入50mM的硫酸盐的乙酸盐緩冲液中，IL-21的Far-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图4:在pH6.0的加入或不加入50mM的硫酸盐的磷酸緩冲液中，IL-21的Far-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图5:在不加入碌u酸盐下，在pH2.0至6.0下，IL-21的Far-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图6:在加入50mM的碌^酸盐下，在pH2.0至6.0下，IL-21的Far-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图7:在pH2.0的加入或不加入50mM的硫酸盐的磷酸盐缓冲液中，IL-21的Near-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图8A:在pH5.3的加入或不加入50mM的碌,酸盐的组氨酸lt冲液中，IL-21的Near-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图8B:在pH5.3的加入或不加入50mM的石克酸盐的乙酸盐緩冲液中，IL-21的Near-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图9:在pH6.0的加入50mM的硫酸盐的磷酸缓冲液中，IL-21的Near-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度为10mg/ml。图10:在pH5.3的加入或不加入50mM的辟u酸钠的组氨酸缓冲液中，IL-21的毛细管DSC。图11:表1的数据描绘成的图。图12:在pH2的50mM的磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐和甲酸盐緩沖液中，IL-21的Near-UV圆二色性谱。蛋白质的浓度2mgZml。定义如本文使用的化合物的"治疗有效量"指足够治愈、减轻或部分抑制给定的疾病及其并发症的临床表现的量。将能够达到这一点的量定义为"治疗有效量"。用于每种目的的有效量将取决于例如疾病或损伤的严重行以及受试者的体重、性别、年龄和身体状况。应当理解确定适当的剂量可以使用常规实验通过构建有价值的模型和测定模型中的不同点获得，其都在经过训练的医师或兽医的常规技术之内。如本文使用的术语"治疗"指为了抗击病症比如疾病或障碍对患者的处理和护理。该术语指包括对于给定的病症(患者经受该病症)广谱的治疗，比如给药活性化合物以减轻所述症状或并发症，延迟所述疾病、障碍或病症的发展，减轻或緩解所述症状和并发症，和/或治愈或消除所述疾病、障碍或病症，以及预防所述病症，其中预防应当理解为为了抗击所述疾病、病症或障碍的目的对患者的处理和护理，并且所述预防包括给药活性化合物以预防所述症状或并发症的发作。要治疗的患者优选为哺乳动物，特别是人类，但是其也可包括动物，比如狗、猫、母牛、羊和猪。尽管如此，应当认识到治疗方案和预防(prophylactic或preventative)方案代表本发明的不同方面。
发明内容在此，IL-21意味着指a)具有如在SEQIDNo:l中定义的序列的肽；b)具有SEQIDNo:l的氨基酸no32-162定义的序列的肽；c)具有SEQIDNo:l的氨基酸no30-162定义的序列的肽；或d)a)、b)和c)中任一的变异体。变异体应理解为由下述获得的化合物通过用另一种天然的或非天然的氨基酸置换IL-21序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或通过给IL-21序列加入一个或多个天然的或非天然的氨基酸；和/或通过从IL-21序列中删除一个或多个氨基酸残基，其中在这些步骤中的任一个之后可任选地进行一个或多个氨基酸残基的进一步衍生化。特别地，在一定意义上，用来自相同组的另一个氨基酸残基，即具有类似的性质的另一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基的这样的置换是保护性的。基于它们的性质，通常可将氨基酸分成下列几组碱性氨基酸(比如精氨酸和赖氨酸)、酸性氨基酸(比如谷氨酸和门冬氨酸)、极性氨基酸(比如谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(比如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、曱石克氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小的氨基酸(比如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。在一个实施方案中，所述变异体具有与a)、b)或c)至少80%,比如至少85%，比如至少90%，比如至少95%的同一性。特别地，所述变异体具有至少20%，比如至少40%,比如至少60%，比如至少80%，比如至少90%，比如至少95。/。的a)、b)或c)的活性，如在本文中测定I中确定的。如本领域已知的术语"同一性"指两个或多个肽的序列之间的关系，如通过比较所述序列确定。