专利名称：干扰素τ用于治疗白介素-10缺乏的用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于人类受试者中的白介素-10(IL-10)缺乏的治疗方法。
背景技术：
人类免疫系统具有多种天然的和适应性的免疫机制及免疫反应以维持健康状态。免疫应答通常分为体液应答和细胞介导的应答。广义上，体液免疫是指由包括浆细胞在内的B-细胞引起的抗体产生及作用。细胞免疫由包括T-细胞、单核细胞、巨噬细胞及组织细胞在内的细胞进行介导。T细胞和B细胞是淋巴细胞的两个大类，T细胞依据其各种功能或标记物可被进一步分类，如辅助型T细胞(Th)或者抑制型T细胞。辅助型T细胞可被分为不同的亚型，所述亚型根据它们的细胞因子产生谱(profile)区别。Th1型T细胞克隆产生白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)，而Th2细胞克隆分泌白介素-10、白介素-4和白介素-5。这两种Th细胞克隆都产生细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-3、以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三类Th细胞(Th0)同时产生白介素-2、干扰素-γ、白介素-4、白介素-5、肿瘤坏死因子-α、白介素-3以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
Th1和Th2细胞的不同的细胞因子产生模式反映了它们的辅助功能。Th1细胞主要涉及迟发型超敏反应(DTH)应答，而Th2细胞与抗体产生相关。由于抗体(Th2途径)和迟发型超敏(Th1途径)应答通常相互排斥，所以Th1和Th2细胞被认为具有交叉调控作用。由Th1细胞产生的干扰素-γ抑制Th2细胞的增殖，而由Th2细胞产生的白介素-10抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成，特别是抑制干扰素-γ和白介素-2的产生。
白介素-10是一种多能的细胞因子，对多种细胞群体具有潜在的作用，特别是对循环的和驻留的免疫细胞，因此在免疫调控和宿主防御方面具有广泛作用。能够刺激白介素-10内源性产生以介导免疫应答的试剂将有利于多种疾病和身体状况的治疗。
发明内容
一方面，本发明包括一种治疗方法，该方法包括鉴定患有或者可能患有白介素-10缺乏的人类受试者，以及给药干扰素-τ，相对于给药干扰素-τ前的白介素-10水平，所述干扰素-τ的给药量有效地提高血白介素-10水平。
在一个实施方式中，通过从受试者获得血液样品并分析该样品的白介素-10浓度来鉴定怀疑患有白介素-10缺乏的受试者。在另一个实施方式中，通过诊断典型特征在于白介素-10血液水平降低的身体状况来鉴定怀疑患有白介素-10缺乏的受试者。
在另一个实施方式中，除了白介素-10血液水平降低以外，被鉴定为患有白介素-10缺乏的受试者是无症状的。
在另一个实施方式中，在第一时间段内以第一剂量的干扰素-τ治疗受试者，接着在第一时间段过去之后测定血白介素-10浓度，在第二时间内给药第二剂量的干扰素-τ。在一个实施方式中，所述第二剂量小于第一剂量。在另一个实施方式中，第二剂量大于第一剂量。在又一个实施方式中，第一时间段比第二时间段短。通常，在另一个实施方式中，第一时间段约为一个月或者更短。
在另一个实施方式中，将干扰素-τ给药至受试者，该受试者处于发展成至少部分由白介素-10缺乏所引起的身体状况的危险中。
在另一个实施方式中，将干扰素-τ给药至受试者，该受试者经受由白介素-10缺乏所加剧的身体状况或者具有由白介素-10缺乏所加剧的症状。
在示例性的实施方式中，由血白介素-10水平降低所加剧的身体状况和/或症状包括自体免疫状况、病毒感染及特征在于炎症的状况。
在另一个实施方式中，通过与存在的自体免疫状况有关的身体症状来鉴定患有或者可能患有白介素-10缺乏的受试者。
在另一个实施方式中，通过与病毒感染有关的身体症状来鉴定患有或者可能患有白介素-10缺乏的受试者。
在另一个实施方式中，通过与特征在于发炎的状况有关的身体症状来鉴定患有或者可能患有白介素-10缺乏的受试者。
在另一个实施方式中，将干扰素-τ口服给药至受试者。仍然又一个实施方式中，剂量大于5×108单位/天，更优选剂量大于1×109单位/天。
在另一个实施方式中，所述方法包括在最初的时间段内给药干扰素-τ后，监测受试者的白介素-10水平，以确定白介素-10的水平是否得到提高作为最初给药干扰素-τ的结果。通过从受试者获得血液样品并分析该样品中的白介素-10浓度来实现所述监测。
在结合附图阅读以下本发明的详细描述后，将更充分地理解本发明的这些以及其它目的和特征。
图1是受试者在用干扰素-τ治疗的28天时间内的血清白介素-10浓度(以皮克/毫升计)与时间的函数图； 图2是白介素-10血清浓度与时间(以天数计)的函数图，三组，每组5名患者用不同剂量的干扰素τ治疗1-28天；组I0.2毫克干扰素τ(菱形)，组II0.6mg干扰素τ(圆形)，及组III1.8毫克干扰素τ(三角形)；以及 图3是血清白介素-10浓度增加的百分率与时间的函数图，三组患有白介素-10缺乏和丙型肝炎病毒感染患者的测试组，其中，在测试组I中对六名患者每天用0.33毫克干扰素τ治疗3次(菱形)，在测试组II中对六名患者每天用1.0毫克干扰素τ治疗3次(方形)；而在测试组III中对六名患者每天用3毫克干扰素τ治疗每日3次(三角形)。
