抑制粘连的组合物和方法

专利名称：：抑制粘连的组合物和方法
技术领域：
：无
背景技术：
：粘连为通常相互分离的组织、器官或其它解剖学结构之间的连接。其通常是由疤痕样组织的纤维带构成且一般是在诸如手术、损伤或感染等刺激后产生。由于手术后粘连必然伴有诸如腹部和盆腔痛、不孕和肠梗阻等严重并发症，故其为常见且潜在地严重的事件。据估计，80%的腹部手术会引起粘连，致使人的身体和经济蒙受巨大损失。盆腔区手术后形成的粘连为引起手术后盆腔痛、不孕和小肠梗阻的主导原因。创伤和感染、尤其腹部或盆腔区域中的创伤和感染也会导致粘连。已至少在动物模型中测试预防或治疗粘连的多种药理学和基于障壁的方法，并且数种基于障壁的方法已用于商业用途。这些方法包括诸如因特隙(TC7)可吸收粘连障壁(Interceed(TC7)AbsorbableAdhesionBarrier)(强生公司(Johnson&Johnson))禾口适福⑧膜(Seprafilmmembrane)(基因酶公司(GenzymeCorp.))的产品。许多现有的障壁装置至少部分是由交联多糖或糖胺聚糖构成。将透明质酸(HA)用作达成这些目的的材料已引起广泛关注(伯恩斯(Burns)等人，通过用透明质酸溶液预涂组织来预防组织损伤和术后粘连(Preventionoftissueinjuryandpostsurgicaladhesionsbyprecoatingtissueswithhyaluronicacidsolutions.),手术研究杂志(JournalofSurgicalResearch)1995;59:644-652;派克(Peck)等人，作为组织保护和障壁佐剂的聚合物;容夜和薄膜(Polymersolutionsandfilmsastissue-protectiveandbarrieradjuvants.),迪泽佳GS(diZeregaGS)编，腹膜手术(PeritonealSurgery.)纽约(NewYork):施普林格(Springer),2000.第499-520页和罗杰斯(Rodgers)等人，兔腹膜手术后用透明质酸再现粘连形成(Reproductionofadhesionformationwithhyaluronicacidafterperitonealsurgeryinrabbits.)生殖与避孕(Fw7^SVe〃7.)1997;67(3):553-558，所述文献各自以引用的方式并入本文中)。HA是由(3-l，4连接D-葡糖醛酸(GlcUA)和(3-1,3N-乙酰基-D-葡糖胺(GIcNAc)二糖单元构成的线性多糖，并且为哺乳动物细胞外基质的常见组分。HA的天然形式为生物可相容、生物可降解且相对非免疫原性的。尽管其具有这些所需特性，但现有的用于抑制手术后粘连新生或复发的基于HA的方法具有明显缺点。举例来说，当以溶液形式应用时，HA的效力因腹腔快速清除而受到损害(梭尼(Sawhney)等人，用于预防粘连的光聚合生物侵蚀水凝胶特性的优化(Optimizationofphotopolymerizedbioerodiblehydrogelpropertiesforadhesionprevention.)生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)1994;28:831-838，其以引用的方式并入本文中)。单独或与其它材料组合的(例如)所制备出的薄片形式的HA固体调配物具有包括以下缺陷难以施用薄膜(例如，难以处理、千燥的薄膜粘附于手套上、柔韧性不足、需要去除)、与腹腔镜程序不相容和低于所需功效。因此，所属领域中需要抑制粘连的改进组合物和方法。
发明内容本发明提供抑制粘连的组合物和方法。尽管所述组合物和方法可用于抑制体内任何位置处粘连的形成、进展或复发，但预期其将尤其适用于抑制腹膜粘连。本发明一个目的在于提供可用于抑制粘连发展、进展和/或复发的适于在体内原位聚合的多糖衍生物，例如HA、纤维素或葡聚糖衍生物。本发明另一目的在于提供抑制粘连形成、进展和/或复发的方法，其是通过投与在施用于组织损害或损伤部位后迅速原位相互交联从而形成抑制粘连形成、进展和/或复发的水凝胶的多糖衍生物实现。本发明另一目的在于提供多糖衍生物和其组合，其将在有利于其原位施用的时间范围内迅速交联和胶凝。本发明另一目的在于提供产生由交联多糖所形成的水凝胶从而提供对诸如胶凝时间和半衰期等参数的控制的方法。本发明另一目的在于提供杂化多糖基水凝胶组合物，其中所述组合物视情况以持续的方式使生物活性剂(例如，治疗剂)传递到体内。在某些实施例中，生物活性剂为消炎剂，例如糖皮质激素(例如，泼尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)、布地奈德(budesonide))和非甾体消炎剂(例如，布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林(aspirin))。在某些实施例中，生物活性剂为纤维蛋白溶解剂，诸如纤溶酶原活化剂或链激酶。可视情况将这些药剂并入聚合材料或基质中以供所述药剂的延长或受控释放。在某些实施例中，将所述药剂与水凝胶或一种水凝胶前体直接连结。本发明另一目的在于提供水凝胶组合物，其含有视情况将生物活性剂传递到体内的颗粒。一方面，本发明提供一种抑制粘连的方法，其包含以下步骤将第一水凝胶前体和第二水凝胶前体投与个体体内位置处；其中所述第一和第二水凝胶前体在相互接触后交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连。第一与第二水凝胶前体可以一种或多种溶液的形式提供。在本发明某些实施例中，水凝胶前体为多糖衍生物。一方面，本发明提供一种抑制粘连的方法，其包含以下步骤将第一多糖衍生物投与个体体内位置处；和将第二多糖衍生物投与个体体内所述位置处，其中在所述第一与第二多糖衍生物相互接触后，所述多糖衍生物交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连。在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物包含第一官能团且第二多糖衍生物包含第二官能团，并且所述第一和第二官能团在生理条件下相互反应形成共价键。在本发明某些实施例中，-一个官能团为酰肼且一个官能团为醛。在本发明某些实施例中，多糖衍生物为HA衍生物。在本发明某些实施例中，一种多糖衍生物为HA衍生物且另一多糖衍生物为纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素(CMC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC))。在本发明某些其它实施例中，一种多糖衍生物为HA衍生物且另一多糖衍生物为葡聚糖衍生物。在某些实施例中，本发明包含将包含第一多糖衍生物的溶液投与个体体内位置处；和将包含第二多糖衍生物的第二溶液投与所述个体体内所述位置处。在本发明某些实施例中，至少一种多糖衍生物包含非多糖部分。在其它实施例中，至少一种水凝胶前体为非多糖聚合物。另一方面，本发明提供一种包含溶液形式的透明质酸(HA)衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度大于5mg/ml。在另一实施例中，本发明提供一种包含溶液形式的透明质酸(HA)衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度大于10mg/ml。在另一实施例中，本发明提供一种包含溶液形式的透明质酸(HA)衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度大于15mg/ml。在另一实施例中，本发明提供一种包含溶液形式的透明质酸(HA)衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度大于25mg/ml。在本发明某些实施例中，HA衍生物的浓度小于或等于100mg/ml。在本发明其它实施例中，HA衍生物的浓度介于50mg/ml与75mg/ml之间。另一方面，本发明提供一种包含交联HA衍生物的水凝胶，其中所述水凝胶在存在10U/ml透明质酸酶的情况下具有至少IO天的半衰期。在某些实施例中，本发明提供一种HA-纤维素、HA-葡聚糖或HA-其它多糖衍生物，其中所得水凝胶对透明质酸酶不如相应HA-HA水凝胶敏感。在某些实施例中，本发明提供一种包含溶液形式的纤维素或葡聚糖衍生物的组合物，其中所述纤维素或葡聚糖衍生物的浓度大于5mg/ml、大于IOmg/ml、大于15mg/ml或大于25mg/ml。另一方面，本发明提供一种组合物，其包含第一多糖衍生物和多个颗粒。多糖衍生物可为HA衍生物、纤维素衍生物或葡聚糖衍生物。另一方面，本发明提供一种组合物，其包含第一和第二多糖衍生物，和多个颗粒。在本发明某些实施例中，第一与第二多糖衍生物交联形成水凝胶。所述颗粒可含有生物活性剂。在某些实施例中，生物活性剂为消炎剂(例如，地塞米松、泼尼松、布地奈德、布洛芬、阿司匹林等)。在其它实施例中，生物活性剂为纤维蛋白溶解剂(例如纤溶酶原活化剂、链激酶)。本发明另外提供一种抑制粘连的方法，其包含以下步骤将多个颗粒和至少一种多糖衍生物投与个体体内位置处，其中单独或与第二多糖衍生物组合的第一多糖衍生物在投与后交联形成截留所述颗粒的水凝胶。在本发明某些实施例中，所述方法包含投与第一和第二多糖衍生物，其中至少一种衍生物为HA衍生物。在本发明某些实施例中，至少一种衍生物为纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，至少一种衍生物为葡聚糖衍生物。在本发明某些实施例中，至少一种衍生物包含非多糖部分。本发明另外提供一种抑制粘连的方法，其包含以下步骤将包含第一多糖衍生物的第一溶液投与个体体内位置处；和将包含第二多糖衍生物的第二溶液投与所述位置，其中所述溶液中任一种或两种包含多个颗粒，且其中所述多糖衍生物在投与后交联形成截留颗粒的水凝胶。在本发明某些实施例中，第一溶液包含第一HA衍生物且第二溶液包含第二HA衍生物。在本发明某些实施例中，第一溶液包含HA衍生物且第二溶液包含纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，第一溶液包含HA衍生物且第二溶液包含葡聚糖衍生物。在本发明某些实施例中，第一溶液包含HA衍生物且第二溶液包含另一多糖衍生物。另一方面，本发明提供一种将颗粒投与体内位置的方法，其包含将包含颗粒和一种或多种水凝胶前体的组合物投与所述位置，其中所述一种或多种水凝胶前体形成将颗粒截留于其中的水凝胶。在本发明某些实施例中，至少一种水凝胶前体为多糖衍生物。图l.HAX凝胶的扫描电子显微照相。比例尺=10pm。图2.在存在HAX凝胶(20mg/ml)的情况下间皮细胞的活力。白色条和灰色条分别指示在普通培养基和含有10U/ml透明质酸酶的培养基中生长的细胞。数据为中值与第25个百分点和第75个百分点(n=4)。图3.(A)施用于受损腹壁和盲肠上的HAX。箭头指示粘附于施用部位的凝胶。(B)在经HAX治疗的动物中未观察到粘连。(C)在未经治疗的对照中观察到3分的粘连。AW-腹壁。图4.组织学检査。(A)来自未经治疗动物的粘连(5x)。箭头指示受损肌细胞；(B)来自另一未经治疗动物的粘连的特写影像(10x)。注意指示发炎和纤维化的高细胞群带。(C)来自经20mg/mlHAX治疗的动物的无粘连腹壁(20x)。注意内腔侧上的蓝色涂层。AW-腹壁肌肉，Sn^平滑肌。图5.(A)在10U/ml透明质酸酶中降解HAX凝胶期间释放葡糖醛酸(n=5)。(B)在存在透明质酸(HA)和其单体组分的情况下由间皮细胞产生tPA。图6.HA-CH0的(A)浓度和(C)Mw对宏观凝胶降解动力学的影响。图例指示HA-ADH或HA-CHO的Mw和浓度(mg/ml)。所指示的值为四个测量值的平均值和标准差。图7.(A)PLGA纳米颗粒、(B)冻干HAX凝胶和(C)冻干杂化凝胶的SEM图片。图8.在存在杂化凝胶(20mg/mlHAX、PLGA纳米颗粒)的情况下间皮细胞的活力。白色条和灰色条分别指示在普通培养基和含有10U/ml透明质酸酶的培养基中生长的细胞。数据为中值与第25个百分点和第75个百分点(n=4)。图9.注射后2天或7天腹膜内剩余的杂化凝胶(以箭头指示)。(A)10mg/mlHAX+20mg/mlPLGA纳米颗粒，(B和C)20mg/mlHAX+20mg/mlPLGA。(A)中的插图展示与腹膜分离的杂化凝胶。B-肠，AW-腹壁。图10.(A)施用于受损腹壁和盲肠上的杂化凝胶。箭头指示粘附于施用部位的杂化凝胶。(B)在经杂化凝胶治疗的动物中未观察到粘连。AVv^腹壁。图ll.组织学检查。(A)从术后7天的兔回收的杂化凝胶(200x)。注意泡沫状巨噬细胞。(B)与注射后7天小鼠(插图)中所见凝胶残余物类似的泡沫状巨噬细胞的特写影像(400x)。(C)来自经杂化凝胶治疗的兔的无粘连腹壁肌肉(200x);(D)在手术期间经杂化凝胶覆盖的腹壁肌肉表面的特写影像(400x)。注意巨噬细胞的起泡度。AW=经擦伤腹壁肌肉。图12.展示各种合成多糖衍生物的化学结构。(A)HA-ADH、(B)HA-ALD、(C)CMC-ALD(R=CH2COOH或H)、HPMC-ALD(R=CH2CH(OH)CH3或H)或MC-ALD12(R二CH3或H)。图13绘示可用于投与含有可交联多糖衍生物的溶液的装置。图14绘示可用于投与含有可交联多糖衍生物的溶液的多通道装置。图15绘示可用于投与含有可交联多糖衍生物的溶液的多管装置。图16为展现将HA衍生物与纤维素衍生物交联所形成的多种水凝胶抑制粘连的能力的条形图。图17.在37'C下水凝胶于PBS中的10单位/ml透明质酸酶中的降解动力学。水凝胶的体积(％)为各吋间点时水凝胶的体积与初始体积的比率，以百分比表示。数据为平均值土标准差(n=4)。图18.通过MTT分析所测量的醛聚合物(HA-CHO、CMC-CHO、MC-CHO和HPMC-CHO)对细胞活力的影响。(A)与聚合物一起培养3天后的间皮细胞。(B)与聚合物一起培养2天后的巨噬细胞(J774.A1细胞系)。数据为平均值土标准差(n=4)。图19.注射水凝胶后1周小鼠的腹膜。(A)HAX:无残余物。(B)HA-CMC:注意凝胶状材料的薄涂层。(C)HA-MC:注意增加量的残余材料，表明镊子浸没于其下。图20.兔擦伤模型中腹膜粘连的预防。(A)粘连的诱发。注意腹壁缺损(箭头)和盲肠的出血表面。(B)1周后在经生理盐水治疗的动物的剖面可见粘连。(C)l周后在经HA-MC治疗的动物中无粘连。图21.损伤后1周在兔侧壁缺损的肠擦伤模型中回收的组织的显微照片。(A)生理盐水治疗的动物中擦伤的横截面。盲肠腔(CE)在图片的左上角。盲肠平滑肌5腹部肌肉组织(AM)的横纹肌融合。放大100X。(B)从经HA-MC治疗的动物回收的水凝胶，具有发炎细胞(主要为巨噬细胞和淋巴细胞)。放大100X。(C)经HA-MC治疗的动物中腹壁缺损的部位。所述缺损已再生上皮(箭头)，具有愈合组织下层(主要为成纤维细胞)。放大400X。(D)正常的未经治疗的壁层腹膜。间皮(箭头)位于结缔组织(CT)和腹肌上。图22.(A)DX、(B)DX-CHO、(C)CMDX、(D)CMDX-ADH、(E)CMC和(F)CMC-CHO的化学结构。图23.(A)DX、(B)CMD和(C)CMD-ADH的FT-IR光谱。图24.37t:下水凝胶于PBS缓冲液中的膨胀体积。所测量的值为平均值士标准差(N=4)。图25.水凝胶的胶凝时间。所测量的值为平均值土标准差(N=5)。图26.37。C下水凝胶于PBS缓冲液中的膨胀体积。所测量的值为平均值±标准差(N=4)。图27.37'C下浸没于PBS缓冲液中后5天水凝胶的图片。(A)70kDa-CMDX-DX(5%(w/v)/6%(w/v))。(B)70kDa-CMDX-CMC(5%(w/v)/6%(w/v))。图28.通过MTT分析所测量的未经修饰和合成聚合物(DX、CMC、CMDX-ADH、CMC-CHO禾卩DX-CHO)对细胞活力的影响。数据为平均值土标准差(n=4)。(A)与聚合物一起培养3天后的间皮细胞。CMC-CHO的资料描述于上述实例12中。(B)与聚合物一起培养2天后巨噬细胞细胞系J774.A1。图29.注射70kDa-CMDX-DX后2周小鼠的腹膜。图30.以兔擦伤模型进行的粘连预防测试的腹膜。在粘连诱发手术后1周执行剖腹术。(A-l、A-2)70kDa-CMDX-DX(2%(w/v)/5%(w/v))。CMDX-DX凝胶使腹膜粘连恶化。(B)70kDa-CMDX-CMC(5%(w/v)/6%(w/v));(C-l，C-2)500kDa-CMDX-CMC(4%(w/v)/6%(w/v))。CMDX-CMC凝胶减少腹膜粘连。对照实验的结果引用自前述研究。图31.兔侧壁缺损的肠擦伤模型实验的组织学图片。(A)CMDX-DX凝胶粘在盲肠袋14上(5x)。(B)图A的粘附表面的放大图(40x)。(C)在CMDX-DX凝胶情况下回收的腹壁(5x)。(D)在500kDa-CMDX-CMC凝胶情况下的正常腹壁(5x)。图32.合成含有地塞米松的交联透明质酸水凝胶(HAX-DEX)的示意图。最终的水凝胶是通过将醛衍生化透明质酸与透明质酸-肥酸二酰肼-琥珀酸地塞米松(划阴影线的化合物)混合而形成。图33.通过MTT分析所测定的与不同浓度合成聚合物一起培养的人类间皮细胞的活力。数据为平均值与标准差。图34.在释放培养基中地塞米松浓度的时程。数据为平均值与标准差。图35.HAX和HAX-DEX的膨胀体积的时程。数据为平均值与标准差。图36.地塞米松对原代小鼠巨噬细胞的TNF-oi和IL-6的产生的影响。值为两次测量的平均值。图37.原代小鼠巨噬细胞产生IL-6的时程。数据为平均值与标准差。图38.原代小鼠巨噬细胞产生TNF-a的时程。数据为平均值与标准差。图39.注射后2天取出的水凝胶。(A)离体HAX-DEX水凝胶。(B)代表性苏木素伊红染色的HAX-DEX凝胶(上部)和下层肌肉(下部)样本，20x。(C禾BD)HAX凝胶中和HAX凝胶周围发炎性细胞的两个样本，分别为20x和40x。蓝色相对均匀的物质为凝胶(G)。14图40.冻干布地奈德-HAX的扫描电子显微照相。比例尺=100pm。图41.37'C下布地奈德于生理盐水中的溶解度。(A)相溶解度图。(B)随时间流逝布地奈德的浓度和沉淀质量。数据为平均值与标准差(ti-4)。图42.布地奈德-HAX中布地奈德的活体外释放动力学。数据为平均值与标准差(n=4)。图43.(A)第二次剖腹术后的重量损失(表示为相对于起始体重的百分比)。(B)具有各种粘连得分的动物的百分比。0分=无粘连；2分=通过钝器解剖可分离的组织粘连；3分=需要利器解剖的粘连。(C)2分和3分粘连的面积总和(cm2)。重量损失与粘连面积都表示为中值与第25个百分点和第75个百分点(n=6)。*表示与生理盐水对照的统计学差异，且t和t表示所比较的各组之间的统计学差异。经生理盐水治疗的对照和HAX组来自参考(ref)[tPA]。图44.来自经布地奈德-生理盐水治疗的动物的组织和正常组织。(A)腹壁表面(200x);(B)盲肠表而(200x);和(C)盲肠表而(400x)。SK:腹壁骨骼肌；SM:内脏平滑肌；Me:间皮层。图45.注射后2天取出的水凝胶。(A-D)解剖的大体外观。(A)原位的HAX。注意发炎且明显的血管分布。(B)原位的布地奈德-HAX。(C)不可与皮肤分离的离体HAX。(D)从除有意存留的小皮层(smallrind)外的皮肤分离的布地奈德-HAX。(E禾卩F)苏木素伊红染色的部分(都为40x)。(E)HAX。注意大量的发炎反应。(F)布地奈德-HAX。注意发炎的相对不存在。在E禾t!F中，内腔巾的浅蓝色物质为水凝胶，其为esosi叩hiliccapsule所围绕。具体实施例方式定义术语"血管生成抑制剂"和"抗血管生成剂"在本文中可互换使用以指能够抑制或减少一个或多个与血管生成相关的过程的药剂，所述过程包括(但不限于)内皮细胞增殖、内皮细胞存活、内皮细胞迁移、前体细胞分化成内皮细胞和毛细管形成。如本文所使用，"抗感染剂"是指抑制一种或多种感染性病原体(例如病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫、吸虫或其它寄生虫)增殖的任何物质。抗感染剂可在活体外(即，细胞培养物中)、活体内(即，当投与有感染风险的动物或感染动物时)或二者中展现抑制活性。抗感染剂优选以治疗耐受的剂量在活体内具有抑制活性。如本文中所使用，"消炎剂"是指抑制一种或多种发炎症兆或症状的任何物质。如本文所使用，"水性介质"意思指含有水和视情况一种或多种可与水混溶的溶剂(例如，二甲基甲酰胺、二甲亚砜和烃基醇、二醇或甘油)的液体介质。水性介质可含有至少50体积％、60体积％、70体积％、80体积％、90体积％或更多水。应了解，水性介质可含有多种溶解、分散或悬浮于其中的物质。除非另作说明或另外从上下文中可显而易见(除所述数字将超过可能值的100%的情形外)，否则关于数字的术语"约"通常包括在所述数字的任一方向(大于或小于所述数字)的5%范围内的数字。"生物可相容"是指以所使用的量在所使用的位置处对受者的细胞实质上无毒并且在所使用的位置处也不会对受者的身体引发或引起显著有害或不利的影响(例如，不可接受的免疫或发炎反应、不可接受的疤痕组织形成等)的物质。"生物可降解"意思指能够例如通过在生理条件下水解，和/或通过天然生物过程(诸如细胞或体内存在的酶作用)，禾P/或诸如溶解、分散等过程在细胞或个体体内物理和/或化学分解以形成较小化学物质的物质，所述较小的化学物质通常能够被身体代谢且视情况使用和/或排泄或以其它方式处理。生物可降解化合物优选为生物可相容的。出于本发明的目的，认为分子量在活体内因单体数量减少而随时间减小的聚合物为生物可降解的。"生物活性剂"为在活体内具有所需生物活性(例如治疗、诊断和/或预防特性)的任何化合物或药剂，或其医药学上可接受的盐。应了解，可能需要从颗粒和/或水凝胶中释放所述药剂以使其发挥生物活性。生物活性剂包括(但不限于)如本文所使用的治疗剂。生物活性剂可为(但不限于)人工或天然存在的小分子、肽或多肽、免疫球蛋白，例如抗体、核酸等。且无限制性地，激素、生长因子、药物、细胞因子、趋化因子、凝血因子和内源凝血抑制剂等也为生物活性剂。术语"内窥镜"意思指小直径管状仪器，其通常使用光纤，经设计以插入身体的切口中，在微创手术程序期间用于可视化且操作。所述术语包括"腹腔镜"，其经设计以使腹盆腔中的组织和器官可视和可操作；和"关节镜"，其经设计以使关节间隙内的组织可视和可操作等。如本文中所使用，"纤维蛋白溶解剂"是指直接或间接引起纤维蛋白降解的任何物质。"HAX水凝胶"为由交联HA衍生物形成的水凝胶。"杂化水凝胶"为包含颗粒和交联多糖衍生物的复合水凝胶。"水凝胶"为包含含有大量水的亲水性聚合物的三维网状物。水凝胶以重量/重量计可例如含有30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％或甚至更多量的水。"水凝胶前体"为至少部分溶于水性介质中并且能够交联形成水凝胶的聚合物。"抑制粘连"是指投与组合物和/或执行程序从而使粘连数量、粘连范围(例如面积)和/或粘连的严重程度(例如，密度或抗机械或化学破坏性)相对于无所述投药时将出现的粘连的数量、范围和/或严重程度有所降低。组合物或程序可在促进粘连的刺激后抑制粘连形成或生长；可抑制粘连进展；和/或可在其自发消退后或者机械或化学破坏后抑制粘连复发。"原位"意思指水凝胶实质上形成于需要水凝胶的位置处而非形成于别处并且随后将其施用于需要其的位置。举例来说，出于本发明的目的，认为个体身体上或体内水凝胶的形成为"原位"的。"脂质体"为通过将脂质双层(或多层)封入可含有生物活性剂的水性隔室中形成的人工微观球形颗粒。"延长的局部腹膜投药"是指投与一种或多种组合物，以使所述组合物整体接触腹膜中面积至少等于距损害部位边界10cm距离内的面积的一部分，例如以致在所述组合物中存在的多糖衍生物交联后，面积至少等于距损害部位边界10cm距离内的面积的一部分腹膜为水凝胶层所覆盖。受损害部位可为显然危及腹膜实体或功能的任何部位，例如手术切口、损伤、感染导致腹膜中可见的实体改变的部位(例如，发炎、渗出液等)。所覆盖的面积可例如与损害部位毗邻且在损害部位周围，或者可位于腹膜的相对表面上。举例来说，损害可为腹壁中的手术切口以致壁层腹膜受损，并且所覆盖的面积可在与损害部位相对的脏层腹膜上。"全腹膜投药(Pan-peritonealadministration)"是指投与一种或多种组合物以使所述组合物在投与后整体接触腹膜的实质部分(例如，至少10%的腹膜表面积)，例如从而在所述组合物中存在的多糖衍生物交联后，使得至少10%的腹膜表面积为水凝胶层所覆主皿。"颗粒"是指小物体、片段或小件材料且其包括(但不限于)聚合颗粒、生物可降解颗粒、非生物可降解颗粒、单乳液颗粒、双乳液颗粒、凝聚质、脂质体、微米颗粒(microparticle)、纳米颗粒(nanoparticle)、宏观颗粒、小球、晶体、聚集物、复合物，经研磨、碾磨或经其它方式破坏的基质、交联蛋白或多糖颗粒(包括包含HAX的颗粒)。颗粒可由单一物质或多种物质构成。在本发明某些实施例中，颗粒并非病毒颗粒。术语"腹膜"是指顺腹盆腔壁排列的浆液状膜，其从横隔膜的内表面延伸到骨盆底的上表面。此外，腹膜至少部分覆盖各种腹盆腔器官，例如肠、胃、肝、肾、肾上腺、脾、膀胱、子宫、卵巢和输卵管。液体薄膜使腹膜表面润滑并且通常促进内脏相对于彼此或相对于腹壁或盆壁自由移动。术语"腹膜粘连"是指腹膜腔中发生的粘连。腹膜粘连使得器官或组织相互连在一起或与腹盆腔壁连在一起。"预防粘连"是指在形成粘连之前投与或施用治疗性组合物和/或程序以便降低将响应特定损伤、刺激或病状形成粘连的可能性。应了解，"预防粘连"不需要粘连形成的可能性降低到零。而是说，"预防粘连"是指使特定损伤或刺激后粘连形成的可能性在临床上显著降低，例如响应特定粘连促进损伤、病状或刺激的粘连发生率或数量在临床上显著降低。"小分子"是指天然存在或人工产生(例如，经由化学合成)的有机化合物，其具有相对低的分子量且不为蛋白质、多肽或核酸。通常，小分子具有小于约1500g/mol的分子量。此外，小分子通常具有多个碳碳键。"溶解度"是指在特定温度和pH值下溶解于指定体积的溶剂中(例如)形成饱和溶液的物质的量。溶解度可例如使用摇瓶溶解方法(ASTM:E1148-02，用于测量水溶液溶角军度的标准测试方法(StandardTestMethodforMeasurementsofAqueousSolubility),标准手册(BookofStandards)，第11.05巻)测定。可在介于3.0与9.0之间，例如介于4.0与8.0之间、介于5.0与8.0之间、介于6.0与8.0之间，例如介于6.5与7.6之间，例如介于6.8-7.4之间，例如为7.0或上述范围的任何中间值的pH值下测定溶解度。可在介于20与4(TC之间，例如约25-37°C，例如为约37。C或上述范围的任何中间值的温度下测试溶解度。举例来说，可在约pH7.0-7.4和约37i:下测定溶解度。如本文所使用，"个体"是指拟传递药剂(例如)至其以込到实验、诊断和/或治疗目的的个体。优选个体为哺乳动物，尤其家养哺乳动物(例如狗、猫等)、灵长类动物或人类。处于医师或其它健康护理人员护理下的个体可称为"患者"。"持续释放调配物"为包含生物活性剂作为其组分中的一种且另外包含--种或多种视情况部分由于调配物的实体结构有效使所述治疗剂持续释放的其它组分、元件或结构的相关组合物。持续释放为在一段时间内，例如至少2、3、4、5或6、至少l、2、4或6周、长达约l、2、3、4、6、8、10、12、15、18或24个月内连续或间歇发生的释放或传递。也称为"药物"的"治疗剂"本文中是指投与个体以治疗疾病、病症或其它临床上认可的对个体有害的病状或达成预防目的的药剂，且其对身体的疾病、病症或病状的治疗或预防具有临床上显著的作用。治疗剂包括(但不限于)以下文献中所列的药剂美国药典(UnitedStatesPharmacopeia,USP)、(Goodmtm)/〃(G〃ma")治#，18游,麥学基鄉(7TzeP/za厂macoZog/cflZo/7VjerapeMn'c^),第10版，(麦克劳希尔(McGrawHill))，2001;卡卓恩B.(Katzung，B.)(编)基础与临床药理学(細!'ca"rfCZZm'caZP/iarmacoZogy),麦克劳希尔/阿普尔顿和兰格(Appleton&Lange);第8版(2000年9月21日)；医师桌上手册(尸/^!'dfl"'jZ)e^We/^e"")(汤姆逊出版公司(ThomsonPublishing)),和/或默克手册的诊断与治疗(77zeMercfcMa"wa/o/￡)!agm"朋c/7T^ra/;y),第17版(1999)或其后出版的第18版(2006)，马克H.比尔(MarkH.Beers)和罗伯特贝尔考(RobertBerkow)(编),默克出版公司(MerckPublishingGroup),或在动物的情况下，默克兽医手册(7T^Merc/tVfeM〃'Mao;似a肌a/),第9版，卡恩C.A,(Kahn,C.A.)(编)，默克出版公司(MeratP"W!i!'"gGrawp),2005中。如本文所使用，"治疗粘连"是指遵循用于破坏或降低粘连的范围或严重程度的程序，投与或施用可逆转、缓解、减轻和/或抑制粘连进展和/或严重程度或者可降低粘连复发的可能性和/或粘连复发的严重程度的组合物和/或程序。"治疗粘连"还指投与或施用可逆转、缓解、减轻、抑制粘连的一种或多种症状(例如，疼痛、肠梗阻、不孕)的进展或降低其复发的可能性和/或严重程度的组合物和/或程序。因此，"治疗粘连"涉及在损伤或刺激后已形成粘连后即投与或施用治疗组合物和/或程序。"肿瘤"是指由过度细胞分化所引起的异常组织肿块。肿瘤可为良性(非癌性的)或恶性(癌性的)。"肿瘤"包括以造血细胞过度分化为特征的病症。所述病症包括恶性和恶变前血液病症，诸如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓增生性病症。可使用多种技术认可的方法中的任一种诊断肿瘤，包括物理诊断、影像研究、组织病理学(例如，对细胞或组织样本执行)、生化测试等。肿瘤的特定非限制性实例包括肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、血液肿瘤(例如，白血病、霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、多发性骨髓瘤和其它浆细胞病症、骨髓增生性病症)、脑肿瘤(例如，低级别星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤)和胃肠道间质瘤(GIST)。肉瘤包括骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、软组织肉瘤和胃平滑肌肉瘤。恶性肿瘤的其它实例包括小细胞和非小细胞肺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝细胞癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、甲状腺癌、头癌和颈癌、甲状腺癌等。如本文所使用，"肿瘤"包括原发性肿瘤的转移。"粘度"是指对于在指定温度下液体稠度或抗液体流动性的测量。可使用所属领域中已知的多种方法和仪器测定粘度。举例来说，首先称量聚合物且随后将其溶解于适当溶剂中。将溶液和粘度计放入恒温水浴中。使溶液内获得热平衡。随后将液体放到粘度19计上的顶部分度标记上。记录溶液从顶部流到底部分度标记的时间。可根据ASTM标准手册(ASTMBookofStandards)中关于聚合物稀溶液粘度的实践(ASTMD2857)第08.01巻(2005年6月)或者关于特定聚合物的相关ASTM标准测定包含聚合物的溶液的粘度。可在介于20与4(TC之间，例如约25-37。C，例如为约37'C或上述范围的任何中间值的温度下测试溶解度。举例来说，可在约pH7.0-7.4和约37'C下测定溶解度。I.包含原位可交联多糖衍生物的抗粘连组合物据悉，粘连是由复杂的发炎过程引起，其中在体内通常保持分离的组织常因手术创伤、损伤或感染而相互连在-一起。