在本领域，"同一性"也指肽之间的序列相关性，如通过两个或多个氨基酸残基4连(strings)之间的配对lt确定。"同一性"测定4交小的两个或多个具有间隙对准(gapalignments)(如果有的话)序列之间相同配对的百分数，其是通过特定的数学模型或计算机程序(即"算法")进行。相关蛋白的同一性可以用已知的方法容易地计算出。这样的方法包括，但不限于，在ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Parti,Griffm，A.M.,和Griffm,H.G.,eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysismMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，J.,eds.，M.StocktonPress,NewYork,1991;和Carillo等人.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)中描述的那些。测定同一性的优选的方法经设计用于*合出测定的序列之间的最大配对。测定同一性的方法为在公众可获得的计算机程序中描绘的。测定两个序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人.，Nucl.Acid.Res.，12:387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.),BLASTP,BLASTN和FASTA(Altschul等人.，丄Mol.Biol.,215:403-410(1990))。所述BLASTX程序为7>众从BiotechnologyInformation(NCBI)的NationalCenter及其它来源(BLASTManual，Altschul等人，NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894;Altschul等人，supra)可获得的。众所周知的SmithWaterman算法也可用于测定同一't"生。例^口，<吏用i十算才几算；去GAP(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin,Madison，Wis),定位要测定序列同一'性百分比的两种蛋白质用于它们相应的氨基酸的最佳配对("配对跨度(matchedspan)",j口用所述算法测定)。间隙打开处罚(gapopeningpenalty)(其为计算如3次的平均斜线(averagediagonal);所述"平均斜线"为比较使用的模型的斜线的平均值；所述"斜线"为通过特定的比较模型配对的分配给每个完全的氨基酸得分数或数字)和间隙扩展处罚(gapextensionpenalty)(其为所述间隙打开处罚的通常{分数(1/10)}次数)以及比较模型比如PAM250或BLOSUM62与所述算法一起使用。所述算法也使用标准的比较模型(参见Dayhoff等人.，AtlasofProtemSequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978)forthePAM250comparisonmatrix;Hemkoff等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:10915画10919(1992)fortheBLOSUM62comparisonmatrix)。用于蛋白质序列比较的优选的参数包括下述的算法Needleman等人,J.Mol.Biol,48:443-453(1970);比较模型BLOSUM62，来自Hemkoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919(1992);GapPenalty:12,GapLengthPenalty:4，ThresholdofSimilarity:0。所述GAP程序对上述参数有用。前述的参数为使用所述GAP算法用于肽比较(与用于末段间隙的无处罚(nopenalty)—起)的缺省参数。在一个实施方案中，通过向上述的序列a)、b)和c)中任一个累加五个氨基酸，比如一个、两个、三个、四个或五个获得的，特别地，加至N-末端。特别提及的为由c)(即SEQIDNo:l的氨基酸30-162)与加至其N-末端的另一个Met组成，SEQIDNo:2。本发明也包括本发明的组合物，其包括上述讨论的已经进一步衍生化的IL-21变异体，所述衍生化例如通过共价连接PEG或亲脂性取代基，例如如在WO05/035565中描述的。在一个实施方案中，本发明的组合物不包括以硫酸盐的摩尔量的两倍摩尔量存在的铵。当铵为一种酸时，其量将取决于所述溶液的pH;在高pH，所述铵将以氨(NH3)存在。应当理解在本文中，铵的量将以氨和铵的总量计。按类似的方式，硫酸盐的量取决于pH。在低pH，硫酸盐以质子化的形式HSCV存在。应当理解在本文中，硫酸盐的量将以硫酸盐和质子化的形式的总量计。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物不包括铵。应当理解这意味着本发明的组合物不包括高于痕量水平的铜。