序列说明 SEQ ID NO1对应于成熟绵羊干扰素-τ的氨基酸序列(IFNτ；oTP-1；GenBank登记号Y00287；PID g1358)。
SEQ ID NO2对应于成熟绵羊干扰素τ的氨基酸序列，与SEQ ID NO1相比，本序列的5位和6位上的氨基酸残基经过修饰。
具体实施例方式 I、定义 干扰素-tau，简写为IFNτ或者干扰素-τ，指干扰素蛋白家族中具有来自下列两组特征之一的至少一种特征的任何一员(i)(a)抗黄体溶解性能，(b)抗病毒性能，(c)抗细胞增殖性能；和(ii)与α-干扰素约45-68％的氨基酸同源性，以及与已知IFNτ序列大于70％的氨基酸同源性(例如，Ott，et al.，J.Interferon Res.，11357(1991)；Helmer，et al.，J.Reprod.Fert.，7983(1987)；Imakawa，et al.，Mol.Endocrinol，3127(1989)；Whaley，et al.，J.Biol.Chem.，26910846(1994)；Bazer，et al.，WO94/10313(1994))。氨基酸序列的同源性可以用例如带有缺省参数的LALIGN程序来进行测定。该程序在序列比较程序组FASTA 1.7版本的基础上建立(Pearson和Lipman，PNAS，852444(1988)；Pearson，Methods in Enzymology，18363(1990)；程序可以从William R.Pearson得到，Department of BiologicalChemistry，Box 440，Jordon Hall，Charlottesville，VA)。已经在很多种反刍类物种中鉴别出IFNτ序列，所述反刍类物种包括但不限制于牛(Bovine sp.，Helmer，S.D.，J.Reprod.Fert.，7983(1987)；Imakawa，K.，Mol.Endocrinol.，119532(1988))、绵羊(Ovine sp.)、麝牛(Ovibos sp.)、长颈鹿(Giraffasp.，GenBank登记号U55050)、马(Equus caballus)、斑马(Equus bruchelli，GenBank登记号NC005027)、河马(Hippopotamus sp.)、大象(Loxodontasp.)、骆驼(Llama glama)、山羊(Capra sp.，GenBank登记号AY357336、AY357335、AY347334、AY357333、AY357332、AY357331、AY357330、AY357329、AY357328、AY357327)、以及鹿(Cervidae sp.)。这些物种中的许多种的干扰素τ的核酸序列在公共数据库中和/或在文献中已有报道(参见，例如，Roberts，R.M.et al.，J.Interferon and Cytokine Res.，18805(1998)，Leaman D.W.et et al.，J.Interferon Res.，121(1993)，Ryan，A.M.et al.，Anim.Genet.，349(1996))。术语“干扰素-τ”意指包含来自上述所引举例说明的任何反刍类物种的干扰素-τ蛋白，所述干扰素-τ蛋白具有来自上述列出两组特征之一的至少一种特征。
绵羊IFNτ(OvIFNτ)是指具有此处鉴定为SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白，也指具有不会显著影响该蛋白活性的氨基酸替换和改变(例如中性氨基酸的替换)的蛋白，如此处鉴定为SEQ ID NO2的IFNτ蛋白。更普遍地，绵羊IFNτ蛋白与鉴定为SEQ ID NO1的序列具有约80％、更优选90％的序列同源性。例如，序列同源性可通过严格的氨基酸对比或者使用许多商业可供的程序之一来进行测定。
治疗身体状况是指给药有效的治疗物质，以减少该身体状况的症状和/或减轻该身体状况的严重程度。
II、治疗方法 一方面，该发明是关于治疗人类受试者中白介素-10缺乏的方法。通过下面描述的几种方法之一，鉴别患有或者可能患有白介素-10水平降低的受试者。将干扰素-τ(IFNτ)给药至受试者，与给药FNτ前的血白介素-10水平相比，所述干扰素-τ的给药量有效地提高血白介素-10水平。
在此所用的术语“白介素-10缺乏”一般是指受试者体内的白介素-10的量(i)如下文定义，在对一般人群而言的“正常”白介素-10水平范围的较低端，或者(ii)比公认的一般人群的“正常”白介素-10水平低。一般人群(即被看作健康人类受试者的群体)中的“正常”血清白介素-10水平，大约是2.5-2200皮克/毫升(pg/mL)(Jankord，R.et al.，Medicine & Science inSports & Exercise，36(6)960-964(2004)；Kozlowski，L.et al.，AnnalesAcademiae Medicae Bialostocensis，4882-84(2003)；Waubant et al.，J.Neuroimmunology，112139-145(2001))。因此，血(或血清)中的“白介素-10缺乏”是指白介素-10的水平低于约500皮克/毫升，优选低于250皮克/毫升，并更优选低于100皮克/毫升。可以理解，白介素-10的量可以通过取来自受试者的除了血液以外的任何适当的体液样品，如脊髓液或者滑膜液样品来测定，并且白介素-10缺乏可以基于一般人群中白介素-10在该体液中的“正常”范围而进行确定。液体样品中的白介素-10水平可以很容易得到测定，例如，使用商业可供的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