这些粘连(包括由其它原因引起的粘连)为诸如肠梗阻和不孕等严重并发症的主要原因。其它粘连相关并发症包括慢性腹盆腔痛、尿路梗阻和排尿功能障碍。怀疑在粘连形成中起到作用的发炎过程包括嗜中性粒细胞积累和受损组织的活化、纤维蛋白沉积和相邻组织的粘合、巨噬细胞侵入、成纤维细胞增生到区域中、胶原蛋白沉积、血管生成和持久粘连组织产生。当前治疗方法包括使用甾体和非甾体消炎药物以及涉及施用试图保持组织分离的薄膜或膜的多种基于障壁的方法。然而，这些方法的功效有限。本发明提供预防和/或治疗粘连的组合物和方法。本发明部分是由发明者的发现产生某些多糖(例如，透明质酸(HA)或纤维素衍生物)当以溶液形式投与体内一部位(例如，组织损伤或损害的部位)时原位(即，在体内投药部位处或接近体内投药部位处)相互交联形成抑制粘连的水凝胶。第-方面，本发明提供-种抑制粘连的方法，其包含以下步骤将第一多糖衍生物投与个体体内位置处；和将第二多糖衍生物投与个体体内所述位置处，其中在所述第一与第二多糖衍生物相互接触后，所述多糖衍生物交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连。在投与前，将多糖衍生物溶解于溶液中。可将溶液实质上同时地投与个体。可在投药前将溶液混合以形成单一溶液，在此情况下，优选在发生实质交联之前将其投与。本文中主要例示说明HA、纤维素和葡聚糖的衍生物，而本发明涵盖在抑制粘连的组合物和方法中以及本文中所述的其它组合物和方法中使用其它多糖和其衍生物与非多糖聚合物水凝胶前体。水凝胶是在可能另外相互接触的组织或结构之间以及例如能在创伤愈合过程中因此发展粘连的组织或结构之间形成。因此，水凝胶用于分离已经历损伤、创伤、外部环境暴露或任何其它类型损害的组织或结构。本发明因此提供一种使组织或结构保持分离的方法，其包含以下步骤将第一多糖衍生物投与个体体内位置处；和将第二多糖衍生物投与个体体内所述位置处，其中在所述水凝胶前体相互接触后，所述第一与第二多糖衍生物交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶位于需保持相互分离的组织或结构之间。水凝胶抑制组织或结构相互粘附且抑制所述组织或结构之间疤痕状纤维带的发展。可在粘连促进刺激(即，增加粘连形成、进展和/或复发的可能性的任何事件)后投与溶液。粘连促进刺激物的实例包括手术、损伤和感染。水凝胶在体内降解且因此无需去除。本发明提供通过将第一多糖衍生物与第二多糖衍生物交联形成的水凝胶，其中所述第一多糖衍生物与第二多糖衍生物不同。举例来说，第一多糖衍生物可为包含第一官能团的HA衍生物，且第二多糖衍生物可为包含第二官能团的纤维素衍生物。另举例来说，第一多糖衍生物为包含第一官能团的HA衍生物，且第二多糖衍生物为包含第二官能团的葡聚糖衍生物。第一与第二官能团可选自胺、酰胺、醛、酯、羟基或酰肼。本发明另外提供通过将第一多糖衍生物与第二多糖衍生物交联形成的水凝胶，其中所述第一多糖与第二多糖相同，且其中所述第一多糖衍生物包含第一官能团且所述第二多糖衍生物包含第二官能团，其中所述第一与第二官能团能够相互交联。多糖可例如为HA、纤维素、葡聚糖或任一者的衍生物。可使用多种多糖衍生物。在本发明某些实施例中，至少一种多糖衍生物为HA衍生物。在本发明某些实施例中，两种多糖衍生物都为HA衍生物。因此，本发明提供一种方法，其(i)将包含第一HA衍生物的溶液投与个体体内位置处；和(ii)将包含第二HA衍生物的溶液投与个体体内所述位置处，其中在所述溶液相互接触后，所述第一与第一.HA衍生物交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连形成。在本发明某些实施例中，多糖为不被对于人类为内源的酶特异性降解的多糖。不希望受任何理论的束缚，至少部分由所述多糖的衍生物形成的水凝胶可在体内具有比由HA衍生物所形成的水凝胶长的半衰期。在木发明某些实施例中，至少一种多糖衍生物为纤维素衍生物。举例来说，在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物为HA衍生物且第二多糖衍生物为纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，至少一种多糖衍生物为葡聚糖衍生物。举例来说，在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物为HA衍生物且第二多糖衍生物为葡聚糖衍生物。HA(也称为透明质素或透明质酸盐)为含有由N-乙酰基-D-葡糖胺与D-葡糖醛酸构成的重复二糖亚单元的未分枝多糖。(参看劳伦特T.C.(Laurent,T.C.)(编).,透明质素及其衍生物的生物禾卩医学应用(S/o/ogyMe&c"〖App〃c""'o/Mq/"i/ya/"ra"fl"Z)en.v""薦)，伦敦波特兰出版社(London:PortlandPress),1998)。HA的结构如下文所示。如本文所使用，术语"透明质酸(HA)"是指HA及其任何盐，例如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙等。术语"HA衍生物"是指已由上文所示的天然形式化学修饰的HA。修饰可包括添加或产生新的官能团(例如，胺、酰胺、醛、酯、羟基、酰肼等)，在此情况下，称HA"经官能化"。经修饰的二糖亚单元的比例可变化，并且可选择修饰的程度以便控制诸如胶凝时间、半衰期、硬度等特性。某些修饰保持天然HA的主链结构，而其它修饰打开至少一些糖环。举例来说，某些修饰打开葡糖酸酸部分的至少一些糖环。本发明的第一和第二HA衍生物分别包含第一和第二官能团，其相互反应形成将第一与第二HA衍生物连接在一起的共价键。因此将溶液以液体形式施用并且使其相互接触，并视情况在投药之前或投药时或者投药后相互接触之前或接触时将其混合在一起。足量交联的形成使液体转变成半固体或类凝胶状态。在本发明某些实施例中，使用包含至少两个不同官能团的HA衍生物，其中所述官能团在生理条件下相互反应形成交联。可选择官能团从而使其实质上不相互反应，直到暴露于pH值、温度和/或盐浓度的生理条件。因此，应了解，本发明不需要两个可相互区别的HA衍生物，而是可使用包含多个能够交联的不同官能团的单一物质。多种不同HA衍生物可用于本发明中。适当衍生物的重要特征在于，第一与第二官能团必须以足量反应且足够迅速，从而允许在溶液相互接触后的一段时间范围内形成水凝胶。在本发明某些实施例中，水凝胶是溶液相互接触后(例如投药后)在介于l-3秒与5分钟之间、介于1-3秒与3分钟之间、介于1-3秒与60秒之间、介于1-3秒与30秒之间或介于1-3秒与15秒之间的时间内形成。通常将溶液在投与体内一部位前混合在一起，或将溶液混合与其对体内一部位的投与同时进行。举例来说，可使用多管注射装置(例如，多管注射器)投与溶液，其中各溶液在投与前都包含于单独接受器或管中。溶液可在投与过程中和/或投与之后相互接触。优选衍生物在生理条件下，(例如)在介于6.0与8.0之间的pH值的水性环境中交联。适当HA衍生物的另一重要特征在于，所得水凝胶本身不应明显促使粘连发展、发炎或其它不合需要的作用。已提出多种适用作组织粘结剂或粘合剂的HA衍生物。与本发明的HA衍生物相比，所述衍生物可使粘连的问题恶化而非将其解决。已提出多种作为组织再生的支架的HA衍生物，其可为细胞生长和浸润提供适当环境。然而，出于抑制粘连的目的，增强细胞浸润和/或增殖的环境是不合需要的。本发明鉴别出适于原位迅速交联且形成抑制粘连的水凝胶的多糖衍生物，例如HA衍生物。可使用多种可交联多糖衍生物和形成所述衍生物的方法。在本发明某些实施例中，多糖衍生物相互交联而无需单独交联剂，例如第一和第二衍生物包含相互反应形成共价键的官能团。在本发明某些实施例中，多糖衍生物相互反应产生无毒、生物可相容产物，例如水。在本发明某些实施例中，两种多糖衍生物都未通过使用交联剂来修饰。在本发明某些实施例中，多糖衍生物在不需要光的情况下交联。在本发明一个或多个方面中，可使用多种HA衍生物。在本发明某些实施例中，通过在葡糖醛酸部分的羧基(COOH)处形成活性酯且随后执行在一端含有亲核基团且在另一端含有经保护官能团的侧链的取代来引入官能团，例如，如以下文献中所述美国专利第6,630,457号，其以引用的方式并入本文中；和布彼特P.(BulpiU，P.)和埃施利曼D.(Aeschlimann,D.)，(1999)生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)'47,152-169，其以引用的方式并入本文中。所述方法可例如用于产生包含胺或醛官能团的HA衍生物。可使用1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-轻基硫代琥珀酰亚胺且随后使用碳化二亚胺(诸如EDC)供偶联来形成HA的活性酯。能够与立即用HOBT形成的酯反应的胺包括肼和活性胺(诸如乙二胺)，其具有在适当范围内的pKa值以致其在酸性pH值(例如，约5.5到7.0)下未质子化。N-羟基硫代琥珀酰亚胺的使用使得能在约7.0到8.5的pH值下进行偶联，从而允许使用伯胺。这些方法可用于执行以下反应HA匿COOH+H2N-R—>HA-CO掘-R(I)，HA匿COOH+R'-NH-R—>HA-CO-NR'—R(II)。R和R'可为多种部分中的任一种，诸如氢、烷基、芳基、垸基芳基或芳基烷基，其可含有诸如氧、氮和硫的杂原子。侧链可分枝或未分枝的并且可为饱和，或可含有一个23或多个重键(multiplebond)。侧链的碳原子可连续，或可经一个或多个官能团分隔，诸如氧原子、酮基、氨基、氧基羰基等。侧链可经芳基部分或卤素原子取代，或可整体或部分由诸如环戊基、环己基、环庚基等环结构形成。侧链可具有末端官能团以供交联，所述官能团诸如醛、胺、芳基叠氮化物、酰肼、马来酰亚胺、巯基、酯、羧酸酯、酰亚胺酯、羟基等。因此，可使用此方法产生包含多种不同官能团中任一种的HA衍生物。适用于形成HA衍生物的碳化二亚胺可提供如下R—N=C=N—R',(III)。R和R'可为(例如)如上文所述的多种部分中的任一种。举例来说，R和R'可独立地选自由以下各基团组成的群组氢、具有l-25个碳原子的烃基且包括经取代烃基、烷氧基、芳氧基、垸芳氧基等。举例来说，R和R'可为垸基、环垸基、芳基或其经取代形式。在本发明某些实施例中，使用例如在约20-8(TC范围内的温度下至少部分可溶于水性介质中的碳化二亚胺。例示性碳化二亚胺包括EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)、ETC(l-(-3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺甲碘化物)、N，N'-二环己基碳化二亚胺、N-烯丙基-N'-((3-羟乙基)碳化二亚胺、N-(a-二甲基氨基丙基)-N'-叔丁基碳化二亚胺、N-(a-二甲基氨基丙基)-N'-(p-溴烯丙基)碳化二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-(6-苯甲酰基氨基己基)碳化二亚胺和N-环己基-N'-(3-(4-甲基吗啉鎿)乙基碳化二亚胺(CMC)等。在本发明某些实施例中，侧链包含二酰肼。可如上文所述形成包含二酰肼的HA衍生物。也可使用用于形成包含二酰肼官能团的HA衍生物的其它方法。举例来说，美国专利第5，616，568号(其以引用的方式并入本文中)教示一种利用二酰肼使HA官能化以形成二酰肼基-HA的方法。首先将二酰肼添加到HA中，随后添加碳化二亚胺。所述反应可在约4-0的pH值下进行且可如下文所示HA-—COOH+H2N—-NH---CO—A—CO—NH—NH2(二酰肼)(IV)丄R'—-N=C=N—R"(碳化二亚胺)HA—CO—NH—NH—CO—A—CO—NH—-NH2(二酰肼基-HA)(V)。可将多种二酰肼用于上述反应中，其中A表示可变间隔基。举例来说，A可为烃基、杂烃基、经取代烃基、经取代杂烃基等，其中这些术语是如美国专利第5,616,568号中所述和例示使用。在本发明某些实施例中，二酰肼具有下式NH2NHCO(CH2)n，CONHNH2(VI)，其中n=l到18。举例来说，有用的二酰肼包括琥珀酸(丁二酸)(n=2)、肥酸(己二酸)(n=4)、木栓酸(辛二酸)(n=6)、草酸(乙二酸)(n=0)、縮苹果酸(丙二酸)(n=l)、胶酸(戊二酸)(n=3)、蒲桃酸(庚二酸)(n=5)、杜鹃花酸(壬二酸)(n=7)、皮脂酸(癸二酸)(n=8)、十二垸二酸(n=10)、巴西基酸(十三烷二酸)二酰肼(n=ll)等，至多n=20。适当的碳化二亚胺已于上文论述。经二酰肼(肥酸二酰肼)官能化的适当HA衍生物的结构展示于下文中且将在本文中称为HA-ADH。箭头指示修饰HA的位置(即，葡糖醛酸部分的羧基处)。在本发明某些实施例中，并不是通过修饰葡糖醛酸部分的羧基，而是通过氧化葡糖醛酸部分的羟基形成酸基来形成包含醛官能团的HA衍生物。可使用多种氧化剂，例如高碘酸盐，例如高碘酸钾(KI04)、高碘酸钠(NaI04)或HI04。其它氧化剂包括高锰酸盐、铬酸盐或二铬酸盐。此经氧化HA衍生物的结构展示于下文中且将在本文中称为HA-CHO。箭头指示修饰的位点。应了解，在上述修饰方案中的任一种中，HA中仅一部分糖部分经修饰。修饰的范围可改变。举例来说，在本发明某些实施例中，介于5%与99-100%之间的相关糖部分(例如，在上述修饰的情况下的葡糖醛酸部分)经修饰。在本发明某些实施例中，介于10%与75%之间的相关糖部分经修饰。可通过多种方法控制修饰的范围。举例来说，使反应进行的温度、pH值和时间可随试剂(例如，碳化二亚胺、酰胺、二酰肼等)浓度而变。为实现较高修饰程度，可使用过量的修饰剂，例如二酰肼和/或碳化二亚胺。举例来说，在--个实施例屮，将10-100倍过量的二酰肼添加到包含HA的溶液中，和/或随后将2-100倍过量的碳化二亚胺试剂添加到反应混合物中。在本发明某些实施例中，选择这些参数的值以便实现相对较高的修饰程度，例如使介于50%与99-100%之间的相关糖部分修饰。举例来说，可使介于50%与80%之间的相关糖部分修饰。然而，保持足够低的修饰程度从而使溶液保持适当的流体状态，而不是变得过于粘稠以致不易于处理和注射。在本发明某些实施例中，介于10%与30%之间或介于30%与50%之间的相关糖部分经修饰。可通过使包含不同官能团的衍生物相互反应来交联如上文所述经官能化的HA衍生物。举例来说，(i)包含酸的第一HA衍生物可与包含胺的第二HA衍生物反应；(ii)包含活性酯(诸如NHS酉旨)的第一HA衍生物可与包含胺的第二HA衍生物反应；(iii)包含马来酰亚胺的第一HA衍生物可与包含巯基的第二HA衍生物反应；(iv)包含酰肼的第一HA衍生物可与包含醛的第二HA衍生物反应等。在本发明某些实施例中，将HA衍生物通过除二硫键外的其它键连接在一起。在特别值得关注的一个实施例中，第一溶液含有包含经二酰肼官能化的葡糖酸酸部分的HA衍生物，且第二溶液含有在HA的葡糖醛酸部分的羟基处经氧化形成醛基的HA衍生物。如下文示意性展示，第一与第二HA衍生物交联形成腙化合物，其中R,和R2表示HA(或在本发明某些实施例中表示另一多糖，诸如纤维素衍生物)的部分。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>本发明的发明者已证实，通过某些HA衍生物交联而原位形成的水凝胶甚至在不存在水凝胶的情况下100%个体都将会发展粘连的条件下也展现显著的抑制粘连的能力(参看实例)。令人惊讶的是，包含HA衍生物的某些水凝胶(其中天然HA主链结构经葡糖醛酸环氧化而改变)会抑制粘连并且显现低细胞毒性和良好的生物可相容性，即使可能预期破坏天然HA主链结构可能会使组合物在活体内促发炎和/或具免疫原性。本发明一方面为以下发现可例如通过改变溶液中多糖衍生物的浓度和/或分子量来控制由交联多糖衍生物(诸如HA衍生物)所形成的水凝胶的某些重要参数，诸如胶凝时间和降解速率。本发明一方面涉及以下发现溶液中HA衍生物的高浓度可通过适当选择未经修饰HA的分子量和/或修饰程度来实现。具体来说，已发现，通过降低未经修饰的HA衍生物的分子量，可增加通过修饰HA所产生的HA衍生物的可达到的浓度。因此，由修饰较低分子量的HA产生的HA衍生物的溶解度高于由对较高分子量HA进行相同修饰所产生的衍生物的溶解度，由此能达到较高浓度，而不会使组合物过于粘稠而不易于处理和注射。本发明提供一种包含溶液形式的HA衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度大于5mg/ml，例如高达150mg/ml。在某些实施例中，HA衍生物的浓度高于10mg/ml。在其它实施例中，HA衍生物的浓度高于15mg/ml或高于25mg/ml。所述浓度可为至少26mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml等。出于本发明的目的，高于25mg/ml的HA衍生物的浓度称为"高浓度"。本发明另外提供一种包含溶液形式的HA衍生物的组合物，其中所述HA衍生物的浓度介于50mg/ml与100mg/ml之间，例如介于50mg/ml与75mg/ml之间。所述溶液优选具有足够低的粘度，因此其易于处理，例如由此易于注射。HA衍生物可为上文所述HA衍生物中任一种。举例来说，HA衍生物可为HA-ADH或HA-CHO。在本发明某些实施例中，将HA衍生物溶解于水性介质中。本发明另外提供制造水凝胶的方法，其包含使包含第一HA衍生物的第一溶液与包含第二HA衍生物的第二溶液相互接触，其中所述溶液中至少一种具有较高的HA衍生物浓度。水凝胶可用于本文所述的任何目的，且视情况包含生物活性27剂和/或颗粒。本发明另外提供通过使包含第一HA衍生物的第一溶液与包含第二HA衍生物的第二溶液接触且使所述衍生物交联(视情况原位交联)所形成的水凝胶，其中所述第--溶液中第一HA衍生物的浓度、所述第二溶液中第二HA衍生物的浓度或二者都高于5mg/ml、高于10mg/ml、高于15mg/ml或高于25mg/ml。在本发明某些实施例中，第一溶液中第一HA衍生物的浓度、第二溶液中第二HA衍生物的浓度或二者介于50mg/ml与100mg/ml之间，例如介于50mg/ml与75mg/ml之间。如实例中所述，已令人惊奇地发现，由包含至少一种高浓度HA衍生物的溶液形成的水凝胶展现(i)缩短的"胶凝时间"(意思指HA衍生物在相互接触后交联形成凝胶所需的时间)；(ii)降低的降解速率和由此增加的半衰期(意思指水凝胶湿重降低50%所需的时间)；或(iii)縮短的胶凝时间与降低的降解速率。举例来说，当HA-ADH和HA-CHO溶液的浓度分别从20mg/ml增加到75mg/ml禾Q30mg/ml时，由交联第一与第二HA衍生物(HA-ADH与HA-CHO)形成的水凝胶的半衰期从5天增加到U天，并且当所述浓度增到75mg/ml和60mg/ml时，所述半衰期增加到22.5天或51天(参看实例)。因此，本发明提供由交联HA衍生物形成的水凝胶，其中所述水凝胶具有超过IO天、例如介于约10天与约50天之间的半衰期。应了解，可使用多种不同方法测量胶凝时间和降解速率。适当的方法提供于本文中。然而，应了解，尽管本文所使用的特定方法适用于量化改变浓度和/或分子量的作用，但关于控制胶凝时间和降解速率的一般发现与用于评估这些参数的特定方法无关。还应了解，尽管已使用特定HA衍生物说明本发明的这些方面，但并非以任何方式将本发明限于这些特定衍生物。本发明另外提供包含诸如纤维素和葡聚糖等其它多糖衍生物的组合物，其中所述多糖衍生物的浓度如上文关于HA衍生物所述。参看下文实例12和13。所述衍生物可包括(但不限于)官能化纤维素或官能化纤维素衍生物。可使用的其它衍生物包括(但不限于)官能化葡聚糖和官能化葡聚糖衍生物。也可使用其它天然和合成多糖及其衍生物制备本发明的组合物。因此，本发明包括与本文关于HA衍生物所述类似且如适用于其它水凝胶前体(例如包括本文所述衍生物的其它多糖衍生物，例如纤维素衍生物和葡聚糖衍生物)的组合物和方法。由原位交联多糖衍生物所形成的水凝胶抑制粘连的显著能力不限于HA衍生物。本发明的发明者已证实，由交联某些HA衍生物和某些纤维素衍生物在原位形成的水凝胶具有类似的粘连抑制作用(实例11和12)。举例来说，由交联HA衍生物与多种纤维素衍生物(其中天然纤维素主链的结构已通过氧化糖环而改变)中任一种所形成的水凝胶也抑制粘连并且在腹膜内展现良好的生物可相容性(实例11和12)。本发明另外提供一种抑制粘连的方法，其包含(i)将HA衍生物投与个体体内位置处；和(ii)将纤维素衍生物投与个体体内所述位置处，其中所述HA衍生物与纤维素衍生物在相互接触后交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连。可将HA衍生物与纤维素衍生物溶解于实质上同时投与个体的独立溶液中。纤维素为P-D-吡喃葡萄糖单元相互连接的线性聚合物(卡米德(Kamide)，纤维素和纤维素衍生物分子特征和其应用(CelluloseAndCelluloseDerivatives:MolecularCharacterizationandItsApplications),爱思唯尔(Elsevier)，2005)。术语"纤维素衍生物"是指己由其天然形式化学修饰的纤维素。在本发明某些实施例中，多糖为纤维素衍生物，诸如甲基纤维素(MC)、羧甲基纤维素(CMC)、羟甲基纤维素(HMC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其中一个或多个OH基团经OR置换，其中R表示多种部分中的任一种。应了解，上文提及的纤维素衍生物中任一种的葡萄糖部分中有一些但非全部经修饰(参看图12)。一般来说，可使用与上文关于HA衍生物所述类似的方式制备可交联纤维素衍生物。举例来说，将纤维素或纤维素衍生物修饰以形成官能化纤维素衍生物，其包括能够与适当的第二官能团(例如，HA衍生物上的官能团)共价连接的官能团，诸如胺、酰胺、醛、酯、羟基或酰肼。举例来说，如本文关于HA所述，可通过氧化葡萄糖部分中的一些羟基形成醛基来形成包含醛官能团的纤维素衍生物。通过氧化葡萄糖部分的羟基形成醛基所形成的MC、CMC和HPMC的衍生物在本文中分别称为MC-CHO、CMC-CHO和HPMC-CHO(参看图12)。类似命名可用于其它纤维素衍生物。本发明提供一种包含溶液形式的纤维素衍生物的组合物，其中所述纤维素衍生物的浓度大于5mg/ml,例如高达150mg/ml。在某些实施例中，纤维素衍生物的浓度高于10mg/ml。在其它实施例中，纤维素衍生物的浓度高于15mg/ml、高于20mg/ml或高于25mg/ml。出于本发明的目的，高于25mg/ml的纤维素衍生物的浓度称为"高浓度"。所述溶液优选具有足够低的粘度，因此其易于处理，例如由此易于注射。纤维素衍生物可为本文所述纤维素衍生物中的任一种。举例来说，纤维素衍生物可为MC-CHO、CMC-CHO禾口HPMC-CHO。在本发明某些实施例中，使用包含二酰肼官能团的HA衍生物和包含醛基的纤维素衍生物形成水凝胶。举例来说，第一溶液可包含HA-ADH且第二溶液可包含MC-CHO、CMC-CHO或HPMC-CHO。HA与纤维素衍生物交联形成以下腙化合物HA-CMC、HA-HPMC禾口HA-MC。另外，本发明的发明者也己展示，由交联某些HA衍生物和某些葡聚糖衍生物在原位形成的水凝胶具有类似的粘连抑制作用(实例13)。举例来说，由交联HA、纤维素或其它葡聚糖衍生物与天然葡聚糖主链的结构已改变的葡聚糖衍生物所形成的水凝胶也抑制粘连并且在腹膜内展现良好的生物可相容性(实例13)。本发明另外提供一种抑制粘连的方法，其包含(i)将HA或纤维素衍生物投与个体体内位置处；和(ii)将葡聚糖衍生物投与个体体内所述位置处，其中所述HA或纤维素衍生物与葡聚糖衍生物在相互接触后交联形成水凝胶，且其中所述水凝胶抑制粘连。可将HA或纤维素衍生物与葡聚糖衍生物溶解于实质上同时投与个体的独立溶液中。葡聚糖为一种复杂的分枝多糖。葡聚糖包括许多经由(xl—6糖苷键联连接在一起形成直链的葡萄糖部分。分枝通常由otl—3键联开始，但其也可从ot1—2或al—4键联开始。葡聚糖直链部分的结构绘示于图22中。术语"葡聚糖衍生物"是指己从其天然形式化学修饰的葡聚糖。在本发明某些实施例中，多糖为葡聚糖衍生物，其中一个或多个OH基团经OR置换，其中R表示多种部分中任-种。在其它实施例中，葡聚糖衍生物为葡聚糖已经高碘酸盐处理的含醛衍生物。应了解，上文提及的葡聚糖衍生物中任一种的葡萄糖部分中有一些但非全部经修饰(参看图22)。一般来说，可使用与上文关于HA或纤维素衍生物所述类似的方式制备可交联葡聚糖衍生物。举例来说，将葡聚糖或葡聚糖衍生物修饰以形成官能化纤维素衍生物，其包括能够与适当的第二官能团(例如，HA衍生物上的官能团)共价连接的官能团，诸如胺、酰胺、醛、酯、羟基或酰肼。举例来说，如本文关于HA和纤维素所述，可通过氧化葡萄糖部分中的一些羟基以形成醛基来形成包含酸官能团的葡聚糖衍生物。通过氧化葡萄糖部分的羟基以形成醛基所形成的葡聚糖衍生物在本文中称为DX-CHO(参看图22)。经酰肼基团修饰的羧甲基葡聚糖(CMDX)的衍生物称为CMDX-ADH(参看图22)。本发明提供一种包含溶液形式的葡聚糖衍生物的组合物，其中所述葡聚糖衍生物的浓度大于5mg/ml，例如高达150mg/ml。在某些实施例中，葡聚糖衍生物的浓度高于10mg/ml。在其它实施例中，葡聚糖衍生物的浓度高于15mg/ml、高于20mg/ml或高于25mg/ml。出于本发明的目的，高于25mg/ml的葡聚糖衍生物的浓度称为"高浓度"。所述溶液优选具有足够低的粘度，因此其易于处理，例如由此易于注射。葡聚糖衍生物可为本文所述葡聚糖衍生物中的任一种。举例来说，葡聚糖衍生物可为DX-CHO或CMDX-ADH。在本发明某些实施例中，使用包含二酰肼官能团的HA或纤维素衍生物和包含醛基的葡聚糖衍生物。举例来说，第一溶液可包含HA-ADH且第二溶液可包含DX-CHO。HA与葡聚糖衍生物交联形成HA-DX。在本发明某些实施例中，使用包含二酰肼官能团的纤维素衍生物和包含醛基的葡聚糖衍生物。举例来说，第一溶液可包含CMC-ADH且第二溶液可包含DX-CHO。另举例来说，第一溶液可包含CMDX-ADH且第二溶液可包含CMC-CHO。纤维素与葡聚糖衍生物交联形成CMC-DX。在本发明某些实施例中，使用包含二酰肼官能团的葡聚糖衍生物和包含醛基的另一葡聚糖衍生物。举例来说，第一溶液可包含CMDX-ADH且第二溶液可包含DX-CHO。纤维素与葡聚糖衍生物交联形成CMDX-DX。应了解，在上述实施例的任一个中，第一和第二多糖衍生物上仅一部分可用官能团交联。可通过例如适当选择多糖衍生物的分子量来控制交联密度。例示性交联密度在约1x106到约1x1()8mol/cm3的范围内。在某些实施例中，交联密度在3-50x107mol/cm3的范围内。在本发明某些实施例中，多糖衍生物在投与之前形成为水凝胶微米颗粒而非以溶液形式投与。水凝胶颗粒可悬浮于液体介质屮并且投与至体内位置处。在本发明某些实施例中，至少一种适于原位交联形成抑制粘连和/或用于本文所述其它目的的组合物的多糖衍生物包含含非多糖聚合物的一部分，例如，所述多糖衍生物包含与一种或多种非多糖聚合物共价连接的多糖或其衍生物。非多糖意思指所述聚合物含有以重量、数量或二者计不到1%的糖单体，例如所述聚合物基本上不含糖。在本发明某些实施例巾，非多糖部分包含以重量计介于1%与10%-90%之间的聚合物，和/或介于1%与10%-90%之间的单体为非糖单体。连接可发生于多糖链中任一位置处，例如所述链的任一端或产生线性或分枝结构的内部定位的糖部分的一者处。非多糖聚合物可为多种聚合物中任一种，例如当与多糖衍生物共价连接时能够用作水凝胶前体的任何非多糖聚合物。通常，所述聚合物为亲水性聚合物，即其对水具亲和力且其可溶于水中。适当的非多糖聚合物包括(但不限于)聚醚(诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多肽(诸如，明胶、聚(l-谷氨酸)、聚赖氨酸(PLL))和这些物质中任一种的衍生物或包含这些物质中任一种的连结物、掺合物或复合物。举例来说，在一个实施例中，至少一种多糖衍生物为共价连接PEG或PEG衍生物的HA衍生物，其中HA部分或PEG部分包含第一官能团。第二多糖衍生物可为包含与第一官能团反应的官能团的任何多糖衍生物。举例来说，在一个实施例中，HA衍生物为PEG-HA-ADH，且第二多糖衍生物包含与二酰肼反应的官能团，例如HA-CHO。包含促进形成共价键的适当官能团的多种PEG衍生物在市面有售。例如参看，内克塔先进聚乙二醇化2005-2006产品目录(NektarAdvancedPegylation2005-2006ProductCatalog),内克塔治疗公司(NektarTherapeutics),力口州圣卡洛斯(SanCarlos,CA)，其描述多种所述化合物。在本发明某些实施例中，使用第一和第二可交联水凝胶前体，其中一种水凝胶前体包含诸如HA、纤维素或葡聚糖衍生物等多糖衍生物或由诸如HA、纤维素或葡聚糖衍生物等多糖衍生物组成，且另一水凝胶前体包含非多糖聚合物或由非多糖聚合物组成(即，不到1重量％聚合物或不到1%单体为糖)。能够与多糖衍生物交联形成水凝胶的例示性非多糖聚合物包括(但不限于)聚醚(诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯垸酮(PVP)、多肽(诸如，明胶、壳聚糖或聚(l-谷氨酸))和这些物质中任一种的衍生物或包含这些物质中任一种的连结物、掺合物或复合物。在例示性实施例中，第一可交联水凝胶前体为HA-ADH且第二可交联水凝胶前体为包含醛基的PEG衍生物。尽管在本文中已详细描述多糖衍生物以例示说明本发明，但在本发明其它实施例中，水凝胶是由原位交联两种非多糖聚合物从而产生抑制粘连的水凝胶来形成。各非多糖聚合物包含官能团，其中所述官能团能够相互反应形成共价键。适当的官能团为上文关于交联多糖衍生物所述的官能团。例示性非多糖聚合物包括上文所述的含有或经修饰以含有供交联的适当官能团的聚合物。II.包含可交联多糖衍生物和生物活性剂的组合物本发明另外提供如上文所述的组合物，其中水凝胶是由交联水凝胶前体从而产生包含生物活性剂的水凝胶形成。举例来说，含有第一多糖衍生物的溶液、含有第二多糖衍生物的溶液或二者包含一种或多种生物活性剂。因此，由交联第一与第二多糖衍生物所形成的水凝胶含有一种或多种生物活性剂。在本发明一些实施例中，所述溶液各自包含不同生物活性剂。由此形成的水凝胶含有两种或两种以上生物活性剂。或者，可将含有第一和第二水凝胶前体的溶液与一种或多种各自含有一种或多种生物活性剂的其它溶液组合。在另一实施例中，将生物活性剂立即添加到由组合第一与第二溶液所形成的组合物中。多糖衍生物可例如为HA衍生物、纤维素衍生物、葡聚糖衍生物等。在本发明某些实施例中，第一与第二多糖衍生物为HA衍生物。在本发明某些实施例中，第一与第二多糖衍生物为纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，第一与第二多糖衍生物为葡聚糖衍生物。在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物为HA衍生物且第二多糖衍生物为纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物为HA衍生物且第二多糖衍生物为葡聚糖衍生物。在本发明某些实施例中，第一多糖衍生物为纤维素衍生物且第二多糖衍生物为葡聚糖衍生物。在本发明某些实施例中，水凝胶是由三种或三种以上多糖衍生物形成。HA衍生物、纤维素衍生物、葡聚糖衍生物、其它多糖衍生物或其它聚合物的任何组合可交联形成本发明的水凝胶。由交联多糖衍生物所形成的水凝胶中可包括任何生物活性剂。因此本发明提供含有多种生物活性剂中任一种的水凝胶。本发明另外提供一种溶液，其含有诸如HA、纤维素或葡聚糖衍生物等多糖衍生物和多种生物活性剂中任一种。本发明另外提供一种制备包含生物活性剂的水凝胶的方法，所述方法包含以下步骤使包含第一多糖衍生物的第一溶液与包含第二多糖衍生物的第二溶液相互接触，其中所述溶液中至少一种包含生物活性剂，且其中所述第一和第二多糖衍生物包含相互交联的官能团。本发明另外提供一种制备包含生物活性剂的水凝胶的方法，所述方法包含以下步骤使包含第一多糖衍生物的第一溶液、包含第二多糖衍生物的第二溶液与生物活性剂相互接触，其中所述第一和第二多糖衍生物包含相互交联的官能团。