在本发明中使用的硫酸盐离子可能基本上来自任何硫酸盐。当然，某些区域或工业可对所述盐有特定的需求，其也必须满足这一需求。例如，制药工业可要求磁^酸盐为药学可4妻受的盐。药学可4妻受的石克酸盐包括金属盐，比如硫酸锂、硫酸钠、硫酸锌、硫酸钙、硫酸钾和硫酸镁，和烷基化的铵盐，比如甲基铵-、二甲基铵、三曱基铵-、乙基铵-、三乙基铵-、羟基乙基铵-、二乙基铵-、丁基铵-和四甲基铵硫酸盐。上述盐的某些以包括以包括不同量的晶体水的多于一个形式存在。在本发明中可使用这些形式中的任一个，特别提及的包括7琉酸钠。在一个实施方案中，本发明的组合物不包括铜。应当理解这意味着本发明的组合物不包括高于痕量水平的铜。在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐的药物组合物，条件是所述氨以硫酸盐的摩尔量的两倍摩尔量存在。在一个实施方案中，本发明提供包括IL-21和硫酸盐的药物组合物，条件是所述氨以硫酸盐的摩尔量的两倍摩尔量存在，进一步的条件是所述组合物不包括铜。除了IL-21和硫酸盐之外，所述药物组合物也可包括本领域已知的其它赋形剂，比如緩冲剂、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂、足够降低所述组合物储存期间蛋白质凝聚形成的氨基酸基质、表面活性剂、润湿剂、乳化剂、抗氧剂、填充剂、金属离子、油脂性赋形剂、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子。这些赋形剂的用途是本领域技术人员众所周知的，描述在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，2000中。在一个实施方案中，本发明的药物组合物不包括铵。应当理解这意味着本发明的组合物不包括高于痕量水平的铜。本发明的药物组合物可以以多种剂型^会药，比如，例如溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合乳剂、泡沫剂、药膏、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、洗剂、胶嚢例如硬明胶胶嚢和软明胶胶嚢、栓剂、直肠胶嚢、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂例如冷冻干燥粉末、气雾剂、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用洗剂、阴道栓、阴道环、阴道软膏剂、;主射〉容'液、原、<立專争4匕〉容液(insitutransformingsolutions)4列3口原、4立)疑月交、原位j疑结、原卩立:沉淀、原卩立结晶、*俞注溶'液和才直入物。本发明的药物组合物可以通过几种给药途径给药至需要这样的治疗的患者，比如例如通过舌、舌下、口腔、口内、口服、胃和肠内、鼻腔、肺例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮、皮肤、透皮、阴道、直肠、眼部例如穿过结膜、输尿管和非肠道给药。非肠道给药可以利用注射器通过皮下、肌内、腹膜内或静脉注射进行，所述注射器任选笔样注射器。另外，非肠道给药可以利用输液泵进行。一个进一步的选择是本发明的组合物可以是用于以鼻腔或肺喷雾形式给药的溶液剂或混悬剂。作为更进一步的选择，本发明的药物组合物也可以适合于透皮给药，例如通过无针注射或从贴剂，任选离子渗透贴剂，或经粘膜例如口腔给药。在包括IL-21和硫酸盐的本发明的药物组合物中，IL-21可以按至多500mg/ml的量存在。特别地，IL-21可以^安5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml或至多其的浓度存在。IL-21在石克酸盐浓度高于lmM,t匕3口高于5mM，比^口高于7mM,比^口高于10mM、比如高于20mM下稳定。实际上，可以存在至多500mM,比如至多150mM,比如至多75mM,比如至多50mM的石危酸盐。所述石克酸盐浓度的上限由选择的硫酸盐的溶解度确定。在本发明的许多应用中，期望地是具有等渗的或接近等渗的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物为20%等渗至120%等渗。在一个实施方案中，所述硫酸盐的浓度为约1至约100mM。在一个实施方案中，所述硫酸盐的浓度为约20至约100mM。在进一步的实施方案中，所述石克酸盐的浓度选自约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM和约100mM.。本发明的药物组合物例如也可以是非等渗的，并且可以被制成等渗的，例如通过在纟会药前稀释。这可以^吏销售更浓的药物组合物，然后，通过例如医师或患者在给药前制成等渗的。在本发明的一个实施方案中，将氯化物加入本发明的组合物。特别地，可以加入至多150mM的氯化物。本发明的药物组合物的优选为2至8之间，特别提及包括具有pH为4至5之间，比如例如5.3的药物组合物。本发明的发明的一个实例由10mg/ml的SEQIDNo:2定义的肽、10mM的Na2S04，用组氨酸緩冲至pH5.3组成。典型地，通过制备测定组合物(在本发明的组合物的情况下)和参照组合物(在相同的组合物但没有石克酸盐的情况下)评价特定的赋形剂对药物组合物的稳定性的影响。