同样地，由2.5-2200皮克/毫升的血白介素-10水平正常范围，很明显可以理解，白介素-10水平有自然的差异性。因此，在一个实施方式中，通过测定血清白介素-10浓度并结合受试者的身体健康的评估，鉴定怀疑患有白介素-10缺乏的受试者。身体健康的评估涉及检查这个人与伴随血白介素-10水平降低的典型身体状况有关的症状，并且下文中给了示例性的身体状况。例如，具有活跃的或者缓解的多发性硬化症的人的血白介素-10水平一般都降低。例如，一名具有多发性硬化症的受试者的白介素-10血液水平为600皮克/毫升，仍然被认为患有“白介素-10缺乏”，因为(i)和(ii)的组合(i)存在了一种身体状况(多发性硬化症)，或者与所述的身体状况相关的症状，所述身体状况通常伴有血白介素-10水平降低；以及(ii)血白介素-10水平位于一般人群的正常范围2.5-2200皮克/毫升的较低端。正常范围的较低端一般是指该范围的较低的30％，例如低于700皮克/毫升。
在一个实施方式中，通过测定白介素-10的血液水平(通常通过获得血液样品并分析该样品的白介素-10含量)，鉴定患有白介素-10缺乏的人。白介素-10浓度低于约500皮克/毫升表明白介素-10缺乏，白介素-10缺乏的受试者的鉴定结果为阳性，尽管对于与白介素-10缺乏相关的疾病或身体状况，此人没有症状。
在另一个实施方式中，通过血白介素-10水平鉴定患有白介素-10缺乏的人，所述血白介素-10水平在“正常”范围之内，但是此人处于发展成由白介素-10浓度降低所诱导或者加剧的身体状况的危险中。例如，这样的人可能是那些对由白介素-10缺乏引起、伴随、或者加重的身体状况遗传性地易感的人。这样的人也可能是那些已经暴露于成因剂，或者处于暴露于成因剂的危险中的人，暴露于成因剂导致特征在于白介素-10缺乏的身体状况。
鉴定为白介素-10缺乏的人，或者处于白介素-10缺乏的危险中的人，在一定时间段内用一定剂量的IFNτ治疗，该剂量和时间段足以实现如在体液(诸如血液)中所测的体内白介素-10浓度的增加。IFNτ是I型的IFN，首次被鉴定为反刍动物(如羊和牛)的怀孕识别激素(Bazer，F.W.et al.，Am.J.Reprod.Immunol.2619-22(1991))。该蛋白具有抗病毒和抗增殖性质，毒性明显低于I型干扰素(Pontzer，C.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，152(2)801-807(1998)；Pontzer，C.，et al.，Cancer Res.，515304(1991))。相对于其它的干扰素，绵羊IFNτ与来自人、小鼠、大鼠及猪的干扰素-α有45-55％的同源性，与牛的干扰素-αII(现称为干扰素-Ω)有70％的同源性。绵羊IFNτ的cDNA以及几种可以代表不同亚型的cDNA在文献中都有报道(Imakawa，K.et al，Nature，330377-379(1987)；Stewart，H.J.，et al.，Mol.Endocrinol.265(1989)；Klemann，S.W.，et al.，Nuc.Acids Res.186724(1990)；以及Charlier，M.，et al.，Mol.Cell Endocrinol.76161-171(1991))。总共约1kb，585个碱基的开放阅读框编码23个氨基酸的前导序列和172个氨基酸的成熟蛋白。
绵羊IFNτ的172个氨基酸的序列在例如US 5,958,402中给得到描述，并且其同源的牛IFNτ序列已经得到描述，如在Helmer et al.，J.Reprod.Fert.，7983-91(1987)和Imakawa，K.et al.，Mol.Endocrinol.，3127(1989)中。来自这些参考文献的绵羊IFNτ和牛IFNτ的序列因此引入作为参考。绵羊IFNτ的氨基酸序列在此如SEQ ID NO1所示。绵羊IFNτ的修饰的氨基酸序列在此如SEQ ID NO2所示。
IFNτ的重组产品在科学文献(Ott，et al.，J.Interferon Cytokine Res.，11357-364(1991)；Soos，J.M.et al.，J.Immunol.，1552747(1995))和专利文献(WO/94/10313；US2003/0049277，IFNτ产品在这些文件中的描述此处引入作为参考)中都得到描述。