生物活性剂视情况为溶液形式。在本发明某些实施例中，通过将所述溶液投与个体来制备水凝胶，其中所述水凝胶前体相互交联形成封装生物活性剂的水凝胶。在本发明某些实施例中，生物活性剂为治疗剂。有用的生物活性剂种类包括抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂(例如细胞毒性剂)、抗肿瘤剂(即，抑制或预防恶性细胞增殖和/或抑制或预防肿瘤生长或扩散的药剂)、止痛剂(即缓解疼痛的药剂)、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂(即，抑制或预防血栓形成但不溶解现有血栓的药剂，也称为抗血栓形成剂)、蛋白水解剂或增强蛋白水解的药剂(其中一些也为抗血栓形成剂)、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂(例如，抗TGF-P剂、D-青霉胺、己酮可可碱(pentoxifyllin))等。其它有用的治疗剂种类包括催眠药、镇静剂、安定剂、抗惊厥剂、肌肉松弛剂、镇痉剂、拟交感神经药、心血管类药物(例如，抗心律失常药、正性肌力药物)等。在本发明某些实施例中，生物活性剂不为麻醉剂。在本发明某些实施例中，生物活性剂不为抗增殖剂。在某些实施例中，生物活性剂为消炎剂。在某些实施例中，生物活性剂为非甾体消炎剂。在其它实施例中，生物活性剂为甾体消炎剂(例如糖皮质激素、皮质类甾醇)。优选添加一定量生物活性物质，所述量为当将适量包含多糖衍生物和/或非多糖聚合物的溶液投与个体时医药学有效的量，其可变化。所述药剂可抑制或不可抑制粘连。应了解，一些药剂不只属于一类且可具有多种作用机制。不打算将特定药剂的列表限制为一个类别的成员。用于本发明中的例示性抗感染剂的类别为喹诺酮、(3-内酰胺(例如，青霉素33(penicillin)或头孢菌素(cephalosporin))、碳青霉烯(carbapenem)、氨基糖苷、大环内酯、林可酰胺(lincosamide)、酮内酯、四环素、甘氨酰环素、林可霉素、噁唑烷酮、酰胺醇(amphenicol)、安莎霉素(ansamycin)、多粘菌素(polymyxin)、氨甲环素(aminomethlycycline)、林可酰胺、链阳性菌素(streptogramin)、2，4-二氨基嘧啶、硝基呋喃、磺酰胺、砜、利福布汀(rifabutin)、氨苯砜(dapsone)、肽、糖肽和核苷类似物。在本发明某些实施例中，抗感染剂为针对多种细菌物种具有广谱活性的药剂。在一些实施例中，所述药剂对一种或多种革兰氏阳性细菌(grampositivebacteria)物种、一种或多种革兰氏阴性细菌物种或二者有效。在本发明某些实施例中，所述药剂对可能会污染手术创口或损伤的细菌或真菌有效。举例来说，所述药剂对通常见于皮肤上或胃肠道中的细菌或真菌有效。可使用的特定抗感染剂的实例包括(但不限于)红霉素(erythromycin)、萘夫西林(nafcillin)、头孢唑林(cefazolin)、亚胺培南(imipenem)、氨曲南(aztreonam)、庆大霉素(gentamicin)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、万古霉素(vancomycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、甲氧节P定(trimethoprim)、禾廿福平(rifampin)、甲石肖挫(metronidazole)、克林霉素(clindamycin)、替考拉宁(teicoplanin)、莫匹罗星(mupirocin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、萘啶酮酸(nalidixicacid)、司帕沙星(sparfloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、氨氟沙星(amifloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、美满霉素(minocycline)、利奈唑酮(linezolid)、替马沙星(temafloxacin)、托氟沙星(tosufloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、舒巴坦(sulbactam),克拉维酸(clavulanicacid)、两性霉素B(amphotericinB)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoco腿ole)禾口制霉菌素(nystatin)。用于本发明中的消炎剂的例示性种类包括多种非甾体消炎剂(例如，环氧化酶-l抑制剂)、皮质类甾醇、糖皮质激素和消炎抗体或多肽。例示性消炎剂包括泼尼松、地塞米松、氟米龙(fluorometholone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、氯倍他索(clobetasol)、卤贝他索(halobetasol)、氢化可的松(hydrocortisone)、曲安奈德(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、肤轻松(fluocinolone)、氟西柰德(fluoci廳ide)、氯替泼诺(loteprednol)、甲羟松(medrysone)、利美索龙(rimexolone)、塞来考昔(cele醒ib)、叶酸(folicacid)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(difiunisal)、菲诺洛芬(fen叩rofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那酸盐(meclofenamate)、甲氯方酸盐(meclofamate)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、水杨酸水杨酸酯(salsalate)、萘丁美酮(nabumetone)、奥沙普秦(oxaprozin)、托美汀(tolmetin)、硫酸羟基氯喹(hydroxychloroquinesulfate)、罗夫考克斯(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、因福利美(infliximab),来氟米特(lefiunomide)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、水杨酸盐(salicylates)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、布洛芬(ib叩rofen)、布地奈德(budesonide)、美洛昔康(meloxicam)、醋酸甲基泼尼松(methylprednisoloneacetate)、金硫丁二钠(goldsodiumthiomalate)、阿司匹林(aspirin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、醋酸曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、萘磺酸右丙氧芬/乙酰氨基酚(propxyphenenapsylate/apap)、口十酸盐(folate)、萘『美酮(nabumetone)、双氯芬酸(diclofenac).酮咯酸(ketorolac),吡罗昔康(piroxicam)、依托度酸(etodolac)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、双氯芬酸钾(diclofenacpotassium)、奥沙普秦(oxaprozin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美满霉素(minocycline)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))和雷帕霉素类似物、保泰松(phenylbutazone)、双氯芬酸钠/米索前列醇(diclofenacsodium/misoprostol)、乙酰氨基酚(acetaminophen)、卩引哚美辛(indomethacin)、硫酸葡糖胺/软骨素(glucosaminesulfate/chondroitin)和环孢霉素(cyclosporine)或其类似物等。例示性非甾体消炎剂(NSAID)包括塞来考昔、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、水杨酸盐、菲诺洛芬、布洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯方酸盐、甲氯芬那酸盐、美洛昔康、萘普生、吡罗昔康、舒林酸、水杨酸水杨酸酯、萘丁美酮、阿司匹林、奥沙普秦和托美汀。例示性甾体消炎剂包括地塞米松、氟米龙、泼尼松龙、氯替泼诺、甲羟松、泼尼松、甲基泼尼松、可的松、布地奈德、利美索龙、氯倍他索、卤贝他索、氢化可的松、曲安奈德、倍他米松、肤轻松和氟西柰德。值得关注的其它消炎剂包括结合TNF-ct的抗体(例如，因福利美，类克@(Remicade))和作为可溶性TNF-a受体的多肽(例如，依那西普，恩博@(Enbrd⑧))。消炎剂的其它实例为抑制细胞因子的消炎药物(cytokinesuppressiveantiinflammatorydrug,CSAID);抗TNFa抗体(例如参看美国公开案第20040126372号，其以引用的方式并入本文中)；cA2/因福利美(嵌合抗TNF(x抗体；森托克公司(Centocor));IL-4(消炎细胞因子;IL-IO、IL-10禾口/或IL-4激动齐U(例如，激动剂抗体或小分子)；IL-l受体拮抗剂；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白)；磷酸二酯酶IV型抑制剂；沙利度胺(thalidomide)和沙利度胺相关药物；来氟米特(leflunomide);氨甲环酸(tranexamicadd)和其它纤溶酶原活化抑制剂；前列腺素El、替尼达普(tenidap)、抗IL-12抗体；抗IL-18抗体；白细胞介素-ll;白细胞介素-13;白细胞介素-17抑制剂；金；青霉胺；氯喹(chloroquine);羟基氯喹；苯丁酸氮芥(chlorambucil);环磷酰胺(cyclophosphamide);环孢霉素；全身淋巴结照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗CD4抗体；CD5-毒素；经口投与的肽和胶原蛋白；氯苯扎利二钠(lobenzaritdisodium);ICAM-1短干扰RNA(siRNA)或反义寡核苷酸可溶性互补受体l。用于本发明中的血管生成抑制剂包括抑制或拮抗血管内皮生长因子(VEGF)或其受体的药剂(在本文中称为"抗VEGF剂")。有用的药剂例如包括结合一种或多种VEGF同功异型物或VEGF受体的抗体、抗体片段和核酸。所述结合可例如抑制一种或多种VEGF同功异型物与其受体之间的相互作用。阿瓦斯丁(Avastin)(基因泰克公司(Genentech))是一种也结合VEGF的全长人化抗体(评论于费拉拉N.(Ferrara,N.)内分泌学评论(E油cr尺ev.),25(4):581-611，2004中)。卢森替斯(Lucentis)(基因泰克公司)是一种结合且抑制血管内皮生长因子A(VEGF-A)的人化抗体片段。(戈德罗J.(Gaudreault,J.)等人，眼科学研究与视力学(/"vewOpAf/w/mo/.V!i)46,726-733(2005)和其中的参考文献)。马库根(Macugen)(辉瑞公司(Pfizer)，安娜泰克公司(Eyetech))是一种结合且抑制VEGF165的VEGF核酸配体(也称为适体)(美国专利第6,051,698号)。结合--1中或多种VEGF同功异型物的这些和其它适体或抗体都可用于本发明中。其它血管生成抑制剂包括各种内源或合成肽，诸如血管抑素(angiostatin)、艾瑞斯坦(arresten)、坎斯他汀(canstatin)、科姆他汀(combstatin)、内皮抑素(endostatin)、凝血栓蛋白(thrombospondin)和肿瘤抑素(tumstatin)。其它抗血管生成分子包括沙利度胺和其抗血管生成衍生物，诸如iMiD(芭密斯A(BamiasA)，季莫普洛斯(DimopoulosMA.)欧洲国际医学杂志(EurJInternMed.)14(8):459-469,2003;巴利特JB(BartlettJB)，德瑞吉K(DredgeK)，戴雷希AG.(DalgleishAG.)癌症自然评论(iVflf/evOmc")4(4):314-22，2004)。抗增殖剂的例示性种类包括垸化剂、磺酸垸酯、氮丙啶、乙撑亚胺和甲基密胺(methylamelamine)、氮芥、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、雄激素、抗雄激素、抗肾上腺、阿拉伯糖苷、抗雌激素、紫杉垸、铂类似物、微管抑制剂(例如微管解聚剂或稳定剂)、拓扑异构酶抑制剂、组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂、聚集体抑制剂、蛋白酶体抑制剂、促凋亡剂、激酶抑制剂、放射性同位素、动物、植物或细菌毒素等。属于这些种类的药剂的特定实例包括垸基化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide);磺酸烷酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麦曲多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa);乙撑亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰月安(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基密胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustard),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、铬磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(est醒ustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥盐酸盐(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥子气(uracilmustard);硝基脲(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(ca腿stine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，诸如阿克莱诺霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、奥瑟霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、束lj抱毒素(calicheamicin)、卡洛比星(carabicin)、洋红霞素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detombicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(Adriamycin))、表柔比星(epimbicin)、依索比星(esombicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、博替罗霉素(potfiromycin)、嘌霉素(puromycin)、奎拉霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin);抗代谢物，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimet隨te);嘌呤类似物，诸如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)、5-FU;雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone);抗雄激素，例如雄激素受体拮抗剂，诸如螺内酯(spironolactone),氟他胺(flutamide)、非那雄胺(finasteride);抗肾上腺素，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂(folicacidreplenisher)，诸如叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖啶(amsacrine);贝曲布辛(bestrabucil);比生群(bisantrene);伊达曲仙(edatraxate);德弗法明(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);伊弗尼辛(elfornithine);依利醋铵(elliptiniumacetate);依托格鲁(etoglucid);石肖酸镓(galliumnitrate);羟基脲(hydroxyurea);香蔬多糖(lenti薩)；洛尼达宁(lonidainine);米托狐月宗(mitoguazone);米托葱酉昆(mitoxantrone);莫口比丹莫(mopidanmol);尼曲伊宁((nitmerine);喷司他丁(pentostatin);蛋胺氮芥(phenamet);比柔比星(pirarubicin);足叶草酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗉(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露糖醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);瓜西托辛(gacytosine);阿拉伯糖苷("Ara-C");噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(doxetaxel);苯丁酸氮芥；吉西他宾(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);钼；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);丝裂霉素C;米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);长春花碱(vinblastine);长春瑞宾(vinorelbine);诺维本(navelbine);诺凡特龙(novantrone);替尼泊苷(teniposide);道诺霉素；氨基喋呤(aminopterin);截瘤达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS2000;白喉毒素(diphtheriatoxin);蓖麻毒素(ricin);作i单胞菌毒素A(pseudomonastoxinA);芋螺毒素(conotoxin);二氟甲基鸟氨酸(础uo醒ethylornithine(DMFO));视黄酸；埃斯波霉素(esperamicin);卡西他宾(capecitabine);HER-2抗体(赫赛汀⑧(Herceptin));激酶抑制剂，诸如格列卫@(Gleevec),和上述任何物质的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。适用于本发明中的蛋白水解剂包括组织纤溶酶原活化剂(tPA)/纤溶酶级联的组分。tPA/纤溶酶级联的组分包括纤溶酶原活化剂，诸如组织纤溶酶原活化剂(tPA)和其变体、纤溶酶原和纤溶酶。纤溶酶原活化剂(PA)为通过裂解单一肽键(R561-V562)得到两条保持二硫键桥连接的链来催化纤溶酶原转化为纤溶酶(瓦萨里(Vassam)1991)的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶是一种有效的丝氨酸蛋白酶，其在活体内的主要底物为纤维蛋白(血栓的蛋白质组分)。在存在纤维蛋白的情况下，tPA刺激纤溶酶原活化。纤溶酶具有多种底物并且能够直接或间接裂解许多其它蛋白质，包括ECM中所见的大部分蛋白质。如此处所使用，"直接"意思指蛋白酶与经裂解的多肽实体相互作用，而"间接"意思指蛋白酶不与经裂解的多肽实体相互作用，而是其与另一分子(例如，另一蛋白酶)相互作用，所述另一分子再直接或间接裂解所述多肽。纤溶酶还能够活化金属蛋白酶前体。金属蛋白酶又降解ECM分子。金属蛋白酶也可用于本发明的某些实施例中。已在哺乳动物中鉴别出两种PA，组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA)。PA的主要生理学功能在于通过将纤溶酶原活化成降解纤维蛋白的纤溶酶来引发血栓溶解。用于本发明中的tPA可来自任何物种，但对于对人类投与来说，通常优选使用人类tPA或其变体。在特别值得关注的实施例中，生物活性剂为tPA。如实例10中所述，含有tPA的水凝胶在粘滞粘连(诸如可在多发损害事件后形成的粘连)的情况下展现增加的抑制粘连的能力。tPA和其有用变体(包括具有改进的特性的变体)描述于以下专利中美国专利第6,284,247号、第6,261,837号、第5,869,314号、第5,770,426号、第5,753,486号、第5,728,566号、第5,728,565号、第5,714,372号、第5,616,486号、第5,612,029号、第5,587,159号、第5,520,913号、第5，520,9U号、第5,411,871号、第5,385,732号、第5，262，170号、第5,185,259号、第5,兩，卯1号、第4,766,075号、第4,853,330号，和让渡于基因泰克有限公司的其它专利。举例来说(但非限制)，tPA变体的蛋白酶结构域相对于天然存在的tPA可具有变异，和/或相对于天然存在的tPA，可在N末端处具有一个或多个氨基酸的缺失。tPA变体相对于天然存在的tPA可具有一个或多个其它糖基化位点，和/或可具有破坏当在真核细胞(例如哺乳动物细胞)中表达时将通常存在于天然存在的tPA中的糖基化位点的变异。可有用的特性包括(但不限于)增加的半衰期、增加的活性、增加的对纤维蛋白的亲和力或特异性等。已在恩特兹基因数据库(EntrezGenedatabase)(美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI))中赋予人类tPA基因ID5327,且全长氨基酸、mRNA和基因序列的基因库登录号分别为AAA98809、K03021和NM一000930。然而，应注意，如(例如)美国专利第4,853,330号中所述，优选使用缺乏信号肽序列的tPA的成熟形式，或其变体。具有tPA作为成员的胰凝乳蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶通常是以单链蛋白质的形式分泌，并且通过蛋白水解裂解多肽链中的特定位点产生两条链的形式来活化。对于纤溶酶原，单链与两条链的形式都具活性，但两条链形式的活性较高。纤溶酶将单链tPA活化39成两条链的形式，由此产生正反馈环。tPA的单链或两条链形式或其组合都可用于本发明中。tPA和其变体在市面有售且已批准用于投与人类以针对各种病状。举例来说，阿替普酶(活化酶@(Activase)，基因泰克公司，加州南圣弗朗西斯(SouthSanFranciso，CA))为重组人类tPA。瑞替普酶(Reteplase)(瑞替普酶@(1^3\^6@)、瑞芬太尼@(1^1^111@);伯林格-曼海姆(BoehringerMannheim),罗氏森托罗(RocheCentoror))为人类tPA的重组非糖基化形式，其中所述分子已经基因工程改造成含有原始蛋白质的527个氨基酸中的355个。替奈替普酶(Tenecteplase)(TNKase,基因泰克公司)为人类tPA的527个氨基酸的糖蛋白衍生物，其与天然人类tPA的不同之处在于具有三个氨基酸取代。这些取代使血浆清除率降低，增加纤维蛋白结合(且由此增加纤维蛋白特异性)并且增加对纤溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)的抗性。阿尼普酶(Anistreplase)(阿尼普酶(Eminase),史克必成公司(SmithKlineBeecham))为另一市售人类tPA。其它纤溶酶原活化剂包括链激酶(5^1386@、]^1^1^35￡@)和尿激酶(八131)0^肌56@)，二者都为市售。用于本发明中的其它蛋白水解增强剂包括tPA活化剂，诸如吸血蝠(D"mMwra/tm^w)唾液纤溶酶原活化剂(DSPA)去氨普酶(Desmoteplase)(帕隆公司(Paion)，德国(Germany)),其来源于吸血蝙蝠的唾液(利伯拉托GT(LiberatoreGT)等人，吸血蝙蝠纤溶酶原活化剂(去氨普酶)不促进神经降解的独特纤溶酶(Vampirebatsalivaryplasminogenactivator(desmoteplase):auniquefibrinolyticenzymethatdoesnotpromoteneurodegeneration.)中风(Stroke.)2003年2月；34(2):537-43;其以引用的方式并入本文中)。已表征出四种截然不同的蛋白酶且称为吸血蝠唾液纤溶酶原活化剂(DSPA)。全长吸血蝙蝠纤溶酶原活化剂(DSPA1)为最深入研究的变体且其展现与人类tPA的大于72%的氨基酸序列一致性。然而，两个重要的功能差异是显而易见的。首先，DSPA是以无法裂解成2条链形式的单链分子形式存在。其次，DSPA的催化活性似乎视纤维蛋白辅助因子而定。诸如瑞斯普酶(resc叩ase)(萨鲁普酶@(Saruplase),格兰泰公司(Grunenthal))和微纤溶酶(microplasmin)(—种纤溶酶原的裂解产物)的尿激酶纤溶蛋白活化剂也可用于本发明各个实施例中。阿非普酶(Alfimeprase)(努瓦罗公司(Nuvelo))为用于本发明中的另一蛋白水解增强剂。阿非普酶是重组产生的蛇毒纤溶酶(fibrolase)(—种已知首先从南部铜头蝮蛇(Agkistrodoncontortrixcontortrix)的蛇毒中分离的直接纤溶锌金属蛋白酶)的截短形式(图伯斯CF.(ToombsCF.)(2001)阿非普酶用于溶解血栓的新颖纤溶金属蛋白酶的药理学(Ammeprase:pharmacologyofanovelfibrinolyticmetalloproteinaseforthrombolysis.)止血学(Haemostasis.)31(3-6):141-7，其以引用的方式并入本文中)。这些酶直接裂解纤维蛋白。蛇毒纤溶酶本身也可用于本发明中。葡激酶(staphylokinase)和链道酶(streptodornase)也有用。在本发明一些实施例中，投与纤溶酶或微型纤溶酶(mini-plasmin)来替代tPA，或除投与tPA外还投与纤溶酶或微型纤溶酶。也可使用具有类纤溶酶活性的多种其它药剂。一般来说，所述物质能够裂解典型纤溶酶底物，诸如合成底物S-225FM(卡罗摩吉仪表实验室(Chromogenix-InstrumentationLaboratory),意大利米兰(Milan,Italy)),其为通常用于纤溶酶和活性纤溶酶原的分析产色底物。也可使用具有类tPA活性的其它药剂，例如其能够裂解纤溶酶原并且以与tPA类似的方式使其活化。蚓激酶(Lumbrokinase)为来源于蚯蚓粉正蚓(Lwnfcn'cwra&〃"s)的纤溶酶或一组酶。例如参看，有关编码蚓激酶的基因(PI239,基因库登记号第AF433650号)克隆的报道(葛(Ge)等人，(2005)来自蚯蚓的溶解血栓的酶(蚓激酶)的克隆和其在酵母毕赤巴斯德酵母中的表达(Cloningofthrombolyticenzyme(lumbrokinase)fromearthwormanditsexpressionintheyeastPichiapastoris.)蛋白质表达禾口纯化(ProteinExprPurif.)2005年7月;42(1):20-8,其以引用的方式并入本文中)。从蚯蚓中分离的其它纤溶蛋白酶也有用(乔(Cho，IH)等人，(2004)来Q蚯蚓粉正蚓的六种纤溶丝氨酸蛋白酶的纯化和表征(Purificationandcharacterizationofsixfibrinolyticserine-proteasesfromearthwormLumbdcusrubellus.)生物化学与分子生物学杂志(JBiochemMolBiol.)2004年3月31;37(2):199-205，其以引用的方式并入本文中)。也使用纳豆激酶(nattokinase)。已从各种蠕虫、昆虫和寄生虫中分离出的多种纤溶酶也可使用。举例来说，失稳酶(destabilase)(—种存在于水蛭中的酶)水解纤维蛋白交联(扎瓦洛瓦L.(Zavalova，L.)，(1996)来自医用水蛭(欧洲医蛭)的编码特异性裂解内切型-s(Y-Glu)-Lys异肽键且帮助溶角军血检的不常见醇的基因(Genesfromthemedicinalleech(Hirudomedicinalis)codingforunusualenzymesthatspecificallycleaveendo-epsilon(gamma-Glu)-Lysisopeptidebondsandhelptodissolvebloodclots.)分子和普通遗传学(MolGenGenet.)253(1-2):20-5;扎瓦洛瓦L.等人，(2002)来自水蛭的纤维蛋白原-纤维蛋白系统调控剂(Fibrinogen-fibrinsystemregulatorsfrombloodsuckers.)生物化学(莫斯禾斗)(Biochemistry(Mosc))67(l):135-42，其各自以引用的方式并入本文中)。在本发明一些实施例中，投与纤溶酶原来替代tPA,或除投与tPA外还投与纤溶酶原。其它蛋白水解剂或增强蛋白水解的药剂包括木瓜蛋白酶、链蛋酶(papase)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和透明质酸酶。具有抗凝或抗血栓形成活性的其它药剂包括肝素(heparin)、水蛭素(himdin)、安克洛酶(ancrod)、双香豆素(dicumarol)、辛奇玛(sincumar)、伊洛前列素(iloprost)、L-精氨酸、二比米达()dipyramidole)和其它血小板功能抑制剂、聚醚(诸如聚氧化乙烯)等。自由基清除剂或抗氧化剂包括维生素A、维生素E、别嘌呤醇(all叩urinol)、超氧化物歧化酶、二甲亚砜、过氧化氢酶(catalase)、曲美他嗪(tremetazidine)、抗坏血酸(维生素C)、亚甲蓝(methyleneblue)、拉扎罗德(lazaroid)、锰-去铁敏(mangan-desferoxamine)。止痛剂包括局部麻醉剂(例如，钠通道阻断剂)；中枢作用剂，诸如麻药(例如鸦片剂，诸如吗啡(morphine));非甾体消炎剂；吡唑啉酮和水杨酸衍生物；对乙酰氨基酚(乙酰氨基酚)；曲马多(tramadol)等。使用通常不认为是止痛剂的一些其它种类的药物治疗神经病理性疼痛，例如三环抗抑郁剂和某些抗惊厥剂等。在本发明某些实施例中，生物活性剂为通过RNAi干扰机制抑制基因表达的药剂。RNAi是一种由含有通常约17-29个核苷酸长、例如约19-21个核苷酸长的双链部分和视情况一个或两个单链突出的短核酸引发的内源性细胞序列特异性基因沉默机制，其中所述双链部分的一条链对应于靶基因且与其互补(香卡P.