然后，将这两种组合物储存在受控条件下，例如在4(TC下2周，在25。C下2个月或在5。C下6个月。在储存后，在适宜的测定中测定在所述两种组合物中感兴趣的肽的剩余活性。对于包括IL-21的组合物，可以使用在本文实施例11中描述的聚集测定。也可以应用测定IL-21或降解产物的量/活性的其它测定。本发明的一个实施方案涉及硫酸盐用于促进折叠或重折叠未折叠的或部分未折叠的IL-21中的用途。特別地，硫酸盐离子的加入可增加折叠或固定正确折叠的速度。如果IL-21为通过特定微生物的发酵产生，所述微生物不能正确地折叠所述肽，所述肽可以表示为排除包括未折叠的或部分未4斤叠的肽的部分。在所述包涵体s皮裂后，可以在包括加入石克酸盐离子的过程中获得正确折叠的肽。硫酸盐离子的存在引起IL-21的结构更紧密和稳定。这可以利用在IL-21的色谱纯化中以改变所述肽的色谱洗脱特征，特别是给出更尖和更明确定义的洗脱峰。加入石克酸盐的有益效果可以在各种色谱法，比如离子交换色谱法(阳离子交换色谱和阴离子交换色谱法)和疏水性相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法中看到。较尖的洗脱峰在其中期望分离靠近洗脱峰的位置是有利的，但是通常当之后将所述洗脱肽收集在小体积中时，其使进一步的下游加工更加简单和便宜。根据本发明，硫酸盐以至少约3mM，比如至少约7，比如至少约10mM存在。实际上，预料到仅应用的硫酸盐的溶解度限定了所述硫酸盐浓度的上限。特別提及的包括作为；克酸盐的来源的；克酸钠。本发明的色谱方法的pH可以为从1至10,比如从2至9，比如从3至8，比如从4至7,比如从5至6。许多不同的色谱材料是本领域已知的，实例包括阴离子交换色谱材料、阳离子交换色谱材料、疏水性相互作用材料和尺寸排阻色谱材料。更明确定义的结构为更易于结晶的，因此，本发明也提供硫酸盐用于改善IL-21的结晶的用途。在本文中，"改善"可以是结晶速度的增加，或者提供更适用于例如X射线衍射研究的晶体的增加。IL-21已经被提议用于治疗多种癌症或胂瘤疾病或障碍。在一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药治疗有效量的包括IL-21和硫酸盐的本发明的组合物。特别提及的包括转移性恶性黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤和白血病。在本发明的更具体的方面，术语"肿瘤性障碍，，、"癌症"应当理解为指各种形式的瘤细胞生长，包括膀胱瘤和实体瘤、骨骨肿瘤和软组织肿瘤，包括良性肺瘤和恶性肿瘤，包括在肛门组织的肿瘤、胆管瘤、膀胱瘤、血细胞瘤、骨肿瘤、骨癌(继发的(secondary))、肠(结肠&直肠)癌、脑癌、脑癌(继发的)、乳房癌、乳房癌(继发的)、类癌、子宫颈癌、儿童癌症(children'scancers)、眼睛癌、食道癌(食管癌)、头&颈癌、卡波济(氏)肉瘤、肾癌、喉癌、白血病(急性成淋巴细胞的)、白血病(急性脊髓的)、白血病(慢性淋巴细胞的)、白血病(慢性脊髓的)、白血病(其它的)、肝癌、肝癌(继发的)、月申癌、肺癌(继发的)、淋巴结癌(继发的)、淋巴瘤(霍奇金氏)、淋巴瘤(非霍奇金氏)、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卯巢瘤、胰腺癌、阴茎癌、.前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、曱状腺癌、未知的原发胂瘤、阴道癌、外阴癌、子宫癌。软组织肺瘤包括良性神经鞘瘤单体性、韧带样纤维瘤、脂肪胚细胞瘤、脂肪瘤、子宫平滑肌瘤、明细胞肉瘤、皮肤纤维肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液样软骨肉瘤、脂肪肉瘤粘液样、脂肪肉瘤、高度分化的肉瘤、腺泡状横紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。特定的骨肿瘤包括非骨化性纤维瘤、单房性骨嚢、内生软骨瘤、动脉瘤样骨嚢肿、成骨细胞瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨化纤维瘤和釉质瘤、巨细胞瘤、纤维发育异常、尤因肉瘤、嗜酸细胞肉芽肿、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和转移癌。白血病指由骨髓生成的白细胞的癌症。这包括，但不限于四种主要类型的白血病急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性成髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞白血病(CML)。而且，IL-21可用于治疗各种非转移性和转移性阶段的癌症，比如"阶段1"局限性的癌症(限于发病器官)；"阶段2"局部癌症；"阶段3"广泛的；和"阶段4"广泛弥散性癌症。IL-21也参与治疗病毒感染，比如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷性病毒、呼吸道合胞病毒、Eppstein-Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒、疱渗病毒和严重的急性呼吸综合征。