如上所记录的，在一定时间段内以一定的剂量将IFNτ给药至白介素-10缺乏的人，所述剂量和时间段有效地提高白介素-10水平。通常，在第一给药期间将第一剂量的IFNτ给药至受试者。在第一给药期间过去之后和/或第一给药期间内，测量白介素-10水平以确定此人的对初始剂量的反应。如果白介素-10水平得到提高，可以在后续的治疗中保持相同的剂量，或者如果需要进一步提高白介素-10则可以调整剂量，或者如果需要白介素-10较小增加，可以减小剂量。在一些情况下，尤其是初始治疗剂量足以在大多数人类患者中产生想要的白介素-10增加时，可以尝试降低剂量，以尽可能减小剂量但是仍保持想要的白介素-10增加。如果在初始给药期间过后，白介素-10的水平已经下降或者没有变化，可以增加白介素-10的剂量。然而，如果IFNτ的初始剂量高，并且患者不通过白介素-10水平增加来应答，则主治的护理者可建议另外的途径，该途径包括IFNτ与其它的试剂联合应用。
因此在一些实施方式中，治疗白介素-10缺乏的方法包括在首次和/或以后的治疗期间，在一个或者多个时间点监测受试者的白介素-10水平。基于从以前测量或者初始(预治疗)基线水平起白介素-10水平的改变而改良给药剂量。
在第一治疗周期结束后，发现受试者的白介素-10水平增加，可以不定期继续用IFNτ治疗或者由主治的护理者确定用IFNτ治疗的时间段。在需要决定何时及是否停止治疗时，可以监测白介素-10水平。当停止治疗以决定是否应该恢复治疗时，也可以监测白介素-10水平。例如，如果停止治疗时白介素-10水平降低，那么可恢复治疗。
IFNτ可以在任何药学上可接受的载体或者制剂中，通过任何给药途经给予受试者。优选口服和肠胃外给药模式。含有IFNτ的口服或者肠胃外制剂可以按照已知的制备药物组合物的方法来配制。
一般而言，对于口服给药，配制IFNτ使得有效量的IFNτ与适当的添加剂、载体和/或赋形剂组合，以利于有效地口服给药该组合物。例如，含有IFNτ的片剂和胶囊可以通过将IFNτ(如，低压冻干IFNτ蛋白)与添加剂混合而制得，例如药学上可接受的载体(如，乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、蔗糖)、粘合剂(如，α-型淀粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(如，羧甲基纤维素钙、淀粉、低取代的羟基-丙基纤维素)、表面活性剂(如，吐温-80、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)、抗氧剂(如，L-半胱氨酸、亚硫酸钠、抗坏血酸钠)、润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石粉)等等。
此外，IFNτ可以与固体的、粉状的或者其它的载体混合，如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉(如马铃薯淀粉、玉米淀粉)、米洛派克汀(millopectine)、纤维素衍生物或者明胶，还可包括润滑剂，如硬脂酸镁或者硬脂酸钙，或者压制形成片剂的聚乙二醇蜡。通过使用多层载体或者稀释剂，可以制备出提供缓释或者控释IFNτ的片剂。
用于口服给药的液体制剂可以制备成酏剂、糖浆剂或者悬浮剂的形式，例如含有约0.1重量％至约30重量％的IFNτ、氨基酸或者糖以及乙醇、水、甘油、丙烯、乙二醇和常规性质的其它可能的添加剂的混合物的溶液。
另一适当的制剂是保护剂型，该保护剂型保护蛋白在被肠粘膜吸收前，在胃和肠中存留。用于蛋白的保护剂型为本领域公知，包括肠溶包衣和/或粘膜粘着聚合物包衣。粘膜粘着聚合物制剂的例子包括乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、
羧基乙烯基聚合物、卡波姆(carbomer)等。预期设计用于通过摄入给药至胃的剂型以活性形式将IFNτ输送到肠道，并且尤其是到小肠。另外，IFNτ可与蛋白酶抑制剂共给药(co-administrate)，用聚合材料稳定，或者装入脂类或聚合物颗粒内，以提供胃和/或肠环境下的一些保护作用。
对于给定的受试者选择恰当剂量的IFNτ是在主治医生的技艺范围内的。可以理解的是，合适的剂量因人而异，基于年龄和综合的健康状况，白介素-10缺乏的程度，以及此人是否遭受特征在于白介素-10缺乏的身体状况。如上所记录的，并且如通常由医生所做的，剂量选择可包括对受试者进行“剂量逐步加高(dose-titrating)”；即，受试者开始的给药方案是以产生所需要白介素-10增加的水平或者低于这个水平，接着逐渐提高剂量直到达到所需的增加量为止。IFNτ的剂量在用于口服治疗时通常范围大于约1×105单位/天，并且优选大于约5×108单位/天，直至约1012单位/天；更具体地，剂量大于约5×108单位/天，更优选约0.5×109单位/天或者更多，进一步优选约1×109单位/天或者更多。预期的IFNτ比活度介于1×108单位/毫克和1×108单位/毫克之间。可以调整剂量以达到想要的血白介素-10的初始增加，例如为初始治疗前的白介素-10水平的1.5倍至4倍。
可以理解的是，该方法还可以包括监测受治疗的受试者中白介素-10水平的变化，以确定该水平是否得到调整，例如，与治疗前的白介素-10水平相比该水平是否得到增加。也可以进行监测以决定是否需要调整剂量。这样的监测可以在初始治疗期间内定期在一个或多个时间点完成。监测汇总的信息可用来决定继续治疗多久，是否调整剂量以达到所要的白介素-10应答等。