(Shankar,P.)等人，JAMA.(2005)293(11):1367-73，其以引用的方式并入本文屮)。能够通过RNAi引起基因沉默的药剂(在本文中称为RNAi剂)包括短干扰RNA(siRNA)和可在细胞内加工产生siRNA的分子，诸如短发夹RNA(shRNA)。多种RNAi剂可引发mRNA的序列特异性降解或抑制翻译。在一个实施例中，RNAi剂为包含两个互补核酸链的siRNA，其中一条链与靶基因互补，其中所述链为约19-23个核苷酸长且各链包含1-3核苷酸长的3'突出。应了解，无需RNAi剂与靶基因之间或RNAi剂双链体两部分之间最佳互补，只要存在足够的互补性以允许杂交发生即可。互补程度通常将为在至少15个连续核苷酸内至少80%、至少90%或更多。在某些实施例中，RNAi剂含有至少19个核苷酸长具有0、1、2或3个错配的双链体，其中所述链中一条链与靶基因杂交形成至少19个核苷酸长具有0、1、2或3个错配的双链体。应了解，尽管内源合成的RNAi剂通常是由RNA构成，但使用化学合成产生的RNAi剂除由磷酸二酯键连接的核糖核苷酸外还可包括一个或多个脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物、经修饰主链结构等，或可包括一个或多个脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物、经修饰主链结构等替代由磷酸二酯键连接的核糖核苷酸。本发明提供一种将RNAi剂传递到个体的新颖方法，所述方法包含以下步骤将第一和第二水凝胶前体与RNAi剂投与个体，其中所述水凝胶前体在投与所述个体后交联形成水凝胶，其中所述水凝胶封装RNAi剂。本发明另外提供含有RNAi剂的组合物。所述组合物可为水凝胶或含有本文所述的水凝胶前体的溶液中的任一种。水凝胶组合物可用于将RNAi剂局部传递到体内多个位置的任一处，例如腹盆腔、关节间隙、中枢或周围神经系统或其一部分(例如，脑、脊髓、周围神经)。通过从凝胶当中扩散或随着凝胶降解来从水凝胶中释放RNAi剂。可投与任何RNAi剂。在本发明某些实施例中，RNAi剂为上述任何种类的治疗剂。在一重要实施例中，RNAi剂具有粘连抑制作用。举例来说，RNAi剂可抑制编码促血管生成、促发炎或促纤维蛋白形成的多肽的基因的表达。通常在使一种或多种溶液相互接触之前和/或投与所述溶液之前将生物活性剂添加到所述溶液中。举例来说，在将含有第一HA衍生物的溶液装载到待用于投与所述溶液的装置中之前，将生物活性剂添加到所述溶液中。可将生物活性剂与HA衍生物同时、在重叠的时间间隔内或依次(意思指溶解一种物质然后再添加另一物质)溶解于液体介质中。将溶液混合或搅动以确保所述药剂的均匀分布。所使用的生物活性剂的总量可变化。举例来说，在将所述药剂添加到第一或第二溶液中后，所述药剂的浓度可在1Mg/ml到1.0g/ml的范围内。在本发明某些实施例中，所述浓度介于10pg/ml与100mg/ml之间或介于100pg/ml与10mg/ml之间。在本发明某些实施例中，在将所述药剂添加到第一或第二溶液中后，所述药剂的浓度在介于0.1nM与10mM之间、例如介于1nM与1mM、例如介于IOnM与100nM之间的范围内。使第一与第二多糖衍生物交联后所形成的水凝胶中的生物活性剂浓度将视其在各溶液中的浓度和所使用的溶液的相对体积而定。水凝胶的形成将截留生物活性剂，其通过扩散和/或随着水凝胶材料体内降解而从水凝胶中缓慢释放。在本发明其它实施例中，一种或多种多糖衍生物(例如HA衍生物)具有与其共价连接的生物活性剂。可使用多种方法中的任一种在多糖衍生物与牛物活性剂之间形成共价键。生物活性剂和多糖衍生物可包含能够相互反应的官能团或经修饰以包含能够相互反应的官能团，例如，如上文关于第一与第二HA衍生物反应所述的官能团。或者，可使用同双官能或异双官能交联剂。用于连结和交联的通用方法描述于以下文献中"交联(CrossLinking)"，皮尔斯化学技术图书馆(PierceChemicalTechnicalLibrary),自网站URLwww.piercenet.com可用且最初出版于1994-95皮尔斯目录和其中所引用的参考文献，王SS(WongSS)，蛋白质连结和交联化学(C7wH'W/7尸rafe/"Co">gfl//o"朋dCraM/z'wh"g),CRC出版公司(CRCPressPublishers),博卡拉顿(BocaRaton),1991;和G.T.赫曼森(G.T.Hermanson)，生物连结技术(B/ocwy'叫flferec/m!々Me;0，学术出版有限公司(AcademicPress,Inc.)，1995。举例来说，根据本发明某些实施例，使用双官能交联试剂来将生物活性剂与诸如HA衍生物、纤维素衍生物或葡聚糖衍生物的多糖衍生物偶联。一般来说，双官能交联试剂含有两个反应基团，从而提供一种共价连接两个靶基团的方式。化学交联试剂中的反应性基团通常属于不同种类，诸如琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺、吡啶基二硫醚和碘代乙酰胺。在某些实施例中，使用诸如二环己基碳化二亚胺(DCC)或DCI等试剂活化酯以供后续连结。或者，如上文所述，可使生物活性剂上的官能团与多糖衍生物上的官能团直接反应。如果生物活性剂不含有适当官能团，那么可使用所属领域中已知的多种方法中的任一种添加所述官能团。举例来说，如果生物活性剂为多肽，那么可添加赖氨酸残基或末端胺来提供胺基。或者，可对多肽加以修饰以使其包括半胱氨酸残基，从而提供巯基。优选生物活性剂与多糖衍生物的连接不会使所述药剂的生物活性降低到有用水平以下或明显干扰第一与第二多糖衍生物的交联。可能需要使用不同官能团来连接生物活性剂且使两种多糖衍生物进行交联反应。在特别值得关注的实施例中，将地塞米松或其它糖皮质激素与HA、纤维素或葡聚糖衍生物连结。多糖衍生物可含有非多糖聚合物部分，例如PEG部分。在另一特别值得关注的实施例中，将地塞米松与HA或HA衍生物连结。在另一特别值得关注的实施例中，将地塞米松与纤维素或纤维素衍生物连结。在另一特别值得关注的实施例中，将地塞米松与葡聚糖或葡聚糖衍生物连结。在特别值得关注的实施例中，将布洛芬或其它NSAID与HA、纤维素或葡聚糖衍生物连结。多糖衍生物可含有非多糖聚合物部分，例如PEG部分。在另一特别值得关注的实施例中，将NSAID与HA或HA衍生物连结。在另一特别值得关注的实施例中，将NSAID与纤维素或纤维素衍生物连结。在另一特别值得关注的实施例中，将NSAID与葡聚糖或葡聚糖衍生物连结。在本发明某些实施例中，经由在生理条件下易水解和/或易酶解的键将治疗剂与多糖衍生物共价连接。不稳定的键联包括酯、酰胺、酰胺酯、硫酯、酸軒、脲、碳酸酯、縮氨基脲、腙、肟、亚氨基碳酸酯、磷酸酯、磷嗪、尿烷(urethane)和酐键。易于在活体内裂解的其它键联包括含有经内源或外源提供的蛋白酶识别和裂解的位点的多肽。例示性蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、天冬氨酰基蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶)、羧基肽酶、氨基肽酶、半胱氨酸肽酶等。这些蛋白酶的裂解位点已为所属领域中已知。本发明另外提供至少一种水凝胶前体为包含非多糖聚合物部分的多糖衍生物的组合物(水凝胶和包含生物活性剂的溶液)。包含非多糖聚合物部分的多糖衍生物可为第I部分所述衍生物中任一种。多糖衍生物通常包含与一种或多种非多糖聚合物共价连接的多糖或其衍生物。在其它实施例中，本发明提供一种包含一种或多种生物活性剂的水凝胶，其中所述水凝胶是由交联两种非多糖聚合物形成。通常将非多糖聚合物溶解于如上文关于多糖衍生物所述的溶液中，其中所述溶液中的一种或两种含有生物活性剂。通过例如将所述溶液投与个体来使其相互接触。各非多糖聚合物包含官能团，其中所述官能团能够相互反应形成共价键。适当的官能团为上文关于交联多糖衍生物所述的官能团。例示性非多糖聚合物包括第I部分所述的含有供交联的适当官能团或可经修饰以含有供交联的适当官能团的聚合物。III.包含多糖衍生物和颗粒的杂化组合物本发明另外提供一种包含多糖衍生物和多个颗粒的组合物。举例来说，本发明提供一种包含第一HA衍生物和多个颗粒的组合物。多糖衍生物包含能够与第二官能团形成共价键的官能团。在本发明某些实施例中，所述组合物包含液体介质(例如水性介质)、第一多糖衍生物和多个颗粒。可将所述颗粒悬浮或分散于所述介质中。在本发明某些实施例中，所述组合物为通过使第一与第二多糖衍生物(其中任一种或两种可为HA衍生物)交联制成的水凝胶。举例来说，使包含HA衍生物且另外包含多个颗粒的第--溶液与包含第二多糖衍生物的第二溶液接触。在本发明某些实施例中，第二多糖衍生物为第二HA衍生物。第一与第二HA衍生物经由官能团相互反应以在其间形成共价交联，从而形成将颗粒截留于其中的水凝胶。在本发明某些实施例中，第二多糖衍生物为纤维素衍生物。在本发明某些实施例中，第二多糖衍生物为葡聚糖衍生物。HA衍生物与纤维素或葡聚糖衍生物经由官能团相互反应以在其间形成共价交联，从而形成将颗粒截留于其中的水凝胶。应注意，本发明并非以任何方式受到形成截留颗粒的水凝胶的方法的限制。在某些实施例中，本发明提供一种包含水凝胶前体和多个颗粒的组合物，其中所述水凝胶前体能够在例如生理条件下与第二水凝胶前体接触后在介于1秒与5分钟之间的时间内形成水凝胶。在特别值得关注的实施例中，在对个体投与后，水凝胶在介于l秒与5分钟之间，例如介于1秒与1分钟之间、介于1秒与30秒之间或介于1秒与15秒之间的时间内形成。在本发明某些实施例中，水凝胶前体包含非多糖聚合物部分或其为非多糖聚合物。可将多种颗粒中任一种并入组合物中，例如并入包含水凝胶前体(诸如多糖衍生物，例如HA衍生物、纤维素衍生物或葡聚糖衍生物)的液体介质中，且因此并入通过交联第一与第二水凝胶前体(例如多糖衍生物或非多糖聚合物)所制成的水凝胶中。所述颗粒可例如为聚合微米颗粒或纳米颗粒，或脂质体。可使用可生物降解的各种聚合物(例如，生物可相容聚合物)制造颗粒。所述聚合物可为直链、支链或交联均聚物、共聚物(包括嵌段共聚物)。适当的生物可相容聚合物(其中有一些为生物可降解的)例如包括聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚((3-氨基酯)、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇和其衍生物、聚原酸酯、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二氧环己酮)、聚(亚烷基烷基化物)、聚乙二醇与聚原酸酯的共聚物、生物可降解聚氨酯。其它聚合物包括聚(醚)，诸如聚氧化乙烯、聚(乙二醇)和聚(四亚甲氧醚)；乙烯基聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)(诸如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸其它烷酯、甲基丙烯酸羟乙酯)、丙烯酸和甲基丙烯酸，及其它，诸如聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯垸酮)和聚(乙酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素和其衍生物，诸如垸基、羟垸基、醚、酯、硝基纤维素和各种乙酸纤维素；聚(硅氧垸)等。其它聚合材料包括基于天然存在材料的材料，诸如多糖(例如，海藻酸-壳聚糖、琼脂糖、透明质酸)、明胶、胶原蛋白和/或其它蛋白质，以及其混合物和/或经修饰形式。也涵盖本文所揭示的聚合物中任-种的化学或生物衍生物(例如，化学基团的取代、添加，例如由所属领域技术人员常规制造的垸基、亚烷基、羟基化、氧化和其它修饰)。此外，可使用任一这些聚合物的掺合物、接枝聚合物和共聚物(包括嵌段共聚物)。共聚物可含有各种比例的不同单体亚单元。举例来说，包含单体A和单体B的共聚物可含有介于5%与95%之间的单体A和介于5%与95%之间的单体B(其中所述百分比是指以单体量计的百分比且总计为100%)。应了解，这些聚合物中有一些需要使用适当引发剂或交联剂以便聚合。其它例示性聚合物包括纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素)、聚氨基甲酸酯或聚脲、交联聚(乙酸乙烯酯)等、乙烯-乙烯酯共聚物、乙烯-己酸乙烯酯共聚物、乙烯-丙酸乙烯酯共聚物、乙烯-丁酸乙烯酯共聚物、乙烯-戊酸乙烯酯共聚物、乙烯-三甲基乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-二乙基乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-3-甲基丁酸乙烯酯共聚物、乙烯-3-3-二甲基丁酸乙烯酯共聚物和乙烯-苯甲酸乙烯酯共聚物，或其混合物。可对诸如交联和单体浓度等特征加以选择以提供所需的颗粒降解速率和/或使封装或截留于其中或者吸附在表面上的生物活性剂释放等。在本发明某些实施例中，所述颗粒本身是由交联的多糖衍生物(例如HA、葡聚糖和/或纤维素衍生物)构成。用于本发明中的微米颗粒和纳米颗粒可具有多种尺寸。一般来说，微米颗粒将具有500微米或更低，例如介于1与500微米之间、介于50与500微米之间、介于100与250微米之间、介于20与50微米之间、介于1与20微米之间、介于1与10微米之间等的直径，并且纳米颗粒将具有小于l微米，例如介于10mn与100nm之间、介于100nm与250nm之间、介于100nm与500nm之间、介于250nm与500nm之间、介于250nm与750nm之间、介于500nm与750nm之间的直径。如果由上述方法中任--种制备的颗粒具有超出所需范围的尺寸范围，那么可例如使用筛网分选颗粒。颗粒的尺寸(例如，直径)或形状可实质上均匀或其尺寸和/或形状可不均匀。其可实质上呈球形或可具有其它形状，例如圆柱形、椭圆体或棱锥形，在此情况下，相关尺寸将为最长的直线尺寸而非直径。纳米颗粒或微米颗粒可使用所属领域中已知的任何方法制造，包括(但不限于)喷雾干燥、相分离、单乳化和双乳化、溶剂蒸发、溶剂萃取以及简单和复凝聚。也可使用粒化、挤出和/或滚圆来制造颗粒状聚合组合物。在本发明某些实施例中，使用多层颗粒。举例来说，所述颗粒可含有核心和涂覆核心的一个或多个层。核心和层可由相同材料或不同材料制成。用于制造颗粒的材料和方法描绘于例如以下文献中美国专利第4,272,398号，其以引用的方式并入本文中；第6，428，815号，其以引用的方式并入本文中；和其中的参考文献。可改变用于制备颗粒的条件以得到具有所需尺寸或特性(例如，疏水性、亲水性、外部形态、"粘性"、形状等)的颗粒。制备颗粒的方法和所使用的条件(例如，溶剂、温度、浓度、气流速度等)也可视治疗剂和/或聚合物基质的组成而定。可使用多种常规脂质体制备技术中的任一种来制备用于本发明中的脂质体，诸如超声波处理、螯合透析、均质化、溶剂输注加上挤出、冷冻-解冻挤出、微乳化等。这些技术等论述于例如以下专利中美国专利第4,728,578号、英国专利申请案G.B.2193095A、美国专利第4,533,254号、第4,728,575号、第4,737,323号、第4,753,788号和第4,935,171号，其各自以引用的方式并入本文中。还可看格雷戈里亚季斯G.(Gregoriades,G.)(编)，脂质体技术(LiposomeTechnology),第1-3巻，CRC，博卡拉顿(BocaRaton)，1984;格雷戈里亚季斯G.(Gregoriades，G.)(编)，作为药物载剂的脂质体(LiposomesasDrugCarriers),约翰威立出版公司(JohnWiley&Sons),奇切斯特(Chichester),1988,1984;拉斯克D.D.(Lasic，D.D.)，脂质体从物理学到应用(Liposomes:FromPhysicstoApplications),爱思唯尔(Elsevier),阿姆斯特丹(Amsterdam),1993;马丁F.(Martin,F.)和拉斯克D.(Lasic,D.)(编)隐形脂质体(StealthLiposomes),CRC,博卡拉顿(BocaRaton)，1995;伍德M.C(Woodle，M.C)和斯托姆G.(Storm，G.)(编)，长循环月旨质体老药，新疗法(LongCirculatingLiposomes:OldDrugs,NewTherapeutics),斯普林格(Springer),柏林(Berlin)，1997;托奇林V.P.(Torchilin，V.P.)和维斯格V.(Weissig,V.)(编)，脂质体.实践方法(Liposomes.PracticalApproach),牛津大学出版社(OxfordUniversityPress),牛津(Oxford),2003。可用于制备本发明的脂质体的材料包括所属领域技术人员己知适于构建脂质体的任何材料或其组合。所使用的脂质可为天然或合成来源。所述材料包括(但不限于)脂质，诸如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇、脱脂脂质(lysolipid)、脂肪酸、鞘磷脂、鞘糖脂、糖脂(glucolipid、glycolipid)、硫脂、具有酰胺、醚和酯连接脂肪酸的脂质、可聚合脂质和其组合。组合物可含有多个颗粒群，其中所述群是由不同材料或不同比率的相同材料制成和/或其特性(诸如尺寸或形状)不同。含有多糖衍生物(例如HA衍生物、纤维素衍生物或葡聚糖衍生物)的溶液中的颗粒浓度以及所述颗粒的重量与多糖衍生物的重量的比率可变化。举例来说，含有多糖衍生物的溶液可含有介于100^g/ml与10g/ml之间的颗粒，例如介于1mg/ml与1.0g/ml之间或介于1mg/ml与100mg/ml之间的颗粒。溶液屮颗粒重量与多糖衍生物重量的比率可例如在1:1001到100:1内变化。举例来说，所述比例可介于1:10与10:1之间或介于1:5与5:1之间，或者介于1:2与2:1之间，例如为约l:l。在本发明某些实施例中，生物活性剂与颗粒以物理方式缔合，而在本发明其它实施例中，所述颗粒不具有与其缔合的生物活性剂。物理方式缔合可为共价或非共价的。缔合可为特异性或非特异性的。优选物理方式缔合为当对颗粒加以处理且将其与溶液中的多糖衍生物组合时保持稳定并且至少在将组合物投与个体之前保持稳定且通常持续此后一段可变化且视情况可控制的时间段的缔合。可经由一种或多种非共价相互作用机制(诸如离子相互作用、氢键、疏水相互作用等)将生物活性剂与颗粒缔合。举例来说，可将一种或多种药剂截留、包埋、密封或封装于颗粒内。所述颗粒可充满所述药剂和/或所述药剂可吸附于所述颗粒的表面上。可通过扩散或随着颗粒在体内降解从颗粒中释放药剂。释放可在数小时、数天、数周、数月等内发生。所述颗粒可含有上文所述的任一种或多种生物活性剂，例如上文所述的任一治疗剂。在本发明一些实施例中，含有多糖衍生物的溶液或通过交联第一与第二多糖衍生物形成的水凝胶可含有至少两种截然不同的颗粒群。所述群可关于多个参数中任一个而彼此不同。举例来说，制造所述颗粒的材料可不同，所述颗粒含有的生物活性剂不同，其尺寸不同等。举例来说，在一个实施例中，第-一群包括含有第一生物活性剂的颗粒或由含有第一生物活性剂的颗粒组成，并且第二群包括含有第二生物活性剂的颗粒或由含有第二生物活性剂的颗粒组成。在本发明某些实施例中，多糖衍生物中任一种或两种为HA衍生物。在本发明某些实施例中，第一溶液含有第一HA衍生物和第一颗粒群，且第二溶液含有第二HA衍生物和第二颗粒群。第一与第二HA衍生物交联导致形成含有第一颗粒群和第二颗粒群的水凝胶。在本发明某些实施例中，第---溶液含有HA衍生物和第一颗粒群，且第二溶液含有纤维素衍生物和第二颗粒群。在本发明某些实施例中，第一溶液含有HA衍生物和第一颗粒群，且第二溶液含有葡聚糖衍生物和第二颗粒群。HA衍生物与纤维素或葡聚糖衍生物交联导致形成含有第一颗粒群和第二颗粒群的水凝胶。在这些实施例中任一者中，第一和第二溶液中的第一颗粒群和第二颗粒群浓度可经选择以实现在水凝胶屮所需的最终颗粒浓度。在本发明一些实施例中，一些(但非全部)颗粒包含生物活性剂。当然，各溶液可含有多种不同颗粒群，例如2、3、4或更多不同颗粒群。如所属领域技术人员显而易见，可在颗粒形成过程中或形成之后将生物剂装载入所述颗粒中。可通过聚合物基质截留、包埋或封装生物活性剂或将生物活性剂密封于脂质体水性核心屮，和/或生物活性剂可涂覆颗粒表面。具有生物活性剂的颗粒可分散于整个聚合物基质中。生物活性剂优选构成介于约0.01重量％与90重量％之间的颗粒，例如构成约1重量％到约80重量％或约10重量％到约70重量％的颗粒。在某些实施例中，生物活性剂构成约10%-20重量％或约30%-50重量％颗粒。所属领域技术人员将了解，在选择适当聚合物和制造方法的过程中，选择与生物活性剂的稳定性相容的材料和方法相当重要。举例来说，需要避免可能会导致所述药剂实质降解或变性(其可导致生物活性的丧失)的加工温度。还需要测试组合物从而确保在所需时间段内释放大量所述药剂。在本发明某些实施例中，将生物活性剂与颗粒组分(例如聚合物或脂质组分)共价连接。可使用供形成所述共价连接的多种方法中的任一种。生物活性剂可包括能够与聚合物或脂质上的官能团反应的官能团。可对聚合物或脂质、生物活性剂或二者加以修饰以使其包括适当官能团。或者，可使用交联剂。相关方法与上文关于共价连接生物活性剂与多糖衍生物所述的方法类似。优选所述连接不会使所述药剂的生物活性降低到有用水平以下或干扰颗粒形成。在本发明某些实施例中，经由在生理条件下易水解和/或易酶解的键将生物活性剂与颗粒的聚合物或脂质组分共价连接。所述键裂解会从颗粒中释放生物活性剂或者促进颗粒释放生物活性剂。在本发明某些实施例中，除一种或多种生物活性剂外，所述颗粒含有一种或多种其它药剂，例如赋形剂、缓冲剂、滚圆剂(spheronizingagent)、填充剂、表面活性剂、崩解剂、粘合剂、增塑剂或包衣剂。其它药剂本身可不具有显著生物作用，但可调节生物活性剂的生物作用。例示性材料描述于美国专利第5,846,565号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。适当的药剂例如包括碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、表面活性剂、盐、金属离子和增积剂并且其已为所属领域技术人员所知。所使用的赋形剂的量可基于赋形剂与生物活性剂的比率(以重量计)。对于氨基酸、脂肪酸、盐和碳水化合物(诸如蔗糖、乳糖、甘露醇糖、葡聚糖和肝素)，在本发明某些实施例中，碳水化合物与生物活性剂的比率介于约1:10与约20:1之间。对于表面活性剂，在本发明某些实施例中，表面活性剂与生物活性剂的比率介于约1:1000与约l:20之间。在某些实施例中，其它药剂为改变颗粒释放生物活性剂的释放特性的药剂(在本文中称为"释放调节剂")。含有生物活性剂和释放调节剂的颗粒释放生物活性剂的动力学不同于不含有释放调节剂而其它相同的颗粒释放生物活性剂的动力学。动力学可以多种方式中的任一种改变。举例来说，释放调节剂可延迟释放或增加释放。在释放发生的部分或全部时间段内，释放速率可增加或降低。举例来说，释放调节剂的存在可降低或防止初始"脉冲"效应(其中在颗粒与液体接触后一段较短时间内释放较大比例的生物活性剂)。某些颗粒在与液体接触后的所需时间段内释放大量有效载荷，但在稍后的时间点时可能无法持续释放其它药剂。释放调节剂可改变从颗粒释放指定百分比的生物活性剂所需的时间。举例来说，释放调节剂可增加或减少释放10%、25%、50%、75%、90%或基本上全部待释放的生物活性剂所需的时间。举例来说，可使时间增加或减少介于.1与10倍之间的因数。例示性释放调节剂包括疏水性物质，例如疏水表面活性剂，诸如泊洛沙姆(poloxamer)。其它例示性释放调节剂为磷脂、胆固醇、聚甲基丙烯酸酯、糖、蛋白质、丙烯酸酯嵌段共聚物(诸如尤特奇E-IOO(EudagritE-100)和相关化合物)和锌。释放调节剂可为在聚合基质中形成孔或填充聚合基质中的孔的药剂。本发明另外提供一种组合物，其包含(a)包含一种或多种交联多糖衍生物(例如HA衍生物)的微米颗粒和(b)多个纳米颗粒。可将微米颗粒悬浮于介质中并直接施用于体内位置处，例如施用于腹膜。纳米颗粒可含有生物活性剂。因此，所述组合物可包含包括交联多糖衍生物的微米颗粒，其中所述微米颗粒封装纳米颗粒。在本发明一个实施例中，通过在包含油和乳化剂的连续相中依次添加第一HA衍生物、生物活性剂和第二HA衍生物的溶液且将其均质化来制备包含一种或多种HA衍生物的微米颗粒。均50质化是以1000-9000rpm进行1-20分钟。随后在40-5(TC将乳液搅拌整夜以从分散相中蒸发水。将微米颗粒用异丙醇洗涤3-6次，随后蒸发残余异丙醇。可在微封装之前将生物活性剂预先封装于纳米颗粒中。纳米颗粒可为聚合纳米颗粒或脂质体。在本发明另一实施例中，可通过喷雾干燥HA衍生物、生物活性剂和释放调节剂来制备微米颗粒。本发明另外提供至少一种水凝胶前体为包含非多糖聚合物部分的多糖衍生物的组合物(水凝胶和包含水凝胶前体和多个颗粒的溶液)。包含非多糖聚合物部分的多糖衍生物可为第I部分所述衍生物中任一种。多糖衍生物通常包含与一种或多种非多糖聚合物共价连接的多糖或其衍生物。颗粒可为上文所述颗粒中任一种。在其它实施例中，本发明提供一种包含多个颗粒的水凝胶，其中所述水凝胶是由交联两种非多糖聚合物形成。通常将非多糖聚合物溶解于如上文关于多糖衍生物所述的溶液中，其中所述溶液中的一种或两种含有颗粒。通过例如将所述溶液投与个体来使其相互接触。各非多糖聚合物包含官能团，其中所述官能团能够相互反应形成共价键。适当的官能团为上文关于交联多糖衍生物所述的官能团。例示性非多糖聚合物包括第I部分所述的含有供交联的适当官能团或可经修饰以含有供交联的适当官能团的聚合物。颗粒可为上文所述颗粒中任一种。应注意，在上述任一实施例中，所述颗粒是提供于含有水凝胶前体的溶液中，或可以独立溶液或干燥形式提供。IV.应用本发明的组合物和方法具有多种用途，包括(但不限于)预防和治疗粘连和投与治疗剂。对于这些应用中的任一种，水凝胶前体(例如多糖衍生物)可以干燥形式(例如冻干)提供并且可在投药前溶解于适当液体介质(例如水或生理盐水)中。或者，水凝胶前体(例如多糖衍生物)可以溶液形式提供。可在投与前将生物活性剂和/或颗粒(视情况包含一种或多种生物活性剂)添加到不同量(视应用而定)的千燥聚合物或溶液中。或者，包含多糖衍生物和生物活性剂或颗粒的组合物可以干燥形式提供且随后添加到液体介质中。A.投药模式如上文所述，本发明提供多种方法，其包含将水凝胶前体投与个体体内位置处，其中所述水凝胶前体在投与后交联形成水凝胶。水凝胶前体通常是以溶液形式投与。所述溶液可以多种方式中的任一种投与。举例来说，可使用多管注射装置(例如，多管注射器、双阀施用器(dualvalveapplicator))来将多种溶液实质上同时传递到所需位置。在本发明某些实施例中，所述装置包含暂时喷射多种溶液到其中且在投药前发生混合的腔室。本发明涵盖投与在体内相互接触的独立溶液形式的水凝胶前体。本发明涵盖实质上同时投与两种或两种以上溶液。这两种溶液可在投与过程中相互接触。本发明还涵盖通过投与由各自包含水凝胶前体的多种溶液形成的单一溶液来投与所述多种溶液。所述溶液通常在投与之前不久组合，以致在投与过程中极少发生交联或不发生交联且所述组合物将保持流体状态。举例来说，在包含以下步骤的抑制粘连的方法中(a)将包含第一多糖衍生物的第一水凝胶前体投与个体体内位置处；和(b)将包含第二多糖衍生物或非多糖聚合物的第二水凝胶前体投与个体体内所述位置处，本发明包括以下实施例其中将水凝胶前体溶解于溶液中以使其在投与之前不久相互接触和/或相互混合。本发明还包括以下实施例其中将水凝胶前体溶解于独立溶液中，将所述溶液经约1-60秒、例如1-30秒、5-20秒、约10秒等一种或多种离散或连续时间段实质上同时投与。本发明还包括以下实施例其中将水凝胶前体以独立溶液形式投与，使其在投与后相互接触。可通过诸如将溶液从多管注射装置中的各管中共挤出等多种方法中的任一种实质上同时投与溶液。在投与三种或三种以上组合物的本发明的实施例中，任两种或两种以上组合物可实质上同时投与。组合物可经单一时间段或经多个离散时间段投与，其各自可视为独立投与。多个离散时间段可在数分钟、数小时等内发生。举例来说，全腹膜投与或复杂的脊椎或颅手术可涉及历经数小时的多次离散投药。图13绘示用于投与溶液的例示性装置。图14绘示可用于投与多达四种不同组分(例如四种不同溶液)的多通道装置。一些溶液含有水凝胶前体，例如多糖衍生物；而其它溶液无需含有水凝胶前体。举例来说，一些溶液可含有颗粒。另外，可在不存在液体的情况下将颗粒装载入所述装置的通道中，且在投与过程中将其与溶液混合。图15绘示与液滴形成装置(诸如喷雾器或雾化器)相联的双管装置。图式的右侧部分为所述装置的一部分的放大图。所述装置特别适用于将组合物迅速投与相对较大的区域(例如对于全腹膜应用而言)。或者，可使用个别注射装置(注射器、导管、套管等)，只要小心使溶液在投与时或投与之后不久相互接触即可。可使用内窥镜，例如腹腔镜、关节镜等。举例来说，具有多通道的观测仪器是适当的。在一个实施例中，使用双注射腹腔镜或关节镜。在一个实施例中，所述组合物是在成像引导(例如荧光镜引导)下施用。在另一实施例中，可将第一和第二溶液简单地混合于容器中且随后将其倾倒、喷雾或喷于所需位置上。可在投与后将溶液利用混合工具混合或利用散布工具(例如，刮刀样工具)散布。在本发明某些实施例中，包含水凝胶前体(例如多糖衍生物，诸如HA衍生物)的52溶液包含可检测物质。所述物质可视觉检测，例如染料或着色剂；或者可通过另一方式检测(例如，所述物质可为放射性物质)。优选可检测物质对身体无害(除非其为作用机制必然伴有对正常细胞以及不合需要细胞的毒性的物质，诸如抗增殖剂或抗肿瘤剂)。可检测物质的存在使得投与组合物的个体更易于鉴别所投与的物质且因此可用于引导投药。某些可检测物质可在其已投与后用于追踪多糖衍生物，例如监测其降解。B.预防和治疗粘连可投与本发明的组合物以在多种手术类型中任一种的情况下治疗或预防粘连。本发明的组合物和方法适用的手术程序的非限制性实例包括腹盆腔、眼科、矫形、胃肠、胸、颅、头和颈、心血管、妇科、关节(例如关节镜)、泌尿科、整形、再造、肌与骨和神经肌肉手术。特定腹部程序例如包括去除或修补一个或多个腹盆腔器官或其一部分的手术。实例包括胃、肠(例如，十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠)、阑尾、胆囊、肝、肾、膀胱、尿道和前列腺的手术。腹盆腔手术还包括疝修补、动脉瘤修补和腹膜粘连裂解。妇科程序包括治疗由输卵管疾病(例如，与卵巢、输卵管和菌毛相连的粘连)引起的不孕的手术。所述手术包括输卵管造口术、输卵管粘连分离术和卵巢粘连剥离术。妇科手术包括卵巢切除术、子宫切除术、去除子宫内膜异位、预防重新形成粘连、治疗宫外孕、子宫或底部肌瘤等。其它手术包括治疗失禁或阴道脱垂的手术。产科手术包括剖腹生产术。肌与骨手术包括腰椎板切除术、腰椎间盘切除术、屈肌腱手术、脊柱融合术和关节置换或修补。神经肌肉手术包括用于修复神经、摘除神经或自由截留神经的手术。涉及劈开胸骨术的胸手术可导致在心脏或大动脉与胸腔上皮层之间形成粘连。胸手术包括食道手术、肺手术(例如肺减容或肿瘤去除)、旁路手术、动脉瘤修补和心脏瓣膜置换手术。手术还包括经执行以植入多种假体或可植入装置(诸如除纤颤器)中任一种的手术和执行用于诊断目的的手术。颅手术程序包括需要多种程序的针对肿瘤、癫痫的手术。这些程序通常会引起涉及头骨、脑膜和/或皮层的粘连。眼睛手术应用包括针对斜视的手术、青光眼滤过术和泪液排泄系统程序。因此在本发明某些实施例中，投与所述组合物以治疗或预防腹膜粘连。在本发明其它实施例中，投与所述组合物以治疗或预防胸膜粘连，例如肺叶之间和/或胸膜脏层与胸膜壁层之间的纤维粘连。在本发明其它实施例中，投与组合物以治疗或预防涉及心包膜(例如，心外膜、心包脏层或心包壁层、纤维心包)的粘连。在本发明其它实施例中，投与组合物以治疗或预防硬膜外粘连(涉及硬脑脊膜的硬膜外腔的粘连)。通常，将在产生第一切口的时间与完成手术闭合或将最后一个内窥镜工具从个体体内取出(以后发生的为准)的时间之间某一点时投与所述组合物。