在一个实施方案中，本发明涉及IL-21和石克酸盐在制备治疗癌症的药物中的用途。特別提及的包括上述列出的癌症。在此，将本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利以其全部内容引入作为参考，并且将其引入至如同每篇参考文献被分别和特别地指出引入作为参考和在本文中全部阐述的相同程度(达到法律许可的最大程度)，不考虑在本文中别处说明的特定文件的任意分别提供的引入。在描述本发明的上下文中的使用的术语"一个"和"所述的"和类似的指示物将被解释为包括单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文有明显的矛盾。例如，短语"化合物"应当理解为指本发明的多个"化合物"或特别描述的方面，除非另有说明。如，对于特定的因素或测定提供的所有精确示例'性的值可被认为也提供相应的近似测定，当适当时，用"约"修饰)。对于成分使用术语"包括"、"具有"或"包含"的本发明的任何方面的本文说明意味着提供用于本发明的类似方面"由其组成"、"基本上由其组成"或"基本上包括"那些特定成分的支持，除非另有说明或与上下文明显矛盾(例如，本文描述的组合物如包括一种特定成分应当理解为也描述了由所述成分组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。测定1可以在适用鼠的Bafi细胞的细胞的生物测定中分析IL-21的活性，所述鼠的Baf3细胞被稳定地转染以表达人类IL-21R和Stat-连接的荧光素酶受体构建物。Baf3细胞内源性表达活性IL-21受体络合物的gc部分。在刺激前，将所述Baf3/hlL-21R受体细胞系在不含IL-3的培养基中受饿(starved)。使用一定范围浓度的IL-21蛋白质可获得计算IC50浓度的剂量-反应曲线。所述Baf3细月包描述在PalaciosR，Nature.(5964),126-31(1984)中，并且其可由在RIKENBioResourceCenter的CellBank(http:〃www2.brc.riken.jp/labZcell/detail.cgice11—no=RCB0805)获得。实施例在下述实施例，"IL-21"指由SEQIDNo:2确定的肽。实施例1ANS荧光ANS(l-苯胺萘基-8-磺酸)结合蛋白的疏水性部位。更强的荧光强度显示出更多的ANS分子结合所述蛋白质。这又表明结构化的分子更少，因为更少结构化的蛋白质将暴露更多的疏水性部位。较弱的荧光强度表明更紧密的蛋白质结构，其暴露了ANS可结合的较少的疏水性部位。所有的样品包含0.05mg/ml(3.2)iM)的IL画21、10mM的缓冲剂(其中缓冲剂和pH显示在图中)和当指出时50mM的Na2S04。在测定前加入16jiM的ANS。在装有恒温的电池(VananCarySmglecellPeltier附件)的VarianCaryEclipse荧光分光光度计上记录ANS荧光光谱。荧光分光光度计的设置和性能如下在390nm刺激样品。将激发波长和发射波长狭缝设置在5nm，并且将光电倍增管(PMT)和温度分别设置在"高"和20°C。收集在400-700nm的发射光谱。对于每个样品，收集3次光谱，计算平均值。用发射光谱值减去适当的空白值后计算一阶导数来评价发射最大波长(X腿x)。图1中的数据显示出对于在不同pH和不同缓冲液中的IL-21的ANS光谱。该数据清楚地显示出随着pH增加IL-21获得了更紧密的结构。特别地，加入硫酸盐引起IL-21结构的紧密性明显地增加。因此，得出硫酸盐稳定了IL-21的结构。实施例2Far-UV圆二色性(CD)蛋白的Far-UV圆二色性谱反映出肽键的不对称，其依次反映出所述蛋白质的二级结构。具有突出a-螺旋构型的蛋白质的Far-UV光谱的特征在于两个最小的分离在208和222nm，在190-195nm部位有正峰值，从负区域至高于172nm的正区域有交叉点(cross-over)。研究了在不同pH下硫酸盐对1L-21的二级结构的作用。在装有温度控制器的JascoPTC-4238分光偏振计上记录该光谱。显示的扫描表示三个光谱的平均值，所述光谱为在0.1nm间隔，响应时间为4秒，扫描速率为20nm/分钟下收集资料获得的。将所述光谱用空白校正，并且所述光谱为从180至250nm获得。蛋白质的浓度为10mg/ml。图2显示了在pH2的加入或不加入硫酸盐的磷酸盐緩冲液中的光谱。在不含有硫酸盐的pH2下，IL-21存在a-螺旋和随意盘绕(coil)之间的平4軒。然而，石克酸盐的加入明显有助于cc螺;旋的巩固。图3和4显示了特别是在pH5.3和在pH6.0，加入硫酸盐增加了109-195nm的峰值，其显示出a螺旋结构的量增加。图2-4的数据也出现在图5和6中，其中图5显示了在没有辟^酸盐的pH2-6的IL-21的far-UV圆二色性谱，而图6显示了在加入石克酸盐下在相同的pH间隔IL-21的far-UV圆二色性谱。在图5和6的比较中，其表明加入硫酸盐使IL-21的二级结构在宽pH范围更均匀。因此，得出向IL-21组合物加入硫酸盐增加了在宽pH范围下IL-21结构的a螺旋含量。实施例3Near-UV圓二色性(CD)Near-UVCD反映了蛋白质的三级结构。near-UV光谱的振幅越高，蛋白质的三级结构的量越高。