已进行研究来阐明用IFNτ治疗患有白介素-10缺乏的受试者。如在实施例1中所述，患有白介素-10缺乏的人通过测量白介素-10血液浓度为5.8pg/mL而得到鉴定。该患者还患有多发性硬化症。用IFNτ(SEQ ID NO2)治疗这个受试者，以1.8毫克/天的剂量给药(1.8×108U/天)，口服29天。在用药期间及停止治疗后监测血清白介素-10浓度。血清白介素-10水平如图1所示。
图1描述了在28天治疗期间白介素-10浓度与时间的函数。在28大的给药期间，白介素-10浓度增加。可以测定增加的程度，例如，通过简单的增长百分率，或者将初始治疗期间血清白介素-10水平的曲线下面积(AUC)与预期经过相同的时间而没有任何治疗的血清白介素-10水平(即白介素-10水平的基线)的曲线下面积相比较。图1图解说明了受试者AUC的比较，其中白介素-10增加的AUC是通过受治疗的受试者中白介素-10测量定义的曲线下总面积。基线值可计算为由在起始治疗时(或者起始治疗之前)得到的起始值来定义的曲线下面积，在同样的第1天至第28天期间内都予以考虑，并计算为所得矩形的面积。可选地，通过在治疗前多次测定白介素-1，并且计算用于基线值的AUC值，可以计算得作为曲线下真实面积的基线值。在后者的情况下，在取两个AUC的比值之前，基线AUC和白介素-10AUC必须校正为相同采样期间，如，28天。
使用梯形法则(Trapezoidal Rule)可以容易地计算出AUC，其中待测定的面积分解成多个梯形，测定所有梯形的面积总和，表示曲线下面积。进行所述计算，可以得到图1中治疗后的时间点的曲线下面积(所有曲线下面积值的单位都是皮克·天/毫升)。如上所述，简单地将基线AUC计算为所示的基线矩形面积。治疗后的AUC与治疗前的AUC的比值大于1，表明白介素-10浓度正增长。实施例1中的受试者AUC比值为1.87。
如实施例2中所述，对患有白介素-10缺乏并受多发性硬化症折磨的人进行研究。每组5名患者的3个组，在28天的初始治疗期间内，每组给予选定的0.2毫克(组I；2×107单位)、0.6毫克(组II；6×107单位)和1.8毫克(组III；1.8×108单位)的日剂量。在第1天、第4天、第8天、第15天和第29天监测血清白介素-10，并且在图2中表示出了每组的平均血清水平。
通过实施例1中所描述的方法计算曲线下面积来测定每名患者的白介素-10增加，结果如表1所示。
表1白介素-10增加，即在3个不同剂量下多发性硬化症(MS)患者的白介素-10应答 从此表中可见，首先，最高的白介素-10应答约在1.5和更高的范围内，即比基线高约50％。在最高剂量组5名患者中的4名患者以及在另两个较低剂量组中的1名患者上出现这些应答，表明每日1.8毫克的最高剂量是用于初始治疗期间的好的初始剂量。从该水平减少剂量则不能预期提高白介素-10的应答，并且如果接受1.8毫克/天的初始剂量的患者未表现出白介素-10增加至少约1.5，则为了增强白介素-10应答，应该增加剂量，而不是减少剂量。
在其他的研究中，如实施例3详述，患有白介素-10缺乏并经受丙型肝炎痛苦的患者分为3组，每日用日剂量为1毫克(组I)、3毫克(组II)及9毫克(组III)的IFNτ治疗，其中所述剂量每天分3次给药，即，每次剂量分别是0.33毫克、1毫克及3毫克，持续84天的时间。在第1天、第3天、第8天、第15天、第22天、第29天、第43天、第71天和第85天监测血清白介素-10水平。取每个治疗组患者的白介素-10浓度的平均值，结果如图3所示。图3表示患有白介素-10缺乏患者的三个测试组中血清白介素-10浓度增加的百分率与时间的函数。用1毫克(1×108单位/天，菱形)的日剂量治疗的受试者中，在整个治疗期间其白介素-10水平的平均增长百分率小于约40％。用较高剂量3毫克(3×108单位/天，方形)和9毫克(9×108单位/天，三角形)IFNτ治疗的组II和组III明显较高，在大部分的治疗时间内增加量都超过了50％。因此，在一个实施方式中，治疗白介素-缺乏的方法包括给药IFNτ，IFNτ的剂量足以使血清白介素-10在初始剂量四天后至少增加约50％，更优选在治疗2周后至少增加约100％。
其中白介素-10相对缺乏具有病理生理相关性的身体状况，包括但不限于，银屑病、痤疮、过敏性接触皮炎和其他非特应性湿疹炎、慢性炎症性肠病、关节炎、多发性硬化症、移植、葡萄膜炎、衰老、过敏性哮喘和克罗恩病。并非意在限制，所述身体状况中的几种将得到进一步讨论，并且有关患有白介素-10缺乏和特定的身体状况的患者的研究结果以下将得到描述。
1、银屑病 主要有两种银屑病寻常型银屑病(psoriasis vulgaris)(斑块银屑病)和脓疱型银屑病(psoriasis pustulosa)(脓疱银屑病)。银屑病的不同类型按照其严重性、持续时间、在机体的位置和损害的外观可分为亚型。皮肤损害的严重程度使用在文献中描述的各种评分测试来评估，如医师静态全程评估评分(physician’s Static Global Assessment score)、规模评分(scaling score)、斑块评分或者红斑评分。银屑病损伤区内皮肤白介素-10mRNA的表达通常比健康皮肤中的白介素-10mRNA的表达低，表明在银屑病损伤内相对缺乏白介素-10(Asadullah，K.，et al.，Pharmacol Rev 55(2)241-69(2003))。另外，与银屑病相关的损伤的疱液中白介素-10的水平也表明白介素-10缺乏(Nickoloff，B.J.，et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.，7363-68(1994))。