可将组合物投与先前未发展粘连的个体，或可将其投与给已发展粘连的个体。在一个实施例中，将所述组合物投与正经历减少预先存在的粘连的程序的个体。举例来说，所述程序可必然伴有预先存在的粘连的机械或化学裂解或破坏，随后施用本发明的组合物以预防粘连复发。投与给个体的组合物的总体积可基于多种因素而变化，所述因素主要为打算用水凝胶层覆盖的区域、所需水凝胶的厚度、投与部位和组合物是否包含治疗剂。例示性体积在介于.lml与5000ml之间，例如介于.5ml与1000ml之间、介于1ml与500ml之间、介于10ml与100ml之间等，应了解这些体积为近似值且包括所有子范围。可投与所述组合物以致所投与的材料或由其形成的水凝胶覆盖损害(例如手术切口或损伤)部位或者覆盖位于损害部位对侧的上皮表面(例如腹膜、胸膜、硬脑脊膜)的一部分。所覆盖的区域可在损害部位或位于与损害部位相对的组织上的区域周围且从损害部位或位于与损害部位相对的组织上的区域向外延伸一段可变的距离。举例来说，所覆盖的区域可从损害部位向外延伸多达约1、2、3、4、5cm或更长的平均距离。由所投与的材料或由所述材料形成的水凝胶所覆盖的总面积可在约0.1cn^到约腹膜的总面积(例如，多达约1.5-2.0m2)的范围内。举例来说，所覆盖的总面积可在约1.0cm2到约1.0m2，例如约5.0cnT-到约.51112的范围内。可将组合物施用于相邻区域或由未经覆盖的区域分开的多个离散区域。在包含颗粒的组合物的情况下，所传递的颗粒的体积和重量也可变化且将视所投与的溶液的总体积和溶液中颗粒的浓度而定。可对这些参数加以调整以传递所需的总颗粒体积或重量。在本发明某些实施例中，将颗粒以介于.lmg/kg与2g/kg之间的量传递给个体。例示性量在介于1mg/kg与1000mg/kg之间，例如介于5mg/kg与700mg/kg之间的范围内。所传递的颗粒的量无需基于个体的重量而可以绝对量表示。例示性量在介于.lmg与500g之间，例如介于1mg与100g之间或介于10mg与1g之间的范围内。C.药物传递如上文所述形成的任一水凝胶含有治疗剂(视情况与颗粒以物理方式缔合)的组合物可用于治疗多种疾病、病症和病状或用于预防目的。在本发明某些实施例中，水凝胶使治疗剂持续释放。水凝胶前体和药剂的单独投与可在一段时间内提供有效浓度的所述药剂，这为如果在不存在水凝胶前体的情况下投与相同量的所述药剂将引起的时间的至少2、3、5、10、20或更多倍和/或在不引起不适当副作用的情况下使用水凝胶前体使得可给与较高总剂量。在本发明某些实施例中，通过控制水凝胶和/或颗粒降解的速率来控制释放速率。因此，本发明提供一种包含溶液形式的水凝胶前体和治疗剂的组合物，其中所述水凝胶前体为本文所述的任何水凝胶前体且以本文所述的任何浓度范围提供。可将组合物投与个体体内任何位置，包括(但不限于)上文在抑制粘连的情况中所讨论的位置。举例来说，可将组合物投与腹膜以治疗主要在腹盆腔内显现的疾病或病症或治疗全身疾病。腹膜药物传递为用于治疗全身疾病的多种治疗剂的引人注目的选择，这至少部分归因于腹膜具有大表面积可用于吸收药剂。在本发明某些实施例中，将包含抗感染剂的组合物用于治疗感染或例如预防性降低手术后感染的可能性。经历可能危及肠壁的手术程序的患者尤其具有感染(例如腹膜炎)风险。在一个实施例中，在腹部手术期间或之后将组合物投与个体的腹盆腔。可将组合物施用于腹盆腔的任何位置，直接施用于一个或多个腹部器官和/或相邻组织或者施用于大致位于腹部器官相对处的壁层腹膜，以便形成将覆盖器官的脏层腹膜与壁层腹膜分离的水凝胶。可使用延长局部腹膜投药或经全腹膜投与组合物。在另一实施例中，使用本发明的组合物投与抗肿瘤剂。可投与抗肿瘤剂以治疗位于腹盆腔中的肿瘤，例如腹部或盆腔器官的肿瘤。在一个实施例中，在手术去除位于腹盆腔中的肿瘤之前、期间或之后将组合物投与个体。可全腹膜投与组合物。不希望受任何理论的限制，但投与本发明的组合物可减少转移的发展和/或抑制肿瘤的腹膜播散。在另一实施例中，将组合物投与罹患肿瘤的个体的腹盆腔中。所述组合物使抗肿瘤剂持续释放。举例来说，可经至少l、2、3、4、6或8周或更长时间释放所述药剂。可将组合物施用于肿瘤所处器官或可更为广泛地施用。因此，本发明提供一种治疗罹忠肿瘤或有发展肿瘤的风险的个体的方法，其包含将本发明的组合物投与个体，其中所述组合物包含抗肿瘤剂。可使用包含至少一种本文所述的水凝胶前体(例如多糖衍生物，诸如HA衍生物)的任何组合物，其中所述至少一种水凝胶前体在投与个体后交联形成水凝胶。所述治疗剂可与本文所述任一类颗粒以物理方式缔合。肿瘤可位于腹盆腔内。在另一实施例中，使用本发明的组合物将治疗剂投与个体的关节。个体例如可罹患关节炎。适于投与关节间隙的例示性治疗剂包括消炎剂和止痛剂。因此，本发明提供一种治疗罹患影响关节的疾病或病状或有发展影响关节的疾病或病状的风险的个体的方法，其包含将本发明的组合物投与所述关节，其中所述组合物包含经选择以治疗或预防所述病状的治疗剂。可例如将组合物注射到滑液腔中。可使用包含至少一种本文所述的水凝胶前体的任何组合物，其中所述至少一种水凝胶前体在投与个体后与另一水凝胶前体交联形成水凝胶。治疗剂可与本文所述任一类颗粒以物理方式缔合。可使用例如皮内、皮下、肌肉内等多种途径中的任一种投与组合物。任何身体组织都可用作包含一种或多种水凝胶前体(例如多糖衍生物)和多个颗粒的组合物的储集器，其中所述水凝胶前体在投与后交联形成水凝胶。55D.快速水凝胶形成如上文所述，本发明一方面为认识由快速交联水凝胶前体原位形成水凝胶所提供的益处和适当组合物的研发以及实现快速原位水凝胶形成的方法。本发明的任何实施例都可利用含有水凝胶前体的组合物实施，所述水凝胶前体在相互接触后在介于1-5与60秒之间、介于1-5与30秒之间、介于1-15与20秒之间或介于1-5与10秒之间的时间内形成水凝胶。本发明的任何实施例都可利用含有水凝胶前体的组合物实施，所述水凝胶前体在含有水凝胶前体的溶液相互接触后在介于1-5与60秒之间、介于1-5与30秒之间、介于1-15与20秒之间或介于1-5与IO秒之间的时间内形成水凝胶。本发明的任何实施例都可利用含有水凝胶前体的组合物实施，所述水凝胶前体在投与个体后在介于1-5与60秒之间、介于1-5与30秒之间、介于1-15与20秒之间或介于1-5与10秒之间的时间内形成水凝胶。V.包装或试剂盒本发明还提供包装或试剂盒，其在容器中包含一种或多种如本文所述的组合物。举例来说，容器可包括干燥(例如冻干)形式或溶液形式的HA衍生物。如果HA衍生物是以干燥形式提供，那么产物包装可包括具有适当溶剂或稀释剂(例如注射用无菌水)的容器。包装还可包括与容器相连的告示，其通常为管理医疗装置、医药和/或生物医药的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式，由此所述告示反映所述机构批准所述组合物用于人类或兽用投与以治疗粘连疾病或者除治疗粘连外的一种或多种适应症或治疗一种或多种适应症而非治疗粘连(例如，预防或治疗手术后感染)。还可包括有关使用所述药剂或组合物的说明书。所述说明书可包括有关重建HA溶液、向其中添加颗粒、传递装置的装载、投与的适当量和模式等信息。在本发明某些实施例中，包装将含有多个个别容器，其各自含有干燥形式或溶液形式的HA衍生物。举例来说，第一容器含有第一HA衍生物且第二容器含有第二HA衍生物。第一和第二HA衍生物可以预定量提供从而当其在溶液中相互接触时形成具有所需特征的水凝胶。所述包装还可包括一个或多个含有在投与前待与HA衍生物组合的生物活性剂的容器。在某些实施例中，包装含有其它多糖衍生物，诸如纤维素或葡聚糖衍生物。在某些实施例中，包装包括用于形成所需水凝胶的HA、纤维素和/或葡聚糖衍生物的组合。所述包装还可包括其它聚合物，诸如合成聚合物。包装还可包括蛋白质。医药包装还可包括含有将与多糖衍生物(例如HA、纤维素或葡聚糖衍生物)一起包括于溶液中的颗粒的接受器。或者，接受器可含有例如预定比例的衍生物和颗粒。所述颗粒可含有生物活性剂。多个容器可以相对紧密封闭的单一较大容器的形式(例如塑料或泡沫聚苯乙烯塑料(styrofoam)盒)提供。包装可包括供制备含有多糖衍生物(例如HA、纤维素或葡聚糖衍生物)的溶液的装置或接受器。所述装置可例如为测量或混合装置。包装可包括用于投与本发明的组合物的装置。例示性装置包括注射器，例如多管注射器、导管、内窥镜、关节镜、腹腔镜。内窥镜、关节镜或腹腔镜可具有多个通道以允许投与多种个别溶液。其它可包括的装置为便利投与本发明的组合物的内窥镜工具或腹腔镜工具的附件。当然，所述装置也可单独提供。实例实錄h遂欲资磨好《欽布3薪水凝應游激吝浙表^材料与方法遂欲處虔，透明质酸(HA，标称1.36MD:高MW和490kD:中等MW)是购自酶公司(GenzymeCorporation)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))。HA(标称50kD:低MW)是购自生命科学生物医药有限公司(LifecoreBiomedical,Inc.)(明尼苏达州査斯卡(Chaska,MN))。所有其它试剂都购自西格玛-阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO，USA))。^"史凝透敏廣激游^多..遵循先前报导的方法合成原位可交联HA衍生物(贾XUiaX)，克鲁姆博G(ColomboG)，帕德拉R(PaderaR)，朗格R(LangerR)，克汉DS.(KohaneDS.)原位交联透明质酸使坐骨神经阻断延长(Prolongationofsciaticnerveblockadebycross-linkedhyaluronicacid.)生物材茅斗(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，其以引用的方式并入本文中)。简单来说，在pH6.8和室温下，通过使HA(除非另作说明，否则为中等MW)与30倍摩尔过量的己二酸二酰肼在存在l-乙基-3-碳化二亚胺(EDC)和l-羟基苯并三唑(HOBt)的情况下反应来制备HA-己二酸二酰肼(HA-ADH)。通过彻底透析和乙醇沉淀纯化产物。通过在室温下于暗处使HA(除非另作指示，否则为高MW)与等摩尔的高碘酸钠反应2小时来制备HA-醛(HA-CHO)。通过添加乙二醇来终止反应。通过彻底透析纯化产物。将纯化产物冻干并存储于4'C下。使用凝胶渗透色谱(GPC)测定可交联HA衍生物的分子量(MW)。利用沃特水凝胶线性柱(UltrahydrogelLinearcolumn)(沃特世公司(Waters),马萨诸塞州米尔福德(Milford,MA))和含有0.2MNaCI(pH6.7)的0.05M乙酸盐水溶液作为流动相(0.8ml/min)来执行GPC。利用一系列普鲁兰多糖(pullulan)标准品预备MW校准曲线。根据所报导的方法使用^NMR分析(对于HA-ADH,瓦里安公司(Varian)墨丘利(Mercury)300MHz)(贾X(JiaX)，克鲁姆博G(ColomboG)，帕德拉R(PaderaR)，朗格R(LangerR)，克汉DS.(KohaneDS.)原位交联透明质酸使坐骨神经阻断延长(Prolongationofsciaticnerveblockadebyw'fwcross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，其以引用的方式并入本文中)和醛分析(对于HA-CHO)(克汉DS.(KohaneDS),利普M(LippM),金尼RC(KinneyRC)，安东尼DC(AnthonyDC)，路易斯DN(LouisDN),罗丹N(LotanN)等人，含有布比卡因的脂质-蛋白质-糖颗粒于神经外膜中的生物可相容性(Biocompatibilityoflipid-protein-sugarparticlescontainingb叩ivacaineintheepineurium.)生物医学材料石开究杂志(JBiomedMaterRes)2002;59(3):450-459，其以引用的方式并入本文中)测定修饰程度。/MX/人凝^"游表/f,水凝胶的原位胶凝时间测量如下。将磁力搅拌棒(特氟隆氟碳树脂(Teflonfluorocarbonresin)，5x2mm，费雪科技公司(FisherScientific))放于皮氏培养盘(Petridish)中IOO微升HA-ADH的生理盐水溶液(20mg/ml)小滴的中心。随后将100微升HA-CHO溶液(20mg/ml)添加到HA-ADH滴液中，并且使用PC-320型康宁(Corning)热板/搅拌器以155rpm搅拌溶液。将溶液形成完全与所述盘底部分离的固体小球时的时间视为胶凝时间。将结果报导为4个独立测量值的平均值与标准差。通过扫描电镜(JEOLJSM6060，美国JEOL有限公司(JEOLUSA,Inc.),马萨诸塞州皮伯迪(Peabody，MA))观察冻干HAX凝胶的形态。在液氮中冷却后将冻干凝胶破碎以暴露凝胶内部的结构。在观察前，利用钯和金(IOO埃厚)溅涂破碎的样本。,辨/-5游统^学分^由于数据并不总是遵循正态分布，故将其表示为中值与第25个百分点和第75个百分点。使用SPSS软件(伊利诺州芝加哥市(Chicago,IL))使用曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyU-test)、克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)或费雪准确检验(Fisher'sexacttest)进行统计推断。认为在双尾检验(2-tailedtest)上小于0.05的p值为统计学显著。结果通过多种不同方法表征可交联HA衍生物HA-己二酸二酰肼(HA-ADH)和HA-醛(HA-CHO)。原始HA和经修饰HA的MW概述于表1中。峰平均MW(Mp)略有增加且在ADH修饰后聚合物多分散性增加超过2倍。醛(CHO)修饰导致MW显著降低。在CHO修饰后，HA(高MW)和HA(中等MW)的MW分别从标称1.36MD和478kD降低到188和253kD，这与先前的报导相符(贾X(JiaX)，克鲁姆博G(ColomboG),帕德拉R(PaderaR)，朗格R(LangerR)，克汉DS.(KohaneDS.)原位交联透明质酸使坐骨神经阻断延长(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!'n*cross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，其以引用的方式并入本文中)。此结果表明，2小时的氧化反应诱使糖环明显裂解，而与原始MW无关。'HNMR和酸分析结果分别表明ADH与HA的52.9±4.7%连结(n=4)和各HA重复单元中16.6±4.8%醛基形成(n=7)。在两种HA衍生物接触后迅速形成HAX凝胶。如方法中所述，在连续搅拌两种组分的情况下，HAX凝胶(20mg/ml)在3.5±0.6sec内形成。冻干后利用SEM检查交联HAX凝胶的形态(图l)。交联水凝胶具有连续圆形或多边形孔，是典型的交联水凝胶(贾X(JiaX),波迪克JA(BurdickJA),克波勒J(KoblerJ)，克里夫顿RJ(CliftonRJ)，罗索沃斯基JJ(RosowskiJJ)，载特斯SM(ZeitelsSM)等人，原位可交联透明质酸基水凝胶的合成和表征以及用于声带再生的潜在应用(SynthesisandCharacterizationof//iS'7kCross-LinkableHyaluronicAcid-BasedHydrogelswithPotentialApplicationforVocalFoldRegeneration.)高分子(Mac腿olecules)2004;37(9):3239-3248，其以引用的方式并入本文中)具有10-20nm直径。表l.原始和经修饰HA的分子量的概述标称1Mp2Mn4PDI5HA，高MW1,360kD----HA，中等MW490kD478kDl，432kD276kD5.2HA，低MW50kD139kD178kD74kD2.4HA-ADH(由HA得至U,中等MW)-551kD1,502kD108kD13.9HA-ADH(由HA得至iJ,低MW)-141kD296kD67kD4.4HA-CHO(由HA得至lJ，高MW)-188kD214kD62kD3.4HA-CHO(由HA得到，中等MW)-253kD266kD43kD6.11.由制造商提供2.峰平均分子量3.重量平均分子量4.数量平均分子量5.多分散性指数-Mw/Mn实辨2,^沐Wft4A:水凝梦游全欽W賴吝丝材料与方法^,//潘應话力分桥，将人类间皮细胞(ATCC，CRL-9444)培养于含有伊尔氏盐(Earle'ssalt)、L-谷氨酰胺和2.2g/L碳酸氢钠且补充有3.3nM表皮生长因子、400nM氢化可的松、870nM胰岛素、20mMHEPES和10%胎牛血清的培养基199中。将第5代到第25代细胞用于以下研究中。将间皮细胞以每孔50,000个细胞的密度接种于24孔培养板中的1ml培养基中。培育整夜后，将培养基用新鲜培养基或具有10U/ml透明质酸酶的新鲜培养基替换，并且无菌制备100pl圆柱形(直径5mm，高度5.1mm)HAX凝胶(20mg/ml)且将其添加到各孔中。在存在水凝胶的情况下培育不同时间后，利用MTT分析试剂盒(普洛麦格公司塞尔泰特96非放射性细胞增殖分析(PromegaCellTiter96Non-RadioactiveCellProliferationAssay))评定细胞活力。结果报导为针对未经处理的对照细胞的吸光度标准化的所测量的吸光度(标准化细胞活力％=100x在存在样本的情况下生长于培养基中的细胞的吸光度/生长于培养基中的细胞的吸光度)的中值与第25个百分点和第75个百分点。结果测定HAX凝胶对间皮细胞的活体外细胞毒性(迪泽佳GS(diZeregaGS)腹膜、腹膜愈合禾口禾占连开》成(Peritoneum,peritonealhealing,andadhesionformation.),迪泽4圭GS(diZeregaGS)编，腹膜手术(PeritonealSurgery.)纽约(NewYork):施普林格(Springer)，2000.第3-37页；其以引用的方式并入本文中)。使这些细胞在存在100nl20mg/mlHAX凝胶(参看方法)的情况下于存在或不存在降解HAX凝胶的10单位/毫升透明质酸酶的培养基中生长达3天。如利用MTT分析所评定，除3天后在存在透明质酸酶的情况下暴露于HAX的细胞的活力略有(16%)降低(p=0.042)夕卜，HAX的存在对任一组中的细胞活力无统计学显著影响(图2)。活体外细胞增殖分析表明，HAX凝胶在非降解条件(普通培养基)和降解条件(含有10U/ml透明质酸酶的培养基)下都与间皮细胞相容。,鉄舰織微層微微,蕭遂材料与方法/MX凝i游^沐/^嚴^依照麻省理工学院委员会(MassachusettsInstituteofTechnologyCommittee)关于动物护理所批准的方案，遵照有关实验室动物的护理和使用的NIH指导(NIH公告#85-23，1985年修订)护理动物。将雌性白化兔(西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus);新西兰白(NewZealandWhite),科文斯公司(Covance)，宾夕法尼亚州黑泽尔顿(Hazleton，PA))(3±0.5kg)用作模型动物。使用开他敏(Ketamine)(35mg/kg，肌肉内)和赛拉嗪(Xylazine)(5mg/kg，肌肉内)诱使麻醉；使用经由气管内导管投与的氧气中的1-3%异氟垸(isoflurane)实现维持。在整个过程中使用无菌技术。在整个手术过程中向动物提供乳酸林格溶液(lactatedRinger'ssolution)并且持续监测生命指征。沿腹壁上的白线(lineaalba)产生10cm长的中线切口，并打开腹膜。根据具有修改的文献中报导的方法(奥瑞塔H(OritaH)，福卡萨瓦M(FukasawaM)，吉尔基斯W(GirgisW)，迪泽佳GS.(diZeregaGS.)标准兔模型中术后粘连的抑制利用组织纤溶酶原活化剂进行腹膜内治疗(Inhibitionofpostsurgicaladhesionsinastandardizedrabbitmodel:intraperitonealtreatmentwithtissueplasminogenactivator.)国P示生育学报(InUFertil)1991;36(3).172-177，其以引用的方式并入本文中)诱发腹膜粘连。在右侧腹壁上，从距中线1cm处开始切开包含腹膜壁层和一层肌肉(约1mm厚)的3x4cm缺损。随后，将盲肠在对肠系膜侧边(anti-mesentericside)上外在化为7个袋(从回盲部(ileocecaljunction)远端第6个袋开始到第12个袋)，将其分开并使用无菌手术刷双向擦伤80-160下引起出血。将20只动物随机分配到以下实验组(i)未治疗(n=12);(ii)利用10ml交联HA覆盖经切开腹壁和擦伤的盲肠表面(n=8)。施用前，通过紫外杀菌照明将材料灭菌2小时并将其溶解于无菌生理盐水中。将凝胶前体溶液(5mlHA-ADH(20mg/ml)和5mlHA-CHO(20mg/ml))放入独立的10m与百特双阀施用器(Baxterdualvalveapplicator)相连的无菌注射器中，并通过15号针共挤出。液体前体立即开始胶凝，符合施用区域的形状。视觉检査，胶凝在不到3分钟内完成水凝胶在超过所述时间点时不流动。治疗受损区域后，分别利用2-0爱惜良缝线(Ethilon)和3-0地可松缝线(Dexon)闭合腹膜和腹壁。利用2-0爱惜良缝线闭合皮肤。使动物醒来且自由取用食物和水。术后8小时经皮下投与丁丙诺啡(B叩reno卬hine)0.02-0.03mg/kg。程序后1周，利用静脉内100mg/kg戊巴比妥钠(sodiumpentobarbital)对动物实施安乐死。使用所报导的方法的修改方法对粘连评分(伯恩斯JW(BurnsJW)，斯金纳K(SkinnerK)，考特J(ColtJ)，谢德林A(SheidlinA)，布朗森R(BronsonR)，雅克伯Y(YaacobiY)等人，通过用透明质酸溶液预涂组织预防组织损伤和术后粘连(Preventionoftissueinjuryandpostsurgicaladhesionsbyprecoatingtissueswithhyaluronicacidsolutions.)手术研究杂志(JournalofSurgicalResearch)1995;59:644-652,其以引用的方式并入本文中)。0分=无粘连，1分=利用重力将会分离的组织粘附；2分-可通过钝器解剖分离的组织粘附；3分-需要利器解剖的粘连。将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林(formalin)中，包埋于石蜡中，切片并使用标准技术用苏木素和伊红染色以供组织学检查。结果如方法中所述，使20只动物接收盲肠擦伤和部分腹壁切开。在术后第一周中，未经HAX凝胶治疗的12只动物(对照)失去5,7±4.6%体重。12只中有10只(83%)兔发展3分粘连(图3C)。在这10只兔中，6只直接在腹壁切开的对面发展粘连，2只发展的粘连涉及切开边缘，且1只发展的粘连涉及多个肠区段；在后一只动物中，手术期间存在明显的局部出血。1只兔发展粘连到中线腹部缝合，即其与经切开的腹壁无关。在术后第一周中，经10mlHAX凝胶治疗的8只动物失去9.0±7.4%体重(与未经治疗的对照相比，p不显著)。仅2只动物(25%)发展3分粘连(与未经治疗的对照相比，p=0.019，费雪精确检验)。8只动物中有4只未展现粘连(图3B)。l只动物具有利用重力分离的粘连(l分)。2只动物在腹部缝合部位发展粘连(2分和3分)，并且l只动物在擦伤的袋与未擦伤的回盲部之间发展3分粘连。然而，都不涉及受损腹壁。应注意，所述2分和1个3分粘连涉及未施用HAX凝胶的缝合部位。类似地，另一在肠两个环之间的3分粘连也仅涉及一个经治疗表面。在解剖时，HAX凝胶材料仍存在于治疗部位(受损腹壁和/或擦伤的盲肠表面)上。肉眼检查，所述材料的量和弹性明显降低。从来自未经治疗动物的数据将显而易见，腹壁的损伤对于发展粘连起到至关重要的作用。盲肠表面擦伤的影响似乎不太明显。粘连未涉及的擦伤的盲肠表面在一周内愈合而未存留任何显见的标志，并且粘连通常涉及擦伤和未擦伤的袋。此外，在盲肠擦伤而腹壁未受损或者仅轻微擦伤的若干试验性研究中，粘连的发生率极低(数据未显示)。对于光学显微镜检査，从未经治疗的动物的粘连部位取得的样本展现肠肌肉层与腹壁肌肉组织的紧密附着，具有介于发炎和纤维化之间的不同厚度以及肌肉损伤的证据(水肿、小深染色细胞、中央核)(图4A和4B)。相比之下，从无粘连的经治疗动物的损伤部位取得的样本展现蓝色染色材料涂层，以及轻度到中度炎性细胞(大部分为巨噬细胞且有一些嗜中性粒细胞)浸润(图4C)。来自两只发展粘连的经HAX治疗的动物的粘连部位的样本具有与来自未经治疗动物的粘连部位相同的外观。此处，在来自这两只动物的样本中未观察到涂层；应注意，这些粘连发生于未涂覆的部位处。本实验的结果概述于表2中。结果表明HAX凝胶降低腹膜粘连的活体内功效。当比较3分粘连(其为只能通过切割分离的稳固连接)的发病率时，凝胶预防粘连的能力尤其明显；低级粘连为不同级别的粘性而非手术相关含义中的粘连。12只未经治疗对照组中的动物中有10只(83%)在术后7天内发展3分粘连。组织学检査证实，3分粘连是由发炎和纤维化引起。相比之下，在8只利用施用于受损部位的HAX凝胶治疗的动物中只有2只(25%)出现3分粘连。从治疗组中所见的两个3分粘连涉及缝合切口或两个盲肠表面之间，这都是未用HAX治疗的部位。如果将未经涂覆部位的粘连排除在分析之外，那么对照组和治疗组中3分粘连的发生率分别为82%(11只中有9只)和0%(6只都无)。值得注意的是，分析表明本发明的交联HAX凝胶在腹膜中生物可相容。先前已证实此系统在神经束膜内生物可相容(贾X(JiaX)，克鲁姆博G(ColomboG)，帕德拉R(PaderaR)，朗格R(LangerR)，克汉DS.(KohaneDS.)原位交联透明质酸使坐骨神经阻断延长(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!>zw'mcross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，其以引用的方式并入本文中)。然而，在一个组织中的生物相容性未必预测在腹膜中的生物相容性。举例来说，尽管聚合微球体在神经束膜(克汉DS.(KohaneDS),利普M(LippM)，金尼RC(KinneyRC)，安东尼DC(AnthonyDC),路易斯DN(LouisDN)，罗丹N(LotanN)等人，含有布比卡因的脂质-蛋白质-糖颗粒于神经外膜中的生物可相容性(Biocompatibilityoflipid-protein-sugarparticlescontainingbupivacaineintheepineurium.)生物医学材料石开究杂志(JBiomedMaterRes)2002;59(3):450-459，其以引用的方式并入本文中)和许多其它组织内生物可相容，但其倾向于在腹膜内引起粘连(克汉DS.(KohaneDS),提斯JY(TseJY)，伊奥Y(YeoY)，帕德拉R(PaderaR)，舒伯纳M(ShubinaM)，朗格R(LangerR)供腹膜内药物传递的生物可降解聚合微球体和纳米颗粒(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2005:Inpress,其以引用的方式并入本文中)。表2:腹膜粘连的评估<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>已证实纤维蛋白溶解与抗纤维蛋白溶解活性之间的平衡对于介导粘连的发展极为重要(佛克K(FalkK)，布杰奎斯特P(BjorquistP),斯托姆奎斯特M(StromqvistM)，霍姆达尔L.(HolmdahlL.)通过抑制1型纤溶酶原活化剂抑制剂来减少试验性粘连形成(Reductionofexperimentaladhesionformationbyinhibitionofplasminogenactivatorinhibitortype1.)英国手术杂志(BritishJournalofSurgery)2001;88:286-289;宾达MM(BindaMM)，默林纳斯CR(MolinasCR)，克宁科PR(KoninckxPR.)反应性氧物质与禾占连形成粘连予页防的临床意义(Reactiveoxygenspeciesandadhesionformation:clinicalimplicationsinadhesionprevention.)人类生殖(HumanReproduction)2003;18(12):2503-2507，所述文献各自以引用的方式并入本文中)。浆膜纤维蛋白溶解主要受t陽PA禾BPAI的间皮释放调控(缇兹L(TietzeL)，艾伯瑞奇A(EibrechtA)，斯奇尔特C(SchauerteC)，克罗斯哈芬B(KlosterhalfenB)，阿莫塔奇B(Amo-TakyiB)，基哈伦J(GehlenJ)等人，通过转化生长因子(31(TGF-(31)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)和白细胞介素1(3(IL-ip)调节人类腹膜间皮细胞的促纤维蛋白水解和抗纤维蛋白水解特性(Modulationofpro-andantifibrinolyticpropertiesofhumanperitonealmesothelialcellsbytransforminggrowthfactorbetal(TGF-betal))，tumornecrosisfactoralpha(TNF-alpha)andinterleukin1beta(IL-1beta).)血栓与止血学(ThrombHaemost)1998;79(2):362-370，其以引用的方式并入本文中)。已研究HAX的降解产物是否会引起可能由HAX凝胶减少粘连形成引起的tPA和PAI-1间皮产量的改变。在37。C下于10U/ml透明质酸酶中培育的交联HA凝胶使所述降解产物稳定释放(图5A)。将间皮细胞培育于补充有或未补充有100^生理盐水或者100|xl含有20mg/mlHA(490kD或50kDMW)或HA两种单体组分中的一种(D-葡糖醛酸或N-乙酰基-D-葡糖胺)的生理盐水的lml培养基中。图5B显示与未经治疗或经生理盐水治疗的对照相比，利用不同MW的透明质酸和单体生长的间皮细胞中的tPA产量存在统计学显著且极小的降低(p=0.15)。经HA或单体治疗的组之间的差异统计学不显著(p=0.112)。类似地，任何治疗对PAI-1产量的影响都不明显(数据未显示)。不希望受任何理论束缚，相信利用HAX凝胶引起的粘连形成的显著降低在很大程度上可能归因于HAX凝胶的障壁功能。然而，由于粘连形成的病因学受许多生物事件的介导，故HAX凝胶的潜在可溶性浸出(可溶性HA，单体)不会增加tPA产量或影响活体外PAI-1含量的事实也不能排除生物影响的可能性。实激5.*卓体浓度界分f着Wft4Z凝,燁,游嚴俯材料与方法遂欲^^潔廢^/ZAX凝度游餘,，制备由具有多种分子量的各种浓度的HA-ADH和HA-CHO组成的HAX凝胶，并且随时间监测透明质酸酶中凝胶的降解。通过使用涡旋混合器将各种浓度和Mw的150piHA-ADH和150^HA-CHO立即混合于2ml微量离心管中来制备HAX凝胶，且随后将其在37'C下于透明质酸酶(50U/ml于PBS中)中64培育。在预定时间点时，完全去除透明质酸酶缓冲液，并且经重量分析测定剩余HAX凝胶的湿重。将结果绘制为以各时间点时凝胶质量％/原始凝胶湿重与时间的关系的图。结果为评定通过改变基质的交联密度进一步优化和控制HAX凝胶的特性的潜力，研究各种凝胶浓度的影响。上文所使用的HA粘性极强，且难以溶解高于20mg/ml的HA。因此，为增加HA浓度，制备出较低Mw的前体。为此，由50kDHA(而非490kD)制备HA-ADH且由490kDHA(而非1.36MD)制备HA-CHO。