在加入或不加入石克酸盐下，在多种緩冲液中在pH2至6下获得IL-21的near-UV光谱。在装有温度控制器的JascoPTC-4238分光偏振计上记录该光谱。显示的扫描表示三次光谱的平均值，所述光谱为通过在0.1nm间隔，响应时间为4秒，扫描速率为20nm/分钟收集资料获得。将所述光谱用空白校正，并且所述光谱为从250至350nm获得。蛋白质的浓度为10mg/ml，与图12中显示的实验不同，其中所述蛋白质的浓度was2mg/ml。图7显示了加入或不加入50mM硫酸盐下，在pH2(磷酸盐緩冲液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圆二色性谱。该图清楚地表明加入石克酸盐增加了IL-21的三级结构的量。图8A显示了加入或不加入50mM硫酸盐下，在pH5.3(组氨酸緩冲液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圆二色性谱。该图清楚地表明加入硫酸盐增加了IL-21的三级结构的量。图8B显示了加入或不加入50mM石克酸盐下，在pH5.3(乙酸盐緩冲液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV光谱。该图清楚地表明加入硫酸盐增加了IL-21的三级结构的量。.显然其形成了在图8A和8B中描述的数据，该数据与缓冲液无关，加入硫酸盐导致IL-21的三级结构的量增加。图9显示了加入或不加入50mM硫酸盐下，在pH6.0(磷酸盐緩冲液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圓二色性i普。该图显示出在该pH,IL-21的三l^结构的量有少量、^a明显的增大。图12显示出在多种缓冲液的pH中，IL-21在2mg/ml的nearUV圆二色性谱。包含硫酸盐的缓沖液的圆二色性谱与其它光谱明显不同，具有从弱阴性至更加正性的CD的改变。实施例4差示扫描量热法(DSC)差示扫描量热法测定蛋白质的折叠温度或解链温度。界限明确的、窄峰表示蛋白质的紧密和定义结构和结构紧密性，而宽峰表示更松散的结构。用VP-DSC热量计进4亍毛细管DSC。从10至ll(TC扫描样品，<吏用的扫描速率为3。C/分钟。.用作为参照的单独的緩冲液处理所述样品。从样品扫描中除去緩冲液-緩冲液参考曲线以得到最终样品的具体数据。所述样品包含10mg/ml的IL-21、10mM的pH5.3的组氨酸，和当指出时50m丄M的Na2S〇4。图10中的数据显示出向IL-21加入硫酸盐形成DSC扫描中峰的形态。这显示出硫酸盐增加了IL-21的结构紧密性。实施例5含有组氨酸10mM的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制剂的制将IL-212.4%(w/v)的4诸备溶液与组氨酸1.52%(w/v)的储备溶液混合。用HCl和NaOH调节所述溶液的pH至5.3，加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22pm过滤器过滤来灭菌所述制剂，将其无菌填充到无菌小瓶中。实施例6含有组氨酸10mM和多种含量的石克酸钠(3、10、50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的四种可溶性制剂的制备将IL-212.4%(w/v)的4诸备溶液与组氨酸1.52%(w/v)的^诸备溶液混合。加入硫酸钠10.6%(w/v)的储备溶液。用HCl和NaOH调节所述溶液的pH至5.3,加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22fim过滤器灭菌所述制剂，并将其无菌填充在无菌小瓶中。重复该过程四次，同时加入不同量的所述石克酸钠4诸备溶液。实施例7含有甘露醇4.7%(w/v)和组氨酸10mM的pH5.3的IL-2110mgZml的可溶性制剂的制备将IL-212.4%(w/v)的储备溶液与甘露醇23.6%(w/v)的储备溶液和组氨酸1.52%(w/v)的J诸备溶液混合。用HC1和NaOH调节所述溶液的pH至5.3,加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22]dm过滤器灭菌所述制剂，并将其无菌填充在无菌小瓶中。.实施例8含有甘露醇4.7%(w/v)、组氨酸10mM和可变量的碌u酸钠(3、10、50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制剂的制备将IL-212.4%(w/v)的储备溶液与甘露醇23.6%(w/v)的储备溶液和组氨酸1.52%(w/v)的储备溶液混合。加入硫酸钠10.6%(wZv)的储备溶液。用HC1和NaOH调节所述溶液的pH至5.3,加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22)um过滤器灭菌所述制剂，并将其无菌填充在无菌小瓶中。.重复该过程四次，同时加入不同量的所述石危酸钠4诸备溶液。实施例9含有组氨酸10mM、石克酸钠50mM和和多种含量的石危酉i钠(50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制剂的制备将IL-212.4%(w/v)的^f渚备溶液与组氨酸1.52%(w/v)的^f诸备溶液和氯化钠4.38%(w/v)的储备溶液混合。