因此，为了治疗受银屑病折磨的人中的白介素-10缺乏，用IFNτ治疗受试者直至白介素-10的水平增加至足以使依照临床适当的评分测试评估的银屑病损伤减轻为止。优选地，评估分数降低至少约50％，更优选至少约70％，进一步优选至少约80％。通过实施例，患有银屑病的患者用初始剂量的IFNτ治疗，通常口服剂量大于约5×108单位/天。在治疗前，可以采集血液样品或者进行皮肤损伤分析白介素-10的浓度。在第一给药期间如3-4周给予该剂量。第一给药期间之后和/或在第一给药期间内，监测受试者的白介素-10水平和/或皮肤损伤的减少。为了达到想要的损伤减少，可以根据需要调整所述剂量以实现所期望的白介素-10增加。
2、过敏性接触性皮炎 过敏性接触性皮炎是1型细胞因子主导的免疫反应，伴随有2型细胞因子白介素-10水平的降低(Asadullah，K.，et al，Pharmacol Rev55(2)241-69(2003))。皮肤表面施用白介素-10已经表明阻止过敏性接触超敏反应的效应器(Schwarz，A.et al.，J.Invest.Dermatol.，103211-216(1994))，这表明了可使伴有过敏性接触皮炎的白介素-10缺乏正常化的治疗方法是有益的。据此，用足以提高血白介素-10水平的剂量的IFNτ治疗经受过敏性接触皮炎痛苦的白介素-10缺乏的人，因此来缓解身体状况或者与此身体状况有关的症状。
3、慢性炎症性肠病 已经表明，白介素-10缺乏导致形成炎症性肠炎。尤其是白介素-10产生缺乏的小鼠(所谓的白介素-10敲除鼠)，不控制炎症时，则发展为重症炎症性肠炎和死亡(Kuhn，R.et al.，Cell，75263-274(1993)；Lindsay，J.O.et al.，Immunol.Rev.，184117-128(2001))。炎症性肠炎是指一组特征在于慢性非特异性消化道部分炎症的胃肠紊乱。溃疡性结肠炎和克罗恩病是人类炎症性肠病的主要例子。IFNτ给药至确诊为炎症性肠病或者例如由于遗传易感性而处于发展成炎症性肠病的危险中的人，可用剂量足以提高血白介素-10水平的IFNτ治疗，以此减轻身体状况或者与此身体状况有关的症状或者尽可能降低发展成为此身体状况的危险。
4、炎症性紊乱的常规治疗 炎症性肠病、痤疮和皮炎是炎症性紊乱的具体例子，总体上阐述了治疗与炎症性紊乱相关的白介素-10缺乏的更常规的方法。白介素-10通过抑制促炎症反应细胞因子、趋化因子和黏附因子的表达，以及抑制单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞及T细胞中的抗原递呈和共激分子(costimulatory molecule)，控制炎症过程。白介素-10阻止经典的核因子kappa-B(NF-kB)的核易位。因此，以足以提高血白介素-10水平的剂量将IFNτ给药至患有炎症性疾病的人，将会缓解身体状况或者与此身体状况有关的症状。
5、免疫衰老的治疗 白介素-10还在伴随免疫衰老的与年龄有关的身体功能下降方面具有作用。已发现相对于健康老年人的白介素-10水平，虚弱的老年人的白介素-10水平不足(Uyemura，K.et al.，Mech.Ageing Dev.，123955-962(2002))。抗炎细胞因子的存在被认为与成功的增龄及长寿有关。因此，以足以提高血白介素-10水平的剂量将IFNτ给药至老年人，将会缓解由于衰老引起的任何虚弱的身体状况。
6、联合治疗 白介素-10的活性由其特异性细胞表面受体复合物介导，该复合物在各种细胞上都有表达，尤其是在免疫细胞上。白介素-10受体复合物尽管有一些拷贝在这些细胞表面表达，然而所述表达是可变的而且多种试剂可以刺激所述表达。例如，内毒素增加白介素-10受体复合物在成纤维细胞上的表达(Weber Nordt，R.M et al.，J.Immunol.，1533734-3744(1994))，皮肤病治疗剂如糖皮质激素、维生素D3，以及钙泊三醇都可增加该受体的表达(Michel，G.et al.，Inflamm Res.，4632-34(1997))。
因此，在一个实施方式中，提供了IFNτ与增加细胞表面白介素-10受体复合物表达的试剂的联合给药。第二种试剂可通过任何适当的途径给药，特别是包括口服和局部给药。第二种试剂可以在IFNτ给药之前、给药的过程中和/或同时给药。
在另一个实施方式中，仔细考虑了IFNτ与另一种试剂的联合给药。提供IFNτ弥补降低的白介素-10血液水平，而另一种试剂用于治疗症状或者作为治疗降低的白介素-10的潜在基础，例如治疗上述的任何一种疾病或者身体状况。
可以理解的是，IFNτ可以给予患有白介素-10缺乏但不伴有疾病或者身体状况的人，或者给予具有病理状况导致白介素-10缺乏的人，或者给予由于白介素-10缺乏而加剧了病理状况的人，或者给予处于发展成由白介素-10缺乏引起或加剧的身体状况的人。在某些情况下，依据外观症状怀疑患有白介素-10缺乏的人，可以在通过血液测试确定白介素-10缺乏为阳性之前给药IFNτ。