这允许调配75mg/mlHA-ADH和60mg/mlHA-CHO。为加速凝胶降解过程并观察合理时间段内的宏观凝胶质量改变，使用50U/ml透明质酸酶执行降解实验。所有浓度的HAX凝胶最初都膨胀且随后以一定速率(此视浓度(图6A)和分子量(图6B)而定)降解。当HA-ADH和HA-CHO溶液的浓度分别从20mg/ml增加到75mg/ml和30mg/ml吋，水凝胶湿重降低50%的时间("半衰期")从5天增加到11天，并且当所述浓度增到75mg/ml和60mg/ml时，所述时间增加到22.5天(图6A)。(注意在后一比较中，只有HA-CHO的浓度是变化的。)当HA-ADH和HA-CHO的浓度保持恒定时，利用由较高Mw得到的HA-CHO制得的凝胶的半衰期较长(1.36MDHA-CHO的大于50天相对于490kDHA-CHO的22天；图6B)。在这些实验中，将HAX凝胶浇注于微量离心管中，其中所述凝胶仅一侧面向透明质酸酶溶液。因此，此处所示的绝对半衰期可能不与本文所述其它实验(其中所述凝胶的所有表面都暴露于酶溶液)直接相关。本实例中所提供的结果表明，HAX凝胶一旦形成即呈现持久的实体障壁，其可持续数天到数周(视凝胶组分的浓度和分子量而定，参看图6)直到最终为例如内源透明质酸酶降解。可根据所述方法通过改变这些参数从而可控制地调节降解时程的事实使得本系统适于特定应用，这视需要障壁功能的时间长度而定。,激。染众/M/謝术厥教^:凝,游激备浙表^材料与方法#夥透明质酸(HA，1.36MDa禾Q490kDa)是购自基因酶公司(GenzymeCorporation)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))。聚(乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA，丙交酯:乙交酯=65:35，Mw90,000)是从阿尔科姆斯公司(线e腦s)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))获得。聚乙烯醇(PVA，Mw6000)是购自伯利森斯有限公司(Polysciences，Inc.)(宾州威灵顿(Warrington,PA))。除非另作指示，否则所有其它试剂都购自西格玛-阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))。^^拔遂欲^^^^/PL04^^e^^^游凌/吝如实例I中所述合成原位可交联HA衍生物。通过单乳化方法制备空白PLGA纳米颗粒。将PLGA200mg溶解于5ml二氯甲烷与二甲亚砜(DMSO)的3:2混合物中。将聚合物溶液直接添加到20ml5%PVA中。随后使用超声波仪(威伯塞尔系列VC-250型(VibracellVC-250)，超声波与材料有限公司(Sonics&MaterialsInc.)，康涅狄格州丹波尼(Dunbury,CT))将混合物均质化达1分钟以产生油-水乳液。将所形成的乳液添加到100ml蒸馏水中且在室温下搅拌整夜。在减压下去除剩余溶剂。通过使用L8-70M超高速离心机(贝克曼公司(Beckman)，加州富尔顿(FulIerton,CA))和SW28翻转吊桶式转子(swingingbucketrotor)以25,000rpm离心20分钟来收集纳米颗粒，且通过使其通过超滤膜(奥特塞尔艾米肯YM100(UltracelAmiconYM100),密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州比勒里卡(Billerica,MA))进一步纯化，随后冻干。利用ZetaPALS型4电位分析仪(zetapotentialanalyzer)(美国布鲁克海文仪器公司(BrookhavenInstrumentsCorporation),纽约州霍特斯维尔(Holtsville，NY))测量粒径。^t/凝殿游谅y备通过混合20mg/ml凝胶前体(HA-ADH禾口HA-CHO)的溶液来制备无纳米颗粒的交联透明质酸水凝胶("HAX")。通过将20mg/ml凝胶前体溶液混合于20mg/mlPLGA纳米颗粒悬浮液中来制备含有PLGA纳米颗粒的复合HAX凝胶("杂化")。/7游冶篛分桥通过扫描电镜分析检查PLGA纳米颗粒的表面形态和冻干水凝胶的内部结构。通过混合在蒸馏水中制备的等体积前体溶液来制造水凝胶。随后将水凝胶冻干且在液氮中冷却后破碎。将样本用钯和金(IOO埃厚)溅涂并且使用扫描电镜(JEOLJSM6320，美国JEOL有限公司，马萨诸塞州皮伯迪(Peabody,MA))观察。i凝好/坊将100|_U含有PLGA纳米颗粒的HA-ADH溶液(HA-ADH和PLGA纳米颗粒为在生理盐水中20mg/ml或10mg/ml)添加到8x35mm玻璃小瓶中，所述玻璃小瓶含有磁力搅拌棒(特氟隆氟碳树脂(Teflonfluorocarbonresin)，5x2mm，费雪科技公司(FisherScientific))。随后将100(il含有PLGA纳米颗粒的HA-CHO溶液(HA-CHO和PLGA纳米颗粒都为在生理盐水中20mg/ml或10mg/ml)添加到所述小瓶中，并且使用康宁PC-320型热板/搅拌器以155rpm搅拌溶液直到形成杂化凝胶。将溶液形成完全与所述盘底部分离的固体小球时的时间视为胶凝时间。出于比较，还测试HAX凝胶的形成。将结果报导为4个独立测量值的平均值与标准差。流变丝,W试通过使用1ml注射器和百特双阀施用器(Baxterdualvalveapplicator)将20mg/ml凝胶前体溶液添加到夹于两个载片之间的橡胶模具中来制备圆柱形HAX和杂化凝胶。所制得的水凝胶的直径和厚度分别为8mm和3.5mm。随后将凝胶转移到AR1OOON型流变仪(TA仪器公司(TAInstruments)，特拉华州纽卡斯尔(NewCastle,DE))中以供流变性测量。所有实验都是在室温下使用8mm直径的平行板进行。通过蠕变测试和应力扫描测试(stresssweeptest)测量剪切模量G。对于蠕变测试，使水凝胶经历恒定剪切应力(5、10、20或40Pa)达90秒且随后使其回复90秒。在各蠕变和回复步骤约60秒后，应变达到恒定值。G测定为应变(回复步骤末期的读数)对应力曲线的斜率的倒数。对于应力扫描测试，以恒定频率(0.1Hz)施加在1-100Pa范围内的振荡应力。将在40Pa下获得的弹性模量G'用作G的近似值，这是因为粘性模量G"接近O。将结果报导为4个独立测量值的平均值和标准差。实賴6-S游统^学分折将流变性测量值报导为平均值与标准差，并且使用学生t检验(Studentt-test)加以比较。由于细胞培养数据不总是遵循正态分布，故将其表示为中值与第25个百分点和第75个百分点；也以此方式报导分数。为此，使用SPSS软件(伊利诺州芝加哥市(Chicago,IL))使用曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyU-test)、克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)或费雪准确检验(Fisher'sexacttest)进行统计推断。认为在双尾检验(2-tailedtest)上小于0.05的p值为统计学显著。结果染众凝,游表,PLGA纳米颗粒的平均直径和；电位分别为278.4±18.7nm和-18.1±4.0mV。通过扫描电镜分析，粒径分布在50nm到300nm的相对较宽的范围内(图7A)。冻干杂化凝胶基质具有直径在5到10Mm(图7B)范围内的连续孔，其可比拟HAX凝胶的孔(图7C)。杂化凝胶具有粗糙表面(图7B插图)，表明纳米颗粒包埋于凝胶基质中。如本文所述，HAX凝胶作为粘连障壁的优势之一在于其可在适当时间范围内原位交联以治疗粘连。为评定聚合纳米颗粒的并入是否干扰胶凝，将HAX凝胶与杂化凝胶的胶凝时间相比较。两个系统在混合后迅速胶凝，而两者之间并不存在统计学或实际上显著的差异〔表3)。类似地，希望确定纳米颗粒是否会影响凝胶的机械特性。剪切模量不受纳米颗粒影响(表3)。表3.HAX凝胶与杂化凝胶的胶凝时间和剪切模量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>实银7,染众^4/游术,#^凝,^^欽裙吝丝材料与方法/7t^f應如实例6中所述制备杂化HA/纳米颗粒水凝胶。潘應潜遭分叛将人类间皮细胞(ATCC，CRL-9444)培养于含有伊尔氏盐(Earle'ssalt)、L-谷氨酰胺和2.2g/L碳酸氢钠且补充有3.3nM表皮生长因子、400nM氢化可的松、870nM胰岛素、20mMHEPES和10%胎牛血清的培养基199(英杰公司(Invitrogen))中。将细胞以每孔50,000个细胞的密度接种于24孔培养板中的1ml培养基中。整夜后，将100圆柱形杂化凝胶或生理盐水添加到各孔中。在存在水凝胶的情况下培育不同时间后，利用MTT分析试剂盒(普洛麦格公司塞尔泰特96非放射性细胞增殖分析(PromegaCellTiter96Non-RadioactiveCellProliferationAssay))评定细胞活力。结果报导为针对未经处理的对照细胞的吸光度标准化的所测量的吸光度(标准化细胞活力％=100x在存在样本的情况下生长于培养基中的细胞的吸光度/生长于培养基中的细胞的吸光度)中值与第25个百分点和第75个百分点。结果利用MTT分析评定杂化凝胶对活体外间皮细胞活力的影响。使细胞在存在100pi圆柱形杂化凝胶(20mg/mlHAX+20mg/mlPLGA纳米颗粒)(测量3.5mmx8mm直径)的情况下生长达3天。这是在存在或不存在10单位/毫升透明质酸酶(一种降解HAX的酶)的培养基中进行。(在对照组中，此提供标准化活力的分母，添加100(al标准生理盐水替代凝胶。)细胞活力在培育第1天和第3天吋保持良好，表明这与透明质酸酶的存在无关。图8中所示组之间并无统计学显著的差异。遞过屉泣^r凝染众ft4/辨术^^教凝^茨欽v、腐裙遼游搭遂材料与方法如实例6中所述制备杂化HA/纳米颗粒水凝胶。染众凝應游活沐/^应^依照麻省理工学院委员会(MassachusettsInstituteofTechnologyCommittee)关于动物护理所批准的方案，遵照有关实验室动物的护理和使用的NIH指导(NIH公告#85-23，1985年修订)护理动物。</、嵐^^赝^注浙#"星〃使用重20-35g的雄性SV129小鼠。将1ml无菌杂化凝胶经由左下象限中的单个穿孔注射入腹膜中。施用前，通过紫外杀菌照明将材料灭菌2小时并将其溶解于无菌生理盐水中。将具有PLGA纳米颗粒的HA-ADH0.5ml(10mg/mlHA-ADH和20mg/ml纳米颗粒)和HA-CHO0.5ml(10mg/ml含有20mg/ml纳米颗粒)放入独立1ml与百特双阀施用器相连的无菌注射器中，并通过20号针共挤出。注射后2或7天，利用二氧化碳对动物实施安乐死。检查动物中粘连的存在与否以及杂化凝胶邀-织学澄產将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林中，包埋于石蜡中，切片并使用标准技术用苏木素和伊红(H&E)染色。结果^^^秀激传递游裔'方兹游辨^发研发将药物传递到腹膜中以预防和/或治疗腹膜粘连和其它目的的方法引起广泛关注。然而，较快的清除率妨碍腹膜的药物传递。试图确定是否能通过应用聚合物基控释技术来改进腹膜药物传递。还研究腹膜使用聚(乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)(—种常用于药物控释的通常具有优良生物相容性的生物可降解聚合物)的微米颗粒和纳米颗粒的适应性。将10到100mg剂量的直径为5到250pm的90kDaPLGA微米颗粒注射入鼠科腹膜中(每组n=3-5只)。发现注射后2周聚合物残余物和粘连的较高发生率(例如，50mg的5)Lim微米颗粒在83%动物中引起粘连)。组织学揭示慢性发炎，且异物巨细胞突出并且颗粒直径大于5Hm。由54、57禾n10kDaPLGA制成的5pm微球体(Y照射)引起极少粘连(16.7%)和类似地残余物发生率。90kDaPLGA的纳米颗粒(265nm)也会引起少得多的粘连(6.3%的动物)，这可能是因为其在2天内从腹膜内清除且在脾脏和肝脏中被隔绝，在脾脏和肝脏中注意到泡沫状巨噬细胞。这些实验表明，所测试的微米颗粒和纳米颗粒单独都无法提供用于腹膜的可接受的聚合物药物传递系统。假定将颗粒截留于原位可交联透明质酸水凝胶中的供腹膜内药物传递的复合水凝胶系统在允许有效使用聚合物基药物传递的同时还将充当抑制粘连形成的障壁。具体来说，假定在可能以其它方式引起粘连形成的颗粒的情况下，水凝胶将至少部分防止经封闭的颗粒引起粘连形成。在将以其它方式从腹膜内迅速清除的颗粒的情况下，水凝胶将所述颗粒保留在腹膜内。V、廣,腐^注浙漠蕃游生激樹荐丝为检验HAX将纳米颗粒保持在腹膜内且同时防止由高分子量PLGA的存在引起的粘连形成的假定，用1ml含有20mgPLGA纳米颗粒的10或20mg/mlHAX注射小鼠腹膜。先前已显示在不存在HAX的情况下注射纳米颗粒的动物在2天内离开腹膜，存留极少的聚合物残余物，并且通常具有变大、脱色的脾脏以及泡沫状巨噬细胞(资料未显示)。注射后2天尸检(表4)时，含有10mg/mlHAX的杂化凝胶在注射部位以离散块状物的形式保留，所述块状物易于与周围的腹部内容物分离(图9A)。含有20mg/mlHAX的杂化凝胶看起来更强的粘附于腹部内容物，而仍易于与接触器官分离，但其存留一些残余物(图9B)。在任一组中都未注意到粘连或脾脏尺寸或颜色的异常。注射后7天处死另一含有20mg/mlHAX的杂化组。4只小鼠忠有3只看到凝胶(图9C),且凝胶质69量可比得上2天后回收的凝胶质量。在这一组中看到粘连的的单一情况下，可见极少凝胶或看不到凝胶，这表明可能的腔内凝胶注射已穿透肠(且可推测随后在粪便中清除)。此外，脾脏看起来很正常。对于经染色的从许多动物的腹腔回收的凝胶载片的光学显微镜检查注意到泡沫状巨噬细胞，表明经保留的纳米颗粒的存在(图IIB，插图)。在肝脏或脾脏中未见泡沫状巨噬细胞。如在图9所有图中可看出，在许多凝胶的周围注意到增加的血管分布。表4.小鼠模型中杂化凝胶的生物相容性<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>邀逝紗凝染众/M/游苯微微茨戯纖微雌蘑縦材料与方法水凝胶如实例6中所述制备杂化HA/纳米颗粒水凝胶。染众凝i游^沐/^/应I依照麻省理工学院委员会(MassachusettsInstituteofTechnologyCommittee)关于动物护理所批准的方案，遵照有关实验室动物的护理和使用的NIH指导(NIH公告弁85-23,1985年修订)护理动物。^粼壁欽资-穿應凝'银漠，将雌性白化兔(西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus);新西兰白(NewZealandWhite)，科文斯公司(Covance)，宾夕法尼亚州黑泽尔顿(Hazleton，PA))(3土0.5kg)用作模型动物。如实例3中所述诱发术后粘连。简单来说，通过沿腹壁上的白线的10cm长中线切口打开腹膜后，从距中线1cm开始对右侧腹壁产生3x4cm包含腹膜壁层和一层肌肉(约lmm厚)的缺损。随后，使用无菌手术刷从回盲部远端第6袋到第12袋双向擦伤盲肠的肠系膜侧边80-160次，引起出血。将20只动物随机分配到以下实验组(i)未治疗(n=12);(ii)利用10ml交联杂化凝胶覆盖经切开腹壁和盲肠表面。将5ml具有PLGA纳米颗粒的HA-ADH(20mg/mlHA-ADH和20mg/ml纳米颗粒)禾口5mlHA-CHO(20mg/mlHA匿CHO和20mg/ml纳米颗粒)放入与百特双阀施用器相连的lOml独立无菌注射器中，并通过15号针共挤出。液体前体立即开始胶凝，符合施用区域的形状。视觉检査，胶凝在不到3分钟内完成水凝胶在超过所述时间点时不流动。如实例3中所述采取手术后护理。程序后1周，利用戊巴比妥钠对动物实施安乐死。遵循所报导的经修改的方法对粘连评分(伯恩斯JW(BurnsJW)，斯金纳K(SkinnerK)，考特J(ColtJ)，谢德林A(SheidlinA)，布朗森R(BronsonR)，雅克伯Y(YaacobiY)等人，通过用透明质酸溶液预涂组织预防组织损伤和术后粘连(Preventionoftissueinjuryandpostsurgicaladhesionsbyprecoatingtissueswithhyaluronicacidsolutions.)手术石开究杂志(JournalofSurgicalResearch)1995;59:644-652,其以引用的方式并入本文中)。O分表示无粘连，1分表示可利用重力分离的组织粘附；2分表示可通过钝器解剖分离的组织粘附且3分表示需要利器解剖的粘连。也记录下粘连的位置(其是否包括缝合部位；粘连中所涉及的盲肠袋的位置和数量)和重量改变。资-织学澄產将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林中，包埋于石蜡中，切片并使用标准技术用苏木素和伊红(H&E)染色。结果^游蘑肅粼壁欽銜-,應^伤'裙，^染众凝應游全激樹^丝浙劝资如方法中所述，使8只兔接受剖腹术，其中将盲肠擦伤且切开一段相邻的腹壁。将杂化凝胶(20mg纳米颗粒于10ml20mg/mlHAX中)涂于受损部位上。l周后尸检时(表5),其重量损失可比得上对照组(相同损伤，未治疗，n=12)。治疗组中的中值粘连分数明显较小(p=0.002，曼-惠特尼U检验；0.001，费雪准确检验)。尽管对照组屮83.3%的动物发展3分粘连(只能通过切割分离的稳固连接)(实例3)，但没有一个治疗组发展3分粘连(p<0.001,曼-惠特尼U检验；p-0.001，费雪准确检验)。与对照组12只动物的2只(16.7%)相比，治疗组8只动物中有5只(62.5%)完全没有展现组织粘附(图10B)(0.04,曼-惠特尼U检验；p=0.035，费雪准确检验)。发展2分粘连的3只动物中，1只是在盲肠表面与接近缝合部位的经切开腹壁之间粘连，1只是在经擦伤盲肠与未擦伤盲肠之间，且1只是在经擦伤盲肠与未擦伤盲肠之间和盲肠表面与接近缝合部位的受损腹壁之间发展2个2分粘连。因此，发生这些2分粘连的部位中有许多为未经杂化凝胶覆盖的部位。尸检时，注意到杂化凝胶仍在其施用的部位处，但数量和机械特性明显降低。在一些情况下，由杂化凝胶的残余物覆盖的盲肠表面保留痕量的最初擦伤的黑血(oldblood)。光学显微镜检查时，在经染色的凝胶残余物载片中注意到推测含有聚合物碎片的泡沫状巨噬细胞(图IIA和B);还注意到游离聚合物(亮点)。在肝脏或脾脏中未见泡沫状巨噬细胞(未显示)。在已施用杂化凝胶的无粘连受损腹壁的表面上也见到泡沫状巨噬细胞(图IIC和D)。表5:兔模型中腹膜粘连的评估<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>*中值与括号中的第25个百分点和第75个百分点。所述数据表明，杂化系统在活体外对于腹膜间皮细胞具有较低细胞毒性；在活体内亍腹膜中生物可相容；并且内在地能够预防粘连。就预防粘连来说，其至少与HAX相仿(实例3)。将纳米颗粒并入HAX中基本上对凝胶系统的胶凝时间或剪切模量无影响。如通过凝胶残余物中泡沫状巨噬细胞的存在以及肝脏和脾脏中所述细胞的缺乏(其中其已在用不存在HAX的相当质量的纳米颗粒注射的小鼠中注意到)可看出，HAX将纳米颗粒成功地保持在腹膜内达实验持续的时间。HAX还可预防所保留的聚合物形成粘连。所述原位形成的凝胶系统易T用双管注射器或类似装置使用。相对快速的胶凝时间允许用户将凝胶施用于特定位置而不会溢到相邻区域中。如上文所论述，可通过改变聚合物浓度和/或分子量或交联密度来改变胶凝时间。因此，可易于通过腹腔镜或透皮注射来施用此系统。潜在用途不限于腹膜且可用于投与多种治疗剂(包括抑制粘连形成的药剂和/或具有其它所需作用的药剂)。杂化凝胶对于预防兔侧壁缺损-盲肠擦伤模型的腹膜粘连极为有效。当比较3分粘连(其为只能通过利器解剖分离的稳固连接)的发病率时，此尤其明显。与未经治疗动物中83.3%的发生率(实例3)相比，经杂化凝胶治疗的动物中不存在3分粘连。类似地，与对照组的17%相比，62.5%的经治疗动物未展现粘连。3例2分组织粘附(可通过钝器解剖分离)出现于接近缝合部位处或两个盲肠表面(其中l个未擦伤)之间，即，所有涉及粘连的区域都未经杂化凝胶覆盖。此处，凝胶是施用于损伤部位的边界内。跨较大表面积的系统施用可进一步增加功效。总的来说，此处所述的杂化HAX-纳米颗粒系统看起来为适当的腹膜内药物传递系统以及预防术后粘连的有效障壁。遞逝妙教#,心游/M微微鼓微术,離蕭遂材料与方法(^魔^"度游汰众如上所述制备HA-ADH和HA-CHO。利用不同浓度(包括最大可达到浓度)的具有不同Mw的HA-ADH和HA-CHO的溶液制备HAX凝胶。通过使用涡旋混合器将150piHA-ADH和150HA-CHO溶液混合于2ml微量离心管中且随后将其在37'C下于透明质酸酶(50U/ml于PBS中)中培育来制备HAX凝胶。在预定时间点时，完全去除透明质酸酶缓冲液，并且经重量分析测定剩余HAX凝胶的湿重。置复激廢^^f星y使用雌性白化兔(西班牙野兔(OryctolaguscunicuIus);新西兰白(NewZealandWhite))(3土0.5kg)。如上文所述执行第一次剖腹术和手术后护理。1周后执行第二次剖腹术。在第2次剖腹术前检查时，将以下动物从第2次剖腹术中排除(i)由于第1次剖腹术而体重损失超过15%;(ii)进食不良。进行剖腹术时，如前述对粘连评分随后溶解(切割)。使用无菌刷，单向再擦伤先前经切开腹壁50次并且双向再擦伤第6与第12袋之间的盲肠表面150-200次，直到获得出血床(bleedingbed)。将30只动物随机分到实验组并且将测试材料施用于受损区域。手术者对所述材料的性质未知。通过紫外杀菌照明将HA-ADH和HA-CHO灭菌2小时并将其分别溶解于5ml无菌生理盐水中。如前述，利用双阀施用器将10ml凝胶施用于受损部位。作为对照，使一组动物不接收治疗，并且另一组接收10ml生理盐水。在治疗受损区域后，分别利用2-0爱惜良缝线(Ethilon)和3-0地可松缝线(Dexon)闭合腹膜和腹壁。利用2-0爱惜良缝线闭合皮肤。使动物醒来且自由取用食物和水。术后48小时内，以8-12小时间隔经皮下投与丁丙诺啡0.02-0.03mg/kg。第2次剖腹术后1周通过静脉内注射戊巴比妥钠处死动物。以两种方式对粘连评分(i)粘连的质量评分如下使用所报导的方法的修改方法对粘连评分(伯恩斯JW(BurnsJW)，斯金纳K(SkinnerK)，考特J(ColtJ),谢德林A(SheidlinA)，布朗森R(BronsonR)，雅克伯Y(YaacobiY)等人，通过用透明质酸溶液预涂组织预防组织损伤和术后粘连(Preventionoftissueinjuryandpostsurgicaladhesionsbyprecoatingtissueswithhyaluronicacidsolutions.)手术研究杂志(JournalofSurgicalResearch)1995;59:644-652，其以引用的方式并入本文中)。0分=无粘连，1分=利用重力将会分离的组织粘附；2分=可通过钝器解剖分离的组织粘附；3分=需要利器解剖的粘连。如果存在具有不同得分的多个粘连，那么选择得分较高者作为代表性得分；(ii)测量2分或3分粘连的面积以用于粘连的定量评估。记录下粘连的位置(其是否包括缝合部位；粘连中所涉及的盲肠袋的位置和数量)和重量改变。将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林中，包埋于石蜡中，切片并用苏木素和伊红染色以供组织学检查。结果73粘度会阻止先前使用的HA溶液的浓度增加(尤其HA-ADH)。为进一步增加浓度，使用较低Mw的HA制备经修饰HA。如表6中所示，最大实际浓度(即可利用吸管或注射器处理的浓度)随HA的Mw的降低而增加。表6.经修饰HA溶液的最大浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>*应注意所列的Mw为原始HA的标称Mw。凝魔浓度游沐众所有具有增加浓度的HAX凝胶都持续比20mg/mlHAX凝胶长得多的时间(表7)。应注意，持续时间最长的凝胶并非最高浓度凝胶。尽管具有高密度，由低MwHA组成的凝胶(即，主链上具有许多缺口)看起来在降解的后一阶段具有较快的质量损失。在所测试的HA组合中，75mg/mlHA-A(50kD)禾卩60mg/mlHA-B(1.36MD)提供最慢降解的HAX凝胶。(在50u/ml透明质酸酶中tl/2:51天)。将由75mg/mlHA-ADH(50kD)+60mg/mlHA-CHO(1.36MD)形成的凝胶称为HAXhx。表7.HAX凝胶于50u/ml透明质酸酶中的半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>a.水凝胶湿重降低50%的时间b.通过外推法测定重复激/,术漠歪y游砑充本模型产生广泛、可再现的粘连。由于其产生的丰富的粘连对于治疗是极大挑战，故其并不常用。重复剖腹术模型使得能评估候选材料预防重度粘连和/或复发粘连(市售产品对其仅展现有限作用)的功效。此外，本模型使得能鉴别甚至比前述实例中所述材料更有效的材料。第1次剖腹术后，30只动物中有29只(96.7%)发展3分粘连(和部分2分粘连)。所述粘连主要涉及切开的腹壁和经擦伤的盲肠袋，通常还涉及未擦伤盲肠(主要在回盲部周围，因为其位置使其能接触切开的腹膜壁)。第1次剖腹术后第1周时，动物失去-6.1±3.9%体重。通过利器或钝器解剖小心地溶解粘连。溶解通常导致腹壁的深度损伤且随后的出血。经再擦伤的盲肠比最初擦伤更容易出血。如果不经任何治疗闭合切口，当1周后再次探査时，100%(n=6)己发展3分粘连。粘连不限于受损位置，而是涉及腹壁上的缝合线、未受损盲肠表面和/或盲肠间、盲肠近端结肠表面间。粘连的中值总面积为12.7(25%:9.4，75%:16.6)cm2。第2次剖腹术后l周的存活期间，动物失去-3.5±7.4%体重。7大凝^^游^,^/f^使用重复剖腹术模型测试tPA-HAXhx凝胶的活体内功效并且将其与HAX凝胶和含有PLGA纳米颗粒的杂化凝胶(1:1的颗粒:HA衍生物比率(w/w))的功效相比较。作为其它对照，还投与(i)tPA已经热处理失活的tPA-HAXhx凝胶；(ii)不存在HAX的tPA溶液团注。实验方案概述于下<image>imageseeoriginaldocumentpage75</image>结果概述于表8中。简单来说，通过使用高浓度HA衍生物实现的具有高交联密度("hx")的tPA-HAX对于预防双重损伤模型中的粘连最有效。尽管HAX(hx)(无tPA)不太有效，但无活性tPA-HAX(hx)和团注tPA(将tPA溶液施用于受损组织上)都引起粘连面积的降低。不希望受任何理论束缚，此作用可能与活化酶(tPA，基因酶公司)中的非活性成分有关。含有100mgtPA的活化酶还含有3.5gL-精氨酸、lg磷酸、聚山梨醇酯80(<11mg)。因此，这些药剂都适于个别或组合包涵于本发明的水凝胶中。总的来说，HAX和杂化凝胶可实现本模型中高级别粘连的相对适度的降低(约17%)，而含有组织纤溶酶原活化剂(tPA)的HAX使高级别粘连的发生率明显降低60%且使这些粘连的表面积减小IOO倍。重要的是，所述治疗益处是在不引起全身性出血的情况下获得，而所述全身性出血已成为所报导的使用游离tPA的主要问题。表8:含有tPA的HAX凝胶的功效<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>1.tPA是以基因酶公司所提供的形式使用(2.2mg活化酶+L-精氨酸+磷酸+聚lll梨酸酯80)。2.tPA经煮沸20分钟失活。利用ELISA确定蛋白质构型的破坏。实,，麟磁微微肌微遂藤铺形成獻微鹏游雄餅本实例描述由HA和纤维素衍生物(诸如CMC(羧甲基纤维素)、MC(甲基纤维素)和HPMC(羟丙基甲基纤维素))构成的原位可交联水凝胶的研究。材料与方法/M-AD//、7M-C7/(9、CMC-C7/0,//PMC-C/ZO游劍吝..所述方案与上文所述的用于合成HA-CHO的方案基本上相同。厨益^凝應，^吝，使用双管注射器将2wt%HA-ADH禾Q2wt%HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO或MC-CHO的水溶液混合于夹在两个载片之间的橡胶模具中。所制得的水凝胶的直径和厚度分别为1.2cm和3.5mm。结果CMC-CHO、H尸MC-C/ZO^7AfC-C//0游#成/〃表*通过NMR禾卩FT-IR证实成功合成。通过GPC测量的重量平均分子量Mw为103到107。HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO和MC-CHO的修饰程度为约50%。ZM-CMC、浙/M-A/C游i凝好/坊，通过将HA-ADH与不同醛多糖(诸如CMC-CHO、MC-CHO和HPMC-CHO)交联来形成多种水凝胶。如表9中所示，HAX(由交联HA-ADH与HA-CHO所形成)、HA-HPMC、HA-MC和HA-CMC的胶凝时间在约3-18秒的范围内，表明其对于原位交联的适应性。/M-CMC、ft4-///WC//7/M-MCy^^^#^G,所测量的由流变仪测量的G值展示于表9中，HA-HPMC和HA-MC展现相对较高的值。表9.HA-CMC、HA-HPMC和HA-MC的胶凝时间和剪切模量胶凝时间(秒)HAX3.5±1.032.4±17.2HA-CMC18.5±.791.7±19.3HA-HPMC4.0±1.2291.7±108.6HA-MC5.8±2.9296.8±40.77#水凝^注浙#^#^^将由0.5ml2wt%HA-ADH禾卩0.5ml2wt%CMC-CHO(或MC-CHO、HPMC-CHO)组成的1ml水凝胶注射到小鼠腹膜内。在注射到小鼠腹膜内后，这些水凝胶生物相容性良好。注射后4天，发现呈粘着块状物形式的HA-HPMC凝胶。另一方面，HA-CMC和HAX在整个腹腔内扩散且覆盖所有器官。HA-MC具有中间结构/稠度。注射后2周，注射HAX的动物中几乎无残余物。HA-HPMC凝胶在2周时仍保持。HA-CMC凝胶也保持且以一薄层覆盖内脏。如表10中所示，这些凝胶的注射都不会引起腹膜粘连。表10:粘连的发病率水凝胶第4天第l周第2周第3周总计HAX0/20/10/10/10/5HA-CMC0/30/10/10/60/6HA-HPMC0/20/11/10/11/5HA-MC0/20/10/10/4还测试由交联HA衍生物和纤维素衍生物所形成的复合水凝胶抑制实例3中所述的兔粘连模型的粘连的能力。简单来说，将HA-ADH连同CMC-CHO、MC-CHO或HPMC-CHO—起投与以形成2wt%HA-CMC、HA-MC、HA-HPMC水凝胶。将生理盐水注射用作对照。如表11中所示，HA-CMC、HA-MC和HA-HPMC展现优良的腹膜粘附预防作用。表lh兔测试结果(每组4只兔)/M-OWC/M-MC对照(生理盐水)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>频仏'廢微微透颜麽辦遂蘇，财凝微茨雄微遂手术后腹膜粘连可引起盆腔疼痛、肠梗阻和不孕(迪泽佳G.S.(DiZerega，G.S.)，腹膜手术(PeritonealSurgery.)1999.纽约斯普林格(NewYork:Springer);其以引用的方式并入本文中)。己在商业上研究多种膜障壁装置，取得不同程度的成功(迪泽佳G.S.(DiZerega，G.S.)，腹膜手术(PeritonealSurgery.)1999.纽约斯普林格(NewYork:Springer);其以引用的方式并入本文中)。由于由简单混合两种不同聚合物原位形成的凝胶易于在室温下操作且不需要辐射光源或有毒化学交联剂，故出于此目的所述凝胶引起人们的兴趣(琼斯D.B.(Johns,D.B.);罗杰斯K.E.(Rodgers，K.E.);唐纳休W.D.(Donahue,W.D.);齐沃普斯T.C(Kiorpes，T.C);迪泽佳G.S.(diZerega,G.S.)