加入硫酸钠10.6%(w/v)的储备溶液。用HC1和NaOH调节所述溶液的pH至5.3，加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22pm过滤器灭菌所述制剂，并将其无菌填充在无菌小瓶中。重复该过程两次，同时加入不同量的所述氯化钠4诸备溶液。实施例10含有甘露醇4.7%(w/v)、组氨酸10mM和多种含量的氯化钠(50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制剂的制备将IL-212.4%(w/v)的储备溶液与甘露醇23.6%(w/v)的储备溶液、组氨酸1.52%(w/v)的储备溶液和氯化钠4.38%(w/v)的储备溶液混合。加入石克酸钠10.6%(w/v)的储备溶液。用HCl和NaOH调节所述溶液的pH至5.3，加入水以稀释所述制剂至最终体积。通过使用0.22^m过滤器灭菌所述制剂，并将其无菌填充在无菌小瓶中。重复该过程两次，同时加入不同含量的所述氯化钠储备溶液。实施例11储存稳定性将包含实施例5至11的制剂的小瓶置于不同温度下37°C、25°C、15°C、50°C、5。C和-20。C。在不同的时间点4是取用于分析的样品。通过尺寸排阻HPLC在TSK柱上测定在IL-21制剂中的"凝聚物"的成分(包括共价二聚物及其它高分子量杂质)。凝聚物的百分比是基于在IL-21的主峰洗脱之前洗脱的峰的总面积向多于所包括的容积内的总面积。使用作为参考的实施例5中的制剂(即，不含有硫酸盐或甘露醇的IL-21制剂)来标准化，将在37。C下储存1个月的样品的结果列在表1中。将其数据也描绘在图11中。表1在37。C下一个月，在实施例5-10中描述的IL-21制剂中标准化的凝聚形成。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表l(或在图11中描绘)的数据显示出硫酸盐对IL-21的储存稳定'l"生有积极的效果。该数据也显示出这一积极的效果取决于硫酸盐的浓度。而且，所述数据显示出氯化物对储存稳定性也具有积极的效果，而且该效果也取决于所述氯化物的浓度。最后，该数据显示出增加的稳定性效果是通过向IL-21组合物中加入硫酸盐和氯化物获得的。因此，确定通过在权利要求1.组合物，包括IL-21和硫酸盐，提供的任意铵离子，如果存在，不能以硫酸盐摩尔量的两倍摩尔量存在。2.权利要求1的组合物，其中所述硫酸盐的存在浓度为高于1mM。3.根据权利要求1或2的组合物，其中pH为约1至约10之间。4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-21的序列包4舌SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。5.根据权利要求4的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。6.根据权利要求5的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。7.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。8.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l。9.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。10.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。11.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述IL-2]的序列表示为SEQIDNo:2。12.根据权利要求l-ll中任一项的组合物，其中所述组合物为药物组合物。13.根据权利要求12的药物组合物，其中给药至患者的组合物是等渗的。14.根据权利要求l3的药物组合物，其中所述药物组合物是等渗的。15.根据权利要求1-14中任一项的组合物，其包括氯化物。铵。16.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>17.根据权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述组合物不包括铜。18.药物组合物，包括IL-21和硫酸盐离子。19.根据权利要求18的药物组合物，其中给药至患者的组合物是等渗的。20.根据权利要求19的药物组合物，其中所述药物组合物是等渗的。21.根据权利要求18-20中任一项的药物组合物，其中如果存在任意铵离子，其不能以硫酸盐摩尔量的两倍摩尔量存在。22.根据权利要求18-21中任一项的药物组合物，其包括氯化物。23.根据权利要求18-22中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物不包括铵。24.根据权利要求18-23中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物不包括铜。25.组合物，包括10mg/ml的IL-21、10mM的Na2SO4，并且用组氨酸缓冲至pH5.3。