III、实施例 现参考具体的实施例来阐述如上所述的发明。可以理解的是，提供实施例是为了阐述优选的实施方式，因此并不限制本发明的范围。
实施例1 对白介素-10缺乏受试者的IFNτ给药 在不同的2天，从患有多发性硬化症的人抽取血液样品。用可以商购得到的ELISA试剂盒(Genzyme，Cambrige，Mass)分析该样品的白介素-10浓度。这些血液样品的平均白介素-10浓度是5.9皮克/毫升，表明该受试者缺乏白介素-10。用IFNτ治疗该受试者，该IFNτ按US 2003/0049277所述方法制得，并且该IFNτ具有约为1×108抗病毒单位/毫克蛋白和1×109抗病毒单位/毫克蛋白的比活度，该比活度用标准细胞病变作用分析(Familletti，P.C.，et al.，Methods in Enzymology，78387-394(1981)；Rubinstein，S.et al.，J.Virol.，37755-758(1981))评估。
用IFNτ治疗的人每天口服1.8毫克(1.8×108单位/天)剂量的IFNτ，共28天。在给药前，装有IFNτ(SEQ ID NO2)的小药瓶和注射器，在冰箱里2-8℃下保存。在自我给药前，患者从冰箱内取出一个药瓶和一个注射器。去掉注射器顶端的盖帽，将注射器顶端放入药品底部，将适量体积吸取到注射器中。注射器顶端放入口中并通过按压活塞使注射器内容物排空进入口中。然后患者吞咽，如果需要，可以喝一杯水。患者记录给药的日期和时间。在给药期间的第1天、第4天、第8天、第15天和第29天，以及在停止治疗后的第57天分别采集血液样品。用可以商购得到的ELISA试剂盒分析所得样品的IL-10浓度，结果如图1所示。
实施例2 治疗受试者中的白介素-10缺乏 这项研究中的人类患者患有在多发性硬化症中普遍存在的白介素-10缺乏。15名患者被随机分到3个治疗组，总结于表中，通过每天口服1次IFNτ治疗。
11毫克IFNτ＝1×108单位 在用IFNτ治疗前，在筛查日(screening day)和第1(一)天，从每名受试者取血液样品，以测定血清细胞因子浓度的基线。在第一天抽取血液后给每名患者口服给药IFNτ，开始治疗。在给药前，将装有IFNτ(SEQ ID NO2)的小药瓶和注射器在冰箱里2-8℃下保存。在自我给药前，患者从冰箱中取出一个药瓶和一个注射器。按照第1天在临床所受的指导，去掉注射器顶端的盖帽，注射器顶端放到药品底部将适量体积吸取到注射器中。注射器顶端放入口中并通过按压活塞使注射器的内容物排空到口中。然后患者吞咽，如果需要，可以喝一杯水。患者在他/她的日卡中记录给药的日期和时间。
在研究的第1大、第4天、第8天、第15天、第29天和第57天从每名患者取血液样品。通过使用可以商购得到的ELISA试剂盒(Genzyme，Cambrige，Mass)分析样品的白介素-10浓度。按照实施例1所述的方法测定治疗后与治疗前白介素-10浓度对时间的AUC的比值，结果示于表1中。测定每组血清白介素-10浓度的平均增长情况，如图2所示。
实施例3 感染丙型肝炎的受试者中白介素-10缺乏的治疗 18名受丙型肝炎折磨并具有降低的血白介素-10水平的患者被随机分为3个用IFNτ治疗的治疗组。
按照实施例2所述的，将IFNτ给予患者，不同之处在于，前面所述的剂量按照每天3次、大约间隔约8小时服用早晨一次，中午一次，以及晚上一次。每名患者的治疗周期为84天。
在169天的测试期中按规定的时间间隔取血液样品。按照厂商的说明书用ELISA试剂盒(Genzyme，Cambrige，Mass)分析样品的血清中的白介素-10水平。计算每组中6名受试者的血白介素-10浓度的平均值，相对于每组平均基线(即预治疗的白介素-10血液水平)的增长百分率如图3所示。
统计学分析发现3组之间的统计显著性差异(F＝12.08，P＝0.0009)、显著的时间影响(F＝11.20，P＝0.0001)，以及显著的组×时间相互作用(group-by-time interaction)(F＝7.88，P＝0.001)。由经过一定时间后3个剂量组之间的白介素-10应答速率的差异，可以清楚地看出组×时间相互作用。最低剂量组(组I；0.33毫克，每日三次)从第1天至第43天在白介素-10水平上产生了22％的增长，而组II(1毫克，每日三次)在第29天产生了114％的应答峰值。相比较，组III(3毫克，每天三次)在第43天产生了387％的增长，在第71天产生了484％的峰值。
尽管用有关的具体实施方式
阐述了该发明，但是对于本领域技术人员而言可以在不背离本发明的情况下对本发明做出各种改变和修改。
序列表
<110>派普根公司
<120>干扰素τ用于治疗白介素-10缺乏的用途
<130>556008014WO2
<140>Not yet Assigned
<141>Filed Herewith
<150>US 11/112,369
<151>2005-04-22
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>172
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>1
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys
1 5 10 15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu
85 90 95
Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly
100 105 110
Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr
115 120 125
Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
130 135 140
Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro
165 170
<210>2
<211>172
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>基于绵羊序列的重组IFNTau
<400>2
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145 150 155 160
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权利要求
1.一种方法，该方法包括；
鉴定被怀疑患有白介素-10缺乏的人类受试者；以及
给药干扰素-τ，相对于给药干扰素-τ之前的血白介素-10水平，干扰素-τ的给药量有效地提高血白介素-10水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鉴定包括从受试者获得血液样品并分析该样品的白介素-10浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述给药包括给药至受试者，除了白介素-10血液浓度低以外，所述受试者没有白介素-10缺乏的症状。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述给药包括在第一时间段内以第一剂量给药干扰素-τ，在所述第一时间段过去之后测定血白介素-10浓度，以及在第二时间段内给药第二剂量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第二剂量小于所述第一剂量。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第二剂量大于所述第一剂量。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一时间段短于所述第二时间段。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一时间段为1个月或者更短。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药包括给药至受试者，该受试者处于发展成具有由低白介素-10水平所加剧的症状的身体状况的危险中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药包括给药至受试者，该受试者所经受的身体状况具有由低白介素-10水平所加剧的症状。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述身体状况为自体免疫状况。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述身体状况为自体免疫状况。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述身体状况为特征在于炎症的身体状况。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述身体状况是特征在于炎症的身体状况。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鉴定包括鉴定受试者的身体症状，所述受试者具有自体免疫状况的症状。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鉴定包括鉴定受试者的身体症状，所述受试者具有特征在于炎症的身体状况。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药包括口服给药干扰素-τ。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述给药包括以大于5×108单位的日剂量口服给药干扰素-τ。
19.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括通过从受试者获得血液样品并分析该样品的白介素-10浓度来监测白介素-10水平。
全文摘要
描述了治疗人类受试者中的白介素-10缺乏的方法，其中鉴定患有白介素-10缺乏的人，并用足以提高白介素-10水平的剂量的干扰素τ(IFNτ)治疗。
文档编号A61K38/21GK101203237SQ200680022414
公开日2008年6月18日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月22日
发明者刘治平, L·维拉里特, S·基尔诺恩 申请人:派普根公司