，通过手术后投与离子交联透明质酸来减少粘连(Reductionofadhesionformationbypostoperativeadministrationofionicallycross-linkedhyaluronicacid.)生育禾口不育(FertilSteril)1997;68(1):37-42;李H.(Li，H.);刘Y.C(Liu,Y.C);舒X.Z.(Shu,X.Z.);格雷S.D.(Gray,S.D.);普雷斯特维奇G.D.(Presrwich,G.D.)，交联透明质素-丝裂霉素C7K凝胶的合成禾U生物评估(Synthesisandbiologicalevaluationofacross-linkedhyalu固an-mitomycinChydrogel).生物大分子(Biomacromolecules)2004;5(3):895-902;刘Y.C(Liu，Y.C);李H.(Li，H.);舒X.Z.(Shu,X.Z.);格雷S.D.(Gray，S.D.);普雷斯特维奇G.D.(Prestwich,G.D.)，含有丝裂霉素C的交联透明质素水凝胶降低手术后腹部粘连(CrosslinkedhyaluronanhydrogelscontainingmitomycinCreducepostoperativeabdominaladhesions.)生育和不育(FertilSteril)2005;83:1275-1283;欧S.H.(Oh，S.H.);金姆J.K,(Kim,J.K.);宋K.S.(Song,K.S.);诺和S.M.(Noh,S.M.);吉尔S.H.(Ghil，S.H.);优克S.H.(Yuk,S.H.);李J.H.(Lee，J.H.)，利用溶胶-凝胶转变行为通过载有消炎药物的普流尼克混合物预防术后组织粘连(Preventionofpostsurgicaltissueadhesionbyanti-inflammatorydrug-loadedpluronicmixtureswithsol-geltransitionbehavior.)生物材料研究杂志A(JBiomedMaterResA)2005;72(3):306-16;伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley，C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane,D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"stocross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;布尔皮特P.(Bulpitt,P.);艾斯奇曼D.(Aeschlimann，D.)，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)1999;47(2):152-169:贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera,R.);朗格R.(Langer,R.);克汉D.S.(Kohane，D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!'nw'Hicross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，所述文献各自以引用的方式并入本文中)。其通常易于施用于受损区域上，尤其当难以用简单薄片覆盖时或当所述区域极大时更是如此。透明质酸(HA)为所述应用的良好候选材料(琼斯D.B.(Johns,D.B.);罗杰斯K.E.(Rodgers,K.E.);唐纳休W.D.(Donahue,W.D.);齐沃普斯T.C(Kiorpes，T.C);迪泽佳G.S.(diZerega，G.S.)，通过手术后投与离子交联透明质酸来减少粘连(Reductionofadhesionformationbypostoperativeadministrationofionicallycross-linkedhyaluronicacid.)生育和不育(FertilSteril)1997;68(l):37-42;李H.(Li，H.);刘Y.C(Liu,Y.C);舒X.Z.(Shu，X.Z.);格雷S.D.(Gray,S.D.);普雷斯特维奇G.D.(Presrwich,GD.)，交联透明质素-丝裂霉素C水凝胶的合成和生物评估(Synthesisandbiologicalevaluationofacross-linkedhyaluronan-mitomycinChydrogel).生物大分子(Biomacromolecules)2004;5(3):895-902;刘Y.C(Liu,Y.C)-'李H.(Li,H.);舒X.Z.(Shu,X.Z.);格雷S.D.(Gray,S.D.);普雷斯特维奇G.D.(Prestwich，G.D.)，含有丝裂霉素C的交联透明质素水凝胶降低手术后腹部粘连(CrosslinkedhyaluronanhydrogelscontainingmitomycinCreducepostoperativeabdominaladhesions.)生育禾口不育(FertilSteril)2005;83:1275-1283;伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley，C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito，T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane，D.),原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;布尔皮特P.(Bulpitt,P.);艾斯奇曼D.(Aeschlimann,D.)，化学修79饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)1999;47(2):152-169;贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera,R.);朗格R.(Langer,R.);克汉D.S.(Kohane，D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadebycross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，所述文献各自以引用的方式并入本文中)，这是因为众所周知HA在腹膜内生物可相容(迪泽佳G,S.(DiZerega,G.S.),腹膜手术(PeritonealSurgery.)1999.纽约斯普林格(NewYork:Springer),其以引用的方式并入本文中)并且化学交联HA水凝胶(HAX)可预防兔模型中腹膜粘连(伊欧Y.(Yeo,Y.);海利C(Highley，C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane，D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/ww'fwcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。透明质酸经内源透明质酸酶(克尼普P.A.(Knepper，P.A.);法伯曼A.I.(Farbman，A.泰斯尔A.G.(Telser，A.G.)，外源透明质酸酶和兔眼中透明质酸的降解(ExogenousHyaluronidasesAndDegradationOfHyaluronic-AcidInTheRabbitEye.)眼禾斗学研究与视力学(InvestigativeOphthalmologyandVisualScience)1984;25(3):286-293;其以引用的方式并入本文中)和羟基(索特L.(Soltes，L.);曼迪奇R.(Mendichi,R.);克根G.(Kogan，G.);斯奇勒J.(Schiller,J.);斯坦科瓦卡M.(Stankovska,M.);阿诺德J.(Arnhold，J.)，反应性氧物质対'于透明质素的降角率作用(Degradativeactionofreactiveoxygenspeciesonhyaluronan.)生物大分子(Biomacromolecules)2006;7(3):659-668;尤N.(Yui,N.);奥卡诺T.(Okano，T.);桜井Y.(Sakurai，Y.)，交联透明质酸凝胶的发炎性反应性降解(InflammationResponsiveDegradationOfCross-LinkedHyaluronic-AcidGels.)控释杂志(JControlRel)1992;22(2):105-116，所述文献各自以引用的方式并入本文中)降解。已证实HAX凝胶实质上在1周内降解，在腹膜内存留明显减少的量的凝胶(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley,C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini,R.);朗格R.(Langer,R.);克汉D.(Kohane，D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部禾占连(/"w.似cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。然而，视损伤的严重程度或面积而定，设计能在腹膜内持续更长时间的水凝胶将是有益的。假定将HA与不会在人体内酶促降解的其它生物可相容性多糖杂合可在保留HA优良的生物相容性的同时减缓降解。也已知诸如羧甲基纤维素(CMC)(埃金斯T.E.(Elkins，T.E.);伯利R.J.(Bury,R.J.);瑞特J.L.(Ritter，J.L.);凌F.W.(Ling，F.W.);奥卡斯R.A.(Ahokas，R.A.);霍姆斯C.A.(Homsey，C.A.);马林卡L.R.(Mainak，L.R.)，在大鼠1中通过羧甲基纤维素钠溶液预防粘连(AdhesionPreventionBySolutionsOfSodiumCarboxymethylcelluloseInTheRat,l.)生育与不育(FertilSteril)1984;41(6):926-928;刘L.S.(Liu，L.S.);伯格R.A.(Berg，R.A.)，羧甲基纤维素与聚氧化乙烯复合凝胶的粘连障壁(Adhesionbarriersofcarboxymethylcelluloseandpolyethyleneoxidecompositegels.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2002;63(3):326-332;里尔C,M.(Lehr,C,M.);伯瓦斯特J.A.(Bo画tra，J.A.);斯奇特E.H.(Schacht,E.H.);加因格H.E.(Junginger,H.E.),壳聚糖和一些其它天然聚合物的粘膜粘连特性的活体外评估(InvitroEvaluationOfMucoadhesivePropertiesOfChitosanAndSomeOtherNaturalPolymers.)国际药学杂志(InternationalJournalofPharmaceutics)1992;78(l):43-48;林奇R.E.(Leach,R.E.);伯恩斯J.W.(Bums,J.W.);大卫E.J.(Dawe，E.J.);斯米斯巴伯M.D.(SmithBarbour，M.D.);戴尔蒙德M.P.(Diamond,M.R)，利用透明质酸盐/羧甲基纤维素凝胶减少兔子宫角模型中术后粘连形成(Reductionofpostsurgicaladhesionformationintherabbituterinehornmodelwithuseofhyaluronate/carboxymethylcellulosegel.)生育与不育(FertilSteril)1998;69(3):415-418);所述文献各自以引用的方式并入本文中)和羧丙基甲基纤维素(HPMC)(里尔C.M.(Lehr，C.M.);伯瓦斯特J.A.(Bo西stra，J.A)'斯奇特E.H.(Schacht,E.H.);加因格H.E.Uunginger，H.E.),壳聚糖和一些其它天然聚合物的粘膜粘连特性的活体外评估(InvitroEvaluationOfMucoadhesivePropertiesOfChitosanAndSomeOtherNaturalPolymers.)国际药学杂志(InternationalJournalofPharmaceutics)1992;78(l):43-48;所述文献以引用的方式并入本文中)等纤维素衍生物在腹膜内具有良好的生物相容性。甲基纤维素(MC)在腹膜内的生物相容性尚未知，但据报导，MC与HA的混合物在鞘内注射液中生物相容(古帕塔D.(Gupta,D.);塔特C.H.(Tator，C.H.);肖奇特M.S.(Shoichet，M.S.)，用于受损脊髓的鞘内局部传递的透明质素与甲基纤维素的快速胶凝可注身寸掺合物(Fast-gellinginjectableblendofhyaluronanandmethylcelluloseforintrathecallocalizeddeliverytotheinjuredspinalcord.)生物材料(Biomaterials)2006;27:2370-2379，其以引用的方式并入本文中)。81已合成出由HA与纤维素衍生物(诸如CMC、HPMC和MC)构成的原位交联可注射水凝胶。也已在活体外表征这些水凝胶，研究其对于细胞培养物的细胞毒性以及其在鼠科腹膜中的生物相容性。最后，还研究其用于预防兔模型中腹膜粘连的效用。材料与方法-贅^欽浙/大凝麽游合成试^/,HA(M户490kDa和1.4MDa)购自基因酶公司(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))。CMC(产品编号C4888)、HPMC(产品编号H9262)、MC(产品编号M0387)、透明质酸酶、己二酸二酰肼(ADH)、l-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳化二亚胺(EDC)、羟基苯并三唑(HOBt)、高碘酸钠、乙二醇、肼基甲酸叔丁酯(t-BC)、碳酸氢钠、氯化钠和乙酸都购自西格玛-阿尔德里奇公司(密苏里州圣路易斯(St丄ouis,MO))。将购自昭和电工株式会杜(ShowaDenko)(日本)的普鲁兰多糖用作凝胶渗透色谱(GPC)的标准品。^g",会激必谅y多，如图12所示，将1.4MDaHA、CMC、HPMC和MC修饰成醛形式(分另U为HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO和MC-CHO)。所述方案类似于先前用于HA-CHO的方案(克汉DS(KohaneDS),里普M(LippM)，金尼RC(KinneyRC)，安东尼DC(AnthonyDC),路易斯DN(LouisDN);罗丹N(LotanN)等人含有布比卡因的脂质-蛋白质-糖颗粒于神经外膜中的生物相容性(Biocompatibilityoflipid-protein-sugarparticlescontainingbupivacaineintheepineurium.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2002;59(3):450-459;克汉DS(KohaneDS)，提斯JY(TseJY)，伊欧Y(YeoY)，帕德拉R(PaderaR)，舒伯纳M(ShubinaM)，朗格R.(LangerR.)用于腹膜中药物传递的生物可降解聚合微球体和纳米球体(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2005:出版；奥瑞塔H(OritaH)，夫卡斯瓦M(FukasawaM)，吉尔吉斯W(GirgisW),迪泽佳GS.(diZeregaGS.)标准兔模型中术后粘连的抑制利用组织纤溶酶原活化剂进行腹膜内治疗(Inhibitionofpostsurgicaladhesionsinastandardizedrabbitmodel:intraperitonealtreatmentwithtissueplasminogenactivator.)国际生育杂志(IntJFertil1991);36(3):172-177，所述文献各自以引用的方式并入本文中)。简单来说，将1.5gHA、CMC、HPMC或MC溶解于150ml水中，随后添加802mg高碘酸钠，并且搅拌2小时。添加200^1乙二醇以终止反应，并立即相对水透析混合物。将纯化产物冻千并于4'C下存储。激i^覆^激游杀y吝，使用先前所述的方法将490kDaHA修饰成己二酸二酰肼HA(HA-ADH)(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley，C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini,R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane，D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/mcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;布尔皮特P.(BulpiU,P.);艾斯奇曼D.(Aeschlimann,D.)，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容zK凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)1999;47(2):152-169'，贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera,R.);朗格R.(Langer,R.);克汉D.S.(Kohane，D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadebycross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，所述文献各自以引用的方式并入本文中〉。圆盘水凝胶的制备使用双管注射器(百特公司(Baxter),伊利诺伊斯州迪尔费德(Deerfield,IL))将PBS中的2wt%HA-ADH和PBS中的2wt%HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO或MC-CHO注射到夹在两个载片之间的橡胶模具中。所制得的水凝胶的直径和厚度分别为1.2cm和3.5mm。下文中分别将这些交联水凝胶称为HAX、HA-CMC、HA-HPMC禾HHA-MC。覆^激*/大凝麽游表,覆#欽游表氛-执行10mg/mlHA-ADH、HA-CHO、CMC-CHO、HPMC匿CHO禾口MC-CHO的D20溶液的'H-NMR(瓦里安技术公司(Varian):优尼提300型分光光度计(Unity300spectrophotometer),加州帕罗奥多(PaloAlto，CA))光谱分析。如贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera，R.):朗格R.(Langer,R.);克汉D.S.(Kohane，D.S.),通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadebycross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804中所述，在酸聚合物(HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO和MC-CHO)与t-BC反应后，对其进行分析。测量在D20中与t-BC反应的聚合物的"H-NMR光谱。使用GPC测量多糖的分子量。柱为沃特世水凝胶线性柱(UltrahydrogelLinear)(沃特世公司(Waters),马萨诸塞州米尔福德(Milford,MA)),并且折射率(RI)是由折射计(怀雅特技术公司:OPTILABDSP(WyattTechnology:OPTILABDSP)，力口州圣塔芭芭拉(SantaBarbara,CA))检测。流动相为0.05M钠与0.2M氯化钠(pH=6.7)的混合物，且其流动速率为0.8ml/min。将普鲁兰多糖(赛多利斯(Shodex),普鲁兰多糖标准品P5-P800(PullulanStandardsP5-P800),日本)用作分子量标准品。水^^^表^V通过以下方案测量胶凝时间。将100微升HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO或MC-CHO水溶液添加到100微升HA-ADH水溶液中，在皮氏培养盘上使用热板/搅拌器(康宁PC-320型(Corning:ModelPC-320),纽约康宁公司(Corning,NY))利用磁力搅拌棒以155rpm混合。胶凝时间为混合物变为小球时的时间；对每一样本测量4次。利用流变仪(TA仪器公司AR1000(TAInstruments:AR1000)，德拉华州纽卡斯特(NewCastle,Delaware))测量所制得的圆盘凝胶的剪切模量。将圆盘凝胶浸入PBS中达5天并且使其膨胀达到平衡。以不同剪切应力进行蠕变和松弛测试。施加剪切应力3分钟，随后为3分钟松弛。在每次测量中，在蠕变测试期间应变值达到恒定且随后在松弛测试期间使其回到零。由应力与应变之间的线性关系的斜率计算剪切模量G。应力与应变之间的拟合线的W值高于0.95。37i:下在PBS中以重量分析方式测量凝胶盘膨胀的时程。在PBS中浸泡5天后测量胶凝后水凝胶的重量Ws。Ws与刚好胶凝后水凝胶的初始重量Wi的膨胀比Q是以Q二W/Wi计算。降解动力学测量如下37。C下在PBS中的10单位/毫升透明质酸酶屮培育4个水凝胶盘。在各时间点时，对凝胶盘称重，并且替换透明质酸酶溶液。进行测量达14天。测定各时间点时水凝胶的体积与初始体积的比率(水凝胶的体积(％))。潘應毒丝分叛使用人类间皮细胞(ATCC:CRL-9444，弗吉尼亚州马尔萨斯(Manassas,VA))和巨噬细胞细胞系J774.A1(ATCC:TIB-67)通过MTT分析(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))研究在存在HA-CHO、CMC-CHO、MC-CHO和HPMC-CHO的情况下的活体外细胞活力。37'C下于5%C02中，使间皮细胞在完全生长培养基(GIBCO:含有伊尔氏BSS(Earle'sBSS)、0.75mML-谷氨酰胺和1.25g/L碳酸氢钠且补充有3.3nM表皮生长因子、400nM氢化可的松、870nM胰岛素、20mMHEPES和10%胎牛血清的培养基199)中生长并维持。使巨噬细胞在DMEM培养基(GIBCO:具有10%胎牛血清的DMEM目录号10569-010)中生长和维持。将5xl0"个细胞放入24孔培养板的各孔中，且在37。C下于5%C02中培育整夜，随后将培养基用含有不同浓度HA-B、CMC-B、HPMC-B和MC-B的培养基替换。在间皮细胞的情况下添加这些材料后第3天或在J774.A1细胞的情况下第2天，执行MTT分析。将100微升四氮唑盐溶液添加到各孔中且在37。C下培育4小时。使用1ml清洁剂溶液将由活性线粒体产生的紫色甲臜(formazan)溶解且随后在570nm通过板读数器(分子装置公司SpectraMax384型(MolecularDevices:SpectraMax384),加州联合市(UnionCity,CA))读取。将吸光度值关于未经聚合物处理的细胞的各孔标准化。贫沐/^貧澄依照麻省理工学院(MassachusettsInstituteofTechnology)的动物护理和使用委员会(AnimalCareandUseCommittee)所批准的方案以及实验室动物的护理原则(NIH公告弁85-23，1985年修订)护理所有动物。游袁凝農磨V、維脚重25g的SV129小鼠是购自塔科尼克公司(纽约哈德孙(Hudson,NY))且将其分数组以6AM-6PM白天-黑夜循环圈养。通过UV照射2小时将聚合物灭菌，随后将其以2wt呢浓度溶解于生理盐水中。利用50mg/kg开他敏和10mg/kg赛拉嗪诱使麻醉，且产生5mm皮肤切口，露出半透明的腹壁。将24号留置针(泰尔茂公司瑟夫希静脉留置针(Terumo:SurflashI.V.Catheter),日本)放置穿过腹壁，且吹入0.3ml空气以确定定位。随后使留置针前进lcm，且使用双管注射器施用器(百特公司(Baxter),伊利诺伊斯州迪尔费德(Deerfield,IL))注射0.5ml醛多糖(HA-CHO、CMC匿CHO、HPMC-CHO或MC匿CHO)禾卩0.5mlHA-ADH。注射后4天、l周、2周和3周后处死小鼠，且评估残余物和粘连的存在。解剖者对个别小鼠接收何种治疗未知。需要取样时，对腹部内容物取样，将其固定于10%福尔马林中并使用标准技术处理以供组织学分析(苏木素伊红染色的载片)。if过i粼垄^銜-應1伤裙仿腐篪搭遂游豫欽如所述诱发腹膜粘连(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型手术后腹部粘连(/""'似cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。使用开他敏(肌肉内35mg/kg)和赛拉嗪(肌肉内5mg/kg)使雌性白化兔(西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus);新西兰白(NewZealandWhite),科文斯公司，宾夕法尼亚州黑泽尔顿(Hazleton，PA))(3±0.5kg)麻醉，且使用平衡氧中的1-3%异氟烷维持。沿白线产生10cm长的中线切口，并打开腹膜。通过在右侧腹壁上产生3x4cm缺损且擦伤盲肠7个袋直到获得出血表面来诱发腹膜粘连。85各实验组随机分配4只动物(i)生理盐水；(ii)利用10ml交联HA-CMC、HA-HPMC或HA-MC覆盖经切开腹壁和经擦伤盲肠表面。施用前，通过紫外杀菌照明将材料灭菌2小时并将其溶解于无菌生理盐水中。将凝胶前体溶液(5mlHA-ADH(20mg/ml)禾P5mlCMC匿CHO、HPMC-CHO或MC-CHO(20mg/ml))放入与双管注射器施用器相连的10ml独立无菌注射器中，并通过15号针共挤出。液体前体立即开始胶凝，符合耙区域的形状。如前述予以术后动物护理(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley，C);贝拉斯E.(Bellas，E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane,D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/ncross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。程序后l周，利用静脉内100mg/kg戊巴比妥钠对动物实施安乐死。使用所报导的方法对粘连评分0分=无粘连，1分=利用重力将会分离的组织粘附；2分=可通过钝器解剖分离的组织粘附；3分=需要利器解剖的粘连。还测量2分和3分粘连的面积。如上文所述对所关注的组织取样且制备用于组织学分析。通过ANOVA然后学生t检验分析数据。对各水凝胶与对照之间的粘连得分进行威尔科克逊秩和检验(Wilcoxonrank-sumtest)。利用卡雷达格拉夫@(KaleidaGraph)(斯尼吉软件公司(SynergySoftware))进行统计检验。p值<0.05被认为是统计学显著的。结果/M-AL>//、/M-C/ZO、CMC-CiZO、//尸似C-C/fO/〃MC-C//0游合成^7表好'通过己二酸二酰肼的亚甲基质子来确定HA-ADH的合成(在1.62ppm处具单重峰且在2,25ppm和2.38ppm处具有双重峰)(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley,C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.(Kohane,D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"w'似cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;布尔皮特P.(Bulpitt,P.);艾斯奇曼D.(Aeschlimann,D.)，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)簡;47(2):152-169;贾X.Q.(Jia,X,Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera，R.);朗格R.(Langer，R.);克汉D.S.(Kohane，D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!'ww'wcross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804，所述文献各自以引用的方式并入本文中)。由HA的N-乙酰基-D-葡糖胺残基(在2.0ppm处的单重峰)的峰面积与在1.62ppm处己二酸二酰肼的亚甲基质子的峰面积的比率计算修饰的程度；修饰程度为48.4%。为分析由氧化反应形成的醛基，使醛聚合物与t-BC反应，随后进行^-NMR分析。在每一醛修饰多糖中，出现叔丁基的化学位移(1.20ppm处的单峰和1.43ppm处的单峰)，表明成功合成HA-CHO、CMC-CHO、HPMC-CHO和MC-CHO。HA的Mw和Mw/Mn为1432kDa禾卩5.2。CMC、HPMC和MC的Mw>1MDa。醛聚合物的Mw介于109与239kDa之间，这小于HA-ADH的Mw(表12.1)。表12.1.经修饰聚合物的分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>*先前报导(克汉DS.(KohaneDS),利普M(LippM)，金尼RC(KinneyRC)，安东尼DC(AnthonyDC)，路易斯DN(LouisDN)，罗丹N(LotanN)等人，含有布比卡因的脂质-蛋白质-糖颗粒于神经外膜中的生物可相容性(BiocompatibiUtyofIipid-protein-sugarparticlescontainingbupivacaineintheepineurium.)生净勿医学丰才丰斗石if》《杂志UBiomedMaterRes)2002;59(3):450-459，其以引用的方式并入本文中)。Mw:重量平均分子量；Mn:数量平均分子量。廣位/大凝^"游薪伴介激潘众学^^HA-ADH和醛修饰纤维素衍生物都在可接受的短暂时间范围内形成凝胶(表12.2)。HA-CMC的胶凝时间明显比其余物质的时间长(HA-CMC与其它醛多糖之间p<O扁l)。表12.2.交联水凝胶的物理特性HAXHA匿CMCHA-HPMCHA-MC3.5±1.019.0±1.74.0±1.25.8±2.9胶凝时间(秒)200±14230±10120±13150±4膨胀比*(%)G'(Pa)32±1792±19292±109297±41*在磷酸盐缓冲生理盐水中浸泡5天时测量数据为平均值土标准差(n=4)水凝胶膨胀，在PBS中浸泡后1天达到平衡且在接下来的4天中保持恒定(资料未显示)。自始至终，膨胀比(表12.2)排序如下HAX、HA-CMC>HA-MC(p<0.001)>HA-HPMC(p=0.0053)。