26.根据权利要求25的组合物，其中所述组合物为药物组合物。27.根据权利要求25或26的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。28.根据权利要求27的组合物，其中所迷IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。29.根据权利要求28的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo丄30.根据权利要求25或26的组合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。31.根据权利要求25或26的组合物为SEQIDNo:l。32.根据权利要求25或26的组合物为SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。33.根据权利要求25或26的组合物为SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。34.根据权利要求25或26的组合物为SEQIDNo:2。35.稳定包括IL-21的组合物的方法，所述方法包括向所述组合物其中所述IL-21的序歹'其中所述IL-21的序歹i其中所述IL-21的序歹'其中所述IL-22的序歹'表示中加入硫酸盐。36.重折叠溶液中未折叠的或部分折叠的IL-21的方法，所述方法包括向所述溶液中加入石克酸盐。37.纯化IL-21的方法，所述方法包括使IL-21和硫酸盐的溶液与色谱材料接触。38.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:375的氨基酸no32-162。39.根据权利要求38的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。40.根据权利要求39的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。41.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序歹包括SEQIDNo:2。42.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序歹为表示为SEQIDNo:l。43.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序歹表示为SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。44.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序歹表示为SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。45.根据权利要求35-37中任一项的方法，其中所述IL-21的序歹表示为SEQIDNo:2。46.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药治疗有效量的根据权利要求1-34中任一项的组合物。47.根据权利要求46的方法，其中所述癌症选自肾细胞癌、结肠直肠癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤。48.IL-21和硫酸盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。49.根据权利要求48的用途，其中所述癌症选自肾细胞癌、结肠直肠癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤。50.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。51.根据权利要求50的用途，其中所述IL-2]的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。52.根据权利要求51的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。53.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。54.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l。55.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。56.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。57.根据权利要求48-49中任一项的用途，其中所述IL-21的序列表示为SEQIDNo:2。全文摘要本发明提供包括IL-21和硫酸盐的组合物。文档编号A61K38/20GK101189024SQ200680019887公开日2008年5月28日申请日期2006年6月6日优先权日2005年6月6日发明者J·T·巴克林斯基,M·帕森申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司