HAX的剪切模量(表12.2)G小于HA-CMC、HA-HPMC或HA-MC的剪切模量(p<0.05)。HA-CMC的剪切模量小于HA-HPMC或HA-MC的剪切模量(p<0.05)。HA-MC与HPMC之间不存在G的统计学差异(p=0.93)。透欲廣虔艨,#游动力学水凝胶于透明质酸酶溶液中的降解动力学存在差异(图17)。HAX降解最快(第1天和第2天时相对于HA-CMC，p<0.001)。HAX和HA-CMC分别在到第4天和第5天时完全降解。相比之下，HA-MC和HA-HPMC历时2周也未完全降解。这些差异的一个可能的原因在于HA-MC禾PHA-HPMC的交联程度比HAX高。另一原因为由于HA-MC和HA-HPMC并没有如HAX和HA-CMC—样膨胀，故透明纸质酸酶无法有效扩散到其中。豕^激者/h7座潘應浙^"蠻謝應话力游嚴聘在存在多种浓度醛聚合物的情况下培养间皮细胞。对于所有聚合物，细胞活力都存在剂量依赖性降低。在0.3%(w/v)下HA-CHO和MC-CHO并未使细胞活力降低(p>0.05)(图18A)，而HPMC-CHO(p=0.0011)禾nCMC-CHO(p=0.044)引起细胞活力较小降低。在较高浓度下，HA-CHO展现细胞活力的较小降低，而纤维素衍生物展现较多降低培育3天后细胞活力的等级排序为HA-CHO〉CMC-CHO>MC-CHO〉HPMC-CHO(在0.9%(w/v)下对于任何配对p<0.01)。醛修饰的聚合物也展现对巨噬细胞细胞活力的剂量依赖性作用(图18B)。在本实例中，未发现HA与纤维素衍生物之间细胞活力的差异。尽管某些浓度的化合物之间存在一些统计学差异，但总的来说各组之间的细胞活力类似。V、腐篪漠^嚴泣/大凝if游主激浙吝丝用1ml凝胶前体注射小鼠(n=4到6)。在接下来的三周里以预定时间间隔处死动物88以评定粘连形成(表12.3)。在所有20只动物中，仅1只在膀胱与其它内脏之间出现粘连。己知在粘连部位处存在疤痕和凝块，故认为所述粘连是由凝胶注射期间的直接创伤所引起。表12.3.在小鼠中腹膜内注射水凝胶后的粘连水凝胶HAXHA-CMCHA-HPMCHA匿MC无法测定腹腔中残余凝胶的量。肉眼检査时，看起来注射HA-MC的动物中水凝胶残余量比其它动物中的多得多(图19)。3周后，HAX完全消失，且发现呈离散凝胶的较少体积的HA-HPMC。HA-CMC仅以覆盖内脏的薄层保持。所有样本的腹膜和内脏组织学正常。層纖舰银通过擦伤盲肠和切开一段相邻腹壁在兔中诱发粘连(表12.4)。在对照动物中，施用生理盐水作代替。生理盐水组中的所有动物在较大区域内发展粘连(图19B)。在经HA-CMC(p=O.OOU)、HA-MC(p<0.0001)禾口HA匿HPMC(p<0.0001)治疗的组中'粘连的面积极大减少。对于所述参数，各凝胶之间不存在统计学显著的差异。粘连得分降低的统计学差异仅出现于HA-MC(p=0.023)(图19C)。应注意'在经HA-HPMC治疗的兔中，2个3分粘连是形成于腹部中线的切线上(即，施用凝胶的区域的外部)。已在别处描述HAX对于预防腹膜粘连的效用(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley,C);贝拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito，T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R,(Langer,R.);克汉D.(Kohane,D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"w"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705)。表12.4.水凝胶对于预防兔中腹膜粘连的效用<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>AndSterility)1992;57(1):199-201，其以引用的方式并入本文中)。这些装置与本发明的装置在交联化学、所述交联所释放的分子(适福@释放碳化二亚胺，而本文所述的材料释放水)和物质组成方面存在差异。然而，最显著的差异在于这些材料必须以固体薄片的形式施用，而本文所提供的调配物是在不使用交联剂的情况下原位胶凝形成。就易于施用性、可施用水凝胶的装置的类型和可能的可治疗的表面的类型来说，原位交联水凝胶具有优于常规障壁装置的益处。本文所提供的材料具有多种物理化学特性。使用纤维素衍生物的酰肼形式(而非HA-ADH)将例如通过使所得凝胶甚至对酶促水解更具抗性来进一步影响特性。还注意到纤维素衍生物与透明质酸之间的成本存在显著差异。在本文所测试的凝胶中，HA-MC凝胶对于预防腹膜粘连最有效。这可与HA-MC在活体外于透明质酸酶(一种存在于腹膜中的酶)中降解比HA-CMC和HAX慢且因此具有更为延长的障壁作用的事实相关。各种水凝胶预防粘连的效用的差异可归因于未知的内在生物活性的差异，这与HA的情形相同。可通过进一步优化凝胶的物理化学特性来改变预防粘连的效用。已检査水凝胶的物理化学特性，包括胶凝时间、机械强度、含水量、膨胀动力学和降解动力学。这些特性相互关联，且在很大程度上取决于预聚合物的特性，诸如粘性、电荷、构型、溶解度、修饰程度、溶液中的浓度、混合便利性等。各种聚合物之间性能的差异可能是由这些参数引起，但我们的结果并未使我们辨出所述机制。已知膨胀比、聚合物浓度与剪切模量之间的关系(安西斯K.S.(Anseth，K.S.);鲍曼C.N.(Bowman,C.N.);博努派普斯L.(BrannonPeppas,L.),水凝胶和其实验测定的机械特性(Mechanicalpropertiesofhydrogelsandtheirexperimentaldetermination.)生物材料(Biomaterials)1996,17(17):1647-1657;派普斯N.A.(Peppas，N.A.);麦瑞尔E.W.(Merrill,E.W.)，作为膨胀弹性网络的交联聚乙烯醇水凝胶(CrosslinkedPolyvinyl-Alcohol)HydrogelsAsSwollenElasticNetworks.)应用聚合物科学杂志(JApplPolymSci)1977;21(7):1763-1770，所述文献各自以引用的方式并入本文中)，上文所研究的物理化学特性表明HA-HPMC和HA-MC的交联程度可能比HAX和HA-CMC高。较高的交联密度可能部分是由MC-CHO和HPMC-CHO不带负电以致酰肼聚合物与醛聚合物之间的静电排斥小于利用HA-CHO禾QCMC-CHO的事实引起。这一解释与HA-MC和HA-HPMC比HA-CMC胶凝快相符。结论91本文所述的HA与纤维素衍生物的杂化水凝胶可经由双管注射器施用且迅速交联，表明在开腹手术和腹腔镜检查的临床环境中的易于施用性。尽管醛修饰的纤维素衍生物在活体外展现某种细胞毒性，但在鼠科腹膜中存在良好的生物相容性。这些调配物对于预防兔盲肠损伤-侧壁缺损模型的腹膜粘连有效。舒微雄離贿褒靜基嚴妙教鹏射微胆腹膜粘连是腹部和盆腔手术所引起的严重的后果，且可引起严重疼痛、肠梗阻和不孕。由混合两种聚合物形成的原位交联凝胶易于施用于腹膜且可极为有效。诸如透明质酸(HA)、经氧化纤维素和纤维素衍生物等生物材料在腹膜内已展现优良的生物相容性。葡聚糖为用于原位可交联基质的另一种引人注目的基础材料。葡聚糖(DX)为葡萄糖部分主要由a-l,6-键联连接的多糖。临床上已使用40kDa和70kDa葡聚糖预防血管阻塞、作为血浆增容剂和用于抗凝疗法。已证实葡聚糖在腹膜内具有生物相容性。20世纪八十年代，临床上使用70kDa葡聚糖的32%溶液来预防腹膜粘连，但由于同时存在成功和不成功的临床试验，故已停止使用葡聚糖。在本研究中，合成新颖葡聚糖基可注射水凝胶来预防腹膜粘连。在室温下，使经酰肼基修饰的羧甲基葡聚糖(CMDX)(CMDX-ADH)与经醛基修饰的DX或CMC(DX-CHO或CMC-CHO)交联。在活体外表征所得水凝胶，研究预聚合物对于细胞培养物的细胞毒性和其对于预防兔侧壁缺损-肠擦伤模型中腹膜粘连的效用。材料与方法^^激/〃/大/凝廋游会成试.70kDa(产品编号D4751)、500kDa(产品编号D1037)和2MDa(产品编号D5376)来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroide)的葡聚糖、CMC(产品编号C4888)、己二酸二酰肼(ADH)、l-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳化二亚胺(EDC)、羟基苯并三唑(HOBt)、高碘酸钠、乙二醇、肼基甲酸叔丁酯(t-BC)、氯乙酸、氢氧化钠、氯化钠和盐酸都购自西格玛-阿尔德里奇公司。麥伊基薪覆薪《MZ);^游劍吝，利用前述方法将70kDa和500kDa葡聚糖修饰成羧甲基葡聚糖(CMDX)[应的论文(Ying'spaper)和生物连结物(Bioconjugate)1997]。简单来说，将10g葡聚糖溶解于100ml蒸馏水中整夜，且随后添加24.0g氢氧化钠和30.2g氯乙酸。使溶液在70。C下回流145min，利用6N盐酸将其迅速中和到pH=7.0，对蒸馏水透析3天且随后冻干。产率为75-80%。/3二麼二膽屏遂伊基脔康瀞"MDX-AZ)T^游劍备..以与如先前所报导的己二酸二酰肼透明质酸相同的方案将70kDa和500kDaCMDX修饰成己二酸二酰肼CMDX(CMDX-ADH)。,薪覆教做-C7/6U浙麥伊基勞鍾"MC-C7/C^将2MDaDX、70kDaDX禾卩CMC分另ij修饰成酸70kDaDX(70kDaDX-CHO)、2MDaDX(2MDaDX匿CHO)和醛CMC(CMC-CHO)。方案与先前报导相同。MI^M^^J吏用双管注射器(百特公司(Baxter),伊利诺伊斯州迪尔费德(Deerfield,IL))将2wt%CMDX匿ADHPBS缓冲溶液禾口2wt呢醛聚合物(诸如DX-CHO和CMC-CHO)PBS缓冲溶液注射到夹于两个载片之间的橡胶模具中。所制备的水凝胶的直径和厚度分别为1.2cm和3.5mm。这些圆盘水凝胶分别称为CMDX-DX和CMDX-CMC。-贅会敛,水凝l游表,褒会欽游表g:使用'H-NMR(瓦里安技术公司(Varian):优尼提300型分光光度计(Unity300spectrophotometer))光谱分析确定合成。测量D20中的10mg/mlCMDX、CMDX-ADH、DX-CHO禾卩CMC-CHCL接下来，将10倍摩尔过量的t-BC添加到纯水中的DX-CHO和CMC-CHO多糖中，且使醛基与t-BC反应。在对水透析且冻干后，在D20中测量经反应的聚合物的'H-NMR光谱。执行元素分析以测定元素组成。在制备各聚合物的KBr片后测量CMDX、CMDX-ADH、DX-CHO和CMC-CHO的FT-IR光谱。对CMDX-ADH执行元素分析。/7t凝i游表^'通过所报导的方案测量胶凝时间。在皮氏培养盘上使用康宁PC-320型热板/搅拌器以155rpm使用搅拌棒搅拌下，将0.1mlDX-CHO或CMC-CHO水溶液添加到0.1mlCMDX-ADH水溶液中。将溶液混合物变为水凝胶小球的时间测量5次。37'C下在PBS缓冲液中以重量分析方式测量所制备的圆盘凝胶膨胀的时程。在PBS缓冲液中浸泡5天后测量胶凝后水凝胶的重量Ws。Ws与刚好胶凝后水凝胶的初始重量Wi的膨胀比Q是以Q-Ws/Wi计算，且绘制水凝胶的图。潘應毒丝分浙使用人类间皮细胞系(CRL-9444:ATCC)和巨噬细胞细胞系J774.A1(TIB-67:ATCC)通过MTT分析(普洛麦格公司(Promega))研究在存在DX、CMC、CMDX-ADH、DX-CHO和CMC-CHO的情况下的活体外细胞活力。方案与先前报导[HA-CMC论文]相同。简单来说，37。C下于5呢C02中，使间皮细胞在完全生长培养基(具有伊尔氏BSS(Earle'sBSS)、0.75mML-谷氨酰胺和1.25g/L碳酸氢钠且补充有3.3nM表皮生长因子、400nM氢化可的松、870nM胰岛素、20mMHEPES禾B10免胎牛血清的培养基199)中生长并维持。使巨噬细胞在具有10%胎牛血清的DMEM(Gibco目录号10569-010)中生长和维持。添加材料后，在间皮细胞中第3天时或在巨噬细胞中第2天时，执行MTT分析。只有DX-CHO扰乱MTT分析，因此在刚好开始分析前利用新鲜培养基替换培养基。通过对照实验(未向细胞中添加材料)使所述值标准化。射凝做餅V、雄尉方案与先前方法相同。(佛克K(FalkK)，布杰奎斯特P(BjorquistP)，斯托姆奎斯特M(StromqvistM)，霍姆达尔L.(HolmdahlL.)通过抑制1型纤溶酶原活化剂抑帝ll齐廿来减少试验性粘连形成(Reductionofexperimentaladhesionformationbyinhibitionofplasminogenactivatorinhibitortype1.)英国手术杂志(BritishJournalofSurgery)2001;88:286-289，其以引用的方式并入本文中)。重约25g的SV129小鼠购自塔科尼克公司(Taconic)(纽约哈德孙(Hudson,NY))，且使用双管注射器(百特公司(Baxter),伊利诺伊斯州迪尔费德(Deerfield，IL))经由留置针将由0.5mlCMDX-ADH(5%w/v)和0.5mlDX-CHO(2%w/v)构成的1.0mlCMDX-DX凝胶注射到腹膜中。注射后2周对小鼠实施剖腹术。解剖者对各小鼠注射何种水凝胶未知。由解剖者评定粘连的存在。遞^^激垄欽嚴羼,侈#麥伊仿蘑,搭遂游茨,方案与先前方法相同。参看实例12。将雌性白化兔(西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus);新西兰白(NewZealandWhite),科文斯公司(Covance)，宾夕法尼亚州黑泽尔顿(Hazleton,PA))(3士0.5kg)用作模型动物。将12只动物随机分配到以下实验组(i)70kDa-CMDX-DX凝胶(n=4)、(ii)70kDa-CMDX-CMC凝胶(n=4)和(iii)500kDa-CMDX-CMC凝胶(n=4)各10ml。利用右侧腹壁上的3x4cm缺损和盲肠7个袋的80-160下的擦伤来诱发腹膜粘连。将凝胶前体溶液(5mlCMDX-ADH(对于70kDa-CMDX-ADH为50mg/ml或对于500kDa-CMDX-ADH为40mg/ml)禾口5mlDX-CHO(25mg/ml)或CMC匿CHO(60mg/ml))放入与百特双阀施用器(Baxterdualvalveapplicator)相连的10ml独立无菌注射器中，并通过15号针共挤出。程序后1周，对动物实施安乐死。如下对粘连评分0分=无粘连，1分=利用重力将会分离的组织粘附；2分=可通过钝器解剖分离的组织粘附；3分=需要利器解剖的粘连。将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林中，并用苏木素和伊红染色以供组织学检查。统^/"学分桥主要通过学生t检验分析数据。在t检验之前执行ANOVA。对各水凝94胶与对照之间的粘连得分进行威尔科克逊秩和检验(Wilcoxonrank-sumtest)。如下分配类别变量0分=1,1分=2，2分=3且3分=4。利用卡雷达格拉夫@(KaleidaGraph⑧)(斯尼吉软件公司(SynergySoftware))进行所有统计检验。p值<0.05被认为是统计学显著的。结果CMDX、CM肌AD仏肌C7ZO/〃CMC-CHO游#成#〃表&通过FT-IR(图23)和'HNMR(图24)确定CMDX、CMDX-ADH的合成。两种葡聚糖(70kDa和500kDa)的结果相同。FTIR时，如图23中所示，葡聚糖在1650cnT'[利诺的论文(Lino'spaper)]时具有吸光度峰值。通过在1608cm"时显现新的峰(反映羧基的C:O伸长)来确定CMDX的修饰。另外通过1664cm—'时的新峰(反映酰胺基的C=0伸长)来显示对CMDX-ADH的修饰。葡聚糖在低于3.0ppm和高于5.2ppm的区域内无NMR峰。在CMDX中，新峰出现于5.13ppm。在CMDX-ADH中，新峰出现于2.09和2.32ppm(双重峰，4H，N-(CH2)-C)和1.60ppm(单重峰，4H，C-(CH2)-C)。通过CMDX-ADH的元素分析，碳、氢和氮的重量百分比分别为70kDaCMDX-ADH中的44.4%、6.6%和9.9%以及500kDaCMDX-ADH中的44,7%、6.3%和9.7%。由氮与碳的比率估计己二酸二酰肼对CMDX-ADH的修饰程度为70kDaCMDX-ADH中的46%和500kDaCMDX-ADH中的44%。DX-CHO的FT-IR和NMR分析结果与先前公开的数据相同，确定合成。如所报导，产生CMC-CHO并加以表征。嚴泣/大凝,必^体獰性所有水凝胶的胶凝时间都为浓度依赖性的(图25)，因此所有水凝胶都可在较高浓度的醛修饰预聚合物和酰肼修饰预聚合物下获得快速胶凝时间。在各浓度下，CMDX-DX凝胶的胶凝时间都比CMDX-CMC凝胶短(图25)。CMDX-DX凝胶在胶凝后收縮，而CMDX-CMC在胶凝后膨胀，因此例如70kDa-CMDX-CMC(5%/6%)的膨胀体积比CMDX-DX(5%/6%)高3倍(图26)。水凝胶的物理外观极为不同(图26B):CMDX-DX呈浅黄色且略显不透明，而70kDa-CMDX-CMC透明且澄清。500kDa-CMDX-CMC(5%/6%)的膨胀介于70kDa-CMDX-CMC与CMDX-DX膨胀的中间。话伴//分^^嚴泣水凝履游主激浙吝丝未经修饰的原材料在细胞培养物中展现最小细胞毒性，但某些修饰会影响细胞活力。在存在多种浓度未交联预聚合物CMDX-ADH、DX-CHO和CMC-CHO的情况下培养间皮细胞(图28A)。CMDX-ADH和CMC-CHO展现轻度剂量依赖性毒性，而DX-CHO的毒性则高得多。巨噬细胞中的细胞毒性作用的总模式类似(图28B)。葡聚糖的醛衍生物细胞毒性极强，CMC-CHO也是如此。70kDa-和500kDa-CMDX-ADH即使在高浓度下对巨噬细胞活力也无影响。所有浓度下的未经修饰的CMC和DX可增加细胞活力。由关于两种细胞系的MTT分析可知，CMDX-ADH生物相容性极佳，且也可预期其水凝胶在腹膜内的生物相容性也极强。嚴泣^凝,必嚴,搭遂茨,劝^经CMDX-DX治疗的所有4只兔发展粘连，并且粘连面积大于对照实验(p=0.0027，表13.1，图30A-l)。在腹膜内发现分离凝块形式的水凝胶碎片，有时其被截留于粘连内。因此，尽管此凝胶存在于损伤部位处，但其不充当障壁。如在膨胀测试中所观察，凝胶碎片呈浅黄色且稳固。其稳固地粘附于组织(图30A-2),与己研究的其它原位交联凝胶不同。表13.170kDa-CMDX-DX70kDa-CMDX-CMC500kDa-CMDX-CMC对照(生理盐水)重量改变％-6.5±3.6-2.8±2.6-8.4±3.3-11.7±2.43分41132分00011分0100无粘连0230中值粘连得分30.503粘连面积(cm:2)18.3±0.90.8±1.50.0±0.113.1±1.9材料残余物4/44/44/4-相比之下，发现70kDa-和500kDa-CMDX-CMC散布于整个腹膜中，但有时部分以邻近块状物的形式保持，如图9B中所示。材料的浅红色泽是由血液污染所引起(图30C-2)。与对照相比，两种水凝胶都引起粘连形成面积的明显减小(表1，图30B、C-l)(对于70kDa-禾卩500kDa-CMDX-CMC，p<0.0001)。两组CMDX-CMC的中值粘连得分比未经治疗对照或CMDX-DX凝胶中任一者的得分小得多，但样本尺寸太小而无法展现统计学显著性。所汇集的来自两个CMDX-CMC96组的数据的比较得到0.009的p值。两组CMDX-CMC的中值粘连得分类似且不存在统计学显著的差异。组织学分析时，CMDX-DX凝胶有力地粘附于正常和受损盲肠表面(图30A)，且发炎细胞明显浸润于下层结缔组织中的(图30B)。而相比之下，经CMDX-CMC治疗的动物中回收的间皮(图30C)具有极大增厚的结缔组织下层(图30D)。CMm:-DX/微離謝禱CMDX-DX无法预防粘连可归因于预防粘连的功效的缺乏或归因于引起粘连的直接作用。为评定材料本身是否有害，通过双管注射器经腹膜内注射给与4只小鼠CMDX-ADH禾QDH-CHO，从而于原位形成CMDX-DX。注射后2周，处死动物且检査其腹腔。CMDX-DX不会引起腹膜粘连但在稳固地粘附于组织上的稳固浅黄色凝块中发现(图29)。讨论葡聚糖具有极高生物相容性且为适于腹膜应用的低成本材料。本文中合成两种无需低分子量交联剂即可形成的葡聚糖基水凝胶。尽管二者共有CMDX-ADH部分，但其具有截然不同的特性。CMDX-DX的胶凝时间比CMDX-CMC的胶凝时间短得多。对于此差异存在若干可能的原因，包括粘度、酰肼或醛的修饰程度等，但主要原因可能为葡聚糖与CMC之间水溶性的差异。因为在先前的研究中，3wt/vol%500kDa-CMDX-CMC凝胶的胶凝时间极慢，如65.8±5.0sec;而2wt/vol%490kDa-HA(透明质酸)-CMC凝胶的胶凝时间极快，如18.5±1.7sec。HA-ADH和CMDX-ADH的修饰程度和分子量几乎相同，因此DX和CMC的溶解度极弱。另一方面，由于CMDX-ADH和DX-CHO是由相同DX合成，故CMDX-DX凝胶的胶凝时间极快。具有相同聚合物主链的聚合物能容易地相互混合。胶凝后，CMDX-DX收缩而CMDX-CMC膨胀。这可通过CMC-CHO负电荷之间的静电排斥而DX-CHO不带电荷来解释。两种材料预防腹膜粘连的性能存在显著不同。CMDX-DX使粘连加重，而CMDX-CMC预防粘连。如活体外所示的DX-CHO的细胞毒性可能会引起其预防粘连的功效缺乏。然而，所述毒性是经历2天(在巨噬细胞的情况下)或3天(对于间皮细胞)的暴露出现。由此不能断定交联(花费数秒)后将存在足够高的游离CMDX-DX含量引起组织损伤。交联材料本身可有害。尽管通过用作障壁装置的原位交联水凝胶已实现巨大成功，但其降解时间相对短暂，尤其基于透明质酸的水凝胶更是如此。然而，障壁装置保持在原位以避免粘连形成所需的时间长度尚未知。在此情况下，可证实CMDX-DX的优势在于尸检时可发现大量残余材料，表明具有缓慢的降解动力学。此缓慢降解可能归因于相对高的聚合物浓度、相对低的膨胀体积以及降解葡聚糖的葡聚糖酶基本上只位于肝脏中的事实。结论酰肼修饰的羧甲基葡聚糖与醛修饰的羧甲基纤维素的交联水凝胶展现预防腹膜粘连的功效。这些凝胶的缓慢的降解速率和低成本表明其在预防腹膜粘连方面可能的作用。遂欲處度与邀蕃;^松游嚴泣^^r就遂潜^凝,游裙炎^丝引言手术后腹膜粘连可引起疼痛、肠梗阻和不孕(迪泽佳G.S.(DiZerega,G.S.)，腹膜手术(PeritonealSurgery.),斯普林格(NewYork:Springer)纽约，1999;其以引用的方式并入本文中)。已使用多种多糖基水凝胶障壁系统来预防粘连，且取得不同程度的成功(迪泽佳G.S.(DiZerega,G.S.)'腹膜手术(PeritonealSurgery.)斯普林格(NewYork:Springer)纽约，1999;其以引用的方式并入本文中)。由原位交联形成的水凝胶可潜在用作障壁(琼斯D.B.(Johns,D.B.)，罗杰斯K.E.(Rodgers,K.E.)，唐纳休W.D.(Donahue,W.D.)，科尔普斯T.C(Kiorpes,T.C)和迪泽佳GS.(diZerega，G.S.)通过术后投与离子交联透明质酸减少粘连幵乡成(Reductionofadhesionformationbypostoperativeadministrationofionicallycross-linkedhyaluronicacid.)生育与不育(FertilityAndSterility)68(1997)37-42，其以引用的方式并入本文中)，(李H.(Li，H.)，刘Y.C(Liu,Y.C)，舒X.Z.(Shu,X.Z.)'格雷S.D.(Gray,S.D.)和普里斯维奇G.D.(Prestwich,G.D.)交联透明质素-丝裂霉素C水凝胶的合成和生物评估(Synthesisandbiologicalevaluationofacross-linkedhyaluronan-mitomycinChydrogel.)生物大分子(Biomac讓olecules)5(2004)895-亂其以引用的方式并入本文中)，(刘Y.C(Liu，Y.C)，李H.(Li,H.)，舒X.Z.(Shu，X.Z.)，格雷S.D.(Gray,S.D.)和普里斯维奇G.D.(Prestwich,G.D.)含有丝裂霉素C的交联透明质素水凝胶减少术后腹部粘连(CrosslinkedhyaluronanhydrogelscontainingmitomycinCreducepostoperativeabdominaladhesions.)生育与不育(FertilityAndSterility)83(2005)1275-1283，其以引用的方式并入本文中)'(欧S.H.(Oh，S.H.)，金姆J.K.(Kim,J.K.)，宋K.S.(Song,K.S.)，诺河S.M.(Noh，S.M.)，基尔S.H.(Ghil,S.H.)，优可S.H.(Yuk,S.H.)和李J.H.(Lee,J.H.)通过具有溶胶-凝胶转变行为的载有消炎药物的普流尼克混合物预防术后组织粘连(Preventionofpostsurgicaltissueadhesionbyanti-inflammatorydrug-loadedpluronic98mixtureswithsol-geltransitionbehavior.)生物医学材料研究杂志A(JBiomedMaterResA)72(2005)306-16，其以引用的方式并入本文中)，(依欧Y.(Yeo,Y.)，海雷C(Highley,C)，波拉斯E.(Bellas,E.),埃托T.(Ito，T,),玛瑞尼R.(Marini,R.),朗格R.(Langer，R.)和克汉D.(Kohane,D.)原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)27(2006)4698-4705，其以引用的方式并入本文中)，且可比预成型薄片更易于施用。具体来说，通常将透明质酸(HA)衍生物用于腹膜中。已将添加或未添加药物的原位化学修饰的HA水凝胶用于此目的(琼斯D.B.(Johns,D.B.)，罗杰斯K.E.(Rodgers，K.E.)，唐纳休W.D.(Donahue,W.D.)，科尔普斯T.C(Kiorpes，T.C)和迪泽佳G.S.(diZerega,G.S.)通过术后投与离子交联透明质酸减少粘连形成(Reductionofadhesionformationbypostoperativeadministrationofionicallycross-linkedhyaluronicacid.)生育与不育(FertilityAndSterility)68(1997)37-42，其以引用的方式并入本文中)，(李H.(Li，H.)，刘Y.C(Liu,Y.C)，舒X.Z.(Shu，X.Z.)，格雷S.D.(Gray,S.D.)和普里斯维奇G.D.(Prestwich,G.D.)交联透明质素-丝裂霉素C水凝胶的合成和生物评估(Synthesisandbiologicalevaluationofacross-linkedhyal訓腿-mitomycinChydrogel.)生物大分子(Biomacromolecules)5(2004)895-902，其以引用的方式并入本文中)，(刘Y.C(Liu,Y.C)，李H.(Li,H.)，舒X.Z.(Shu，X.Z.)，格雷S.D.(Gray,S.D.)和普里斯维奇G.D.(Prestwich,G.D.)含有丝裂霉素C的交联透明质素水凝胶减少术后腹部粘连(Crosslinkedhyaluro腿hydrogelscontainingmitomycinCreducepostoperativeabdominaladhesions.)生育与不育(FertilityAndSterility)831275-1283，其以引用的方式并入本文中)，(依欧Y.(Yeo,Y.)，海雷C(Highley，C)，波拉斯E.(Bellas,E.)，埃托T,(Ito,T.)，玛瑞尼R.(Marini,R.)，朗格R.(Langer，R.)和克汉D.(Kohane,D.)原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)274698-4705，其以引用的方式并入本文中)。近来，已证实由透明质素交联醛-和酰肼修饰的HA构成的原位可交联水凝胶(布尔皮特P.(Bulpitt，P.)和艾斯奇曼D.(Aeschlimann，D.)，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学木才茅斗石开究杂'志(JournalOfBiomedicalMaterialsResearch)47(1999)152-169，其以引用的方式并入本文中)；(贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera，R.);朗格R.(Langer,R.)和克汉D.S.(Kohane,D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!'cross-linkedhyaluronicacid.)生物材茅斗(Biomaterials)25(2004)4797-4804，其以引用的方式并入本文中)对于预防兔侧壁缺损-盲肠擦伤模型中的腹膜粘连有效(依欧Y.(Yeo，Y.)，海雷C(Highley，C)，波拉斯E.(Bellas,E,)，埃托T.(Ito，T,)，玛瑞尼R.(Marini，R.)，朗格R.(Langer，R.)和克汉D.(Kohane,D.)原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中术后腹部粘连(hcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)27(2006)4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。大部分所述装置都利用所述装置在愈合期间充当分离受损表面的生物可相容障壁的能力。在本文中，已对水凝胶加以修饰以直接解决粘连形成的病理生理异常。据悉，发炎会促使形成腹膜粘连。除发炎本身的潜在组织破坏作用外，发炎细胞释放诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-1和6(IL-1和6)等细胞因子。这些细胞因子诱导间皮细胞产生纤溶酶原活化剂抑制剂-1和2(PAI-1和PAI-2)，其降低纤溶酶原活化剂(PA)的活性，减缓纤维蛋白降解(沃维尔S.A.(Whawell,S.A.)，斯科特柯伯姆D.M.(Scottcoombes,D.M.)，威庞德M.N.(Vipond，M.N.)，泰伯特S.J.(Tebbutt，S.J.)和辛普森J.N.(Thompsons.N.)肿瘤坏死因子介导的人类腹膜间皮细胞释放纤溶酶原活化齐廿和J制齐iJ-l(TumorNecrosisFactor-MediatedReleaseOfPlasminogen-AcUvatorInhibitor-1ByHumanPeritonealMesothelialCells.)英国手术杂志(BritishJournalOfSurgery)81(1994)214-216，其以引用的方式并入本文中)，(沃维尔S.A.(Whawell，S.A.)和辛普森J.N.(Thompson,J.N.)细胞因子诱导的人类间皮细胞释放纤溶酶原活化齐柳制齐U-l(Cytokine-InducedReleaseOfPlasminogen-ActivatorInhibitor-1ByHumanMesothelialCells.)欧洲手术杂志(EuropeanJournaOfSurgery)161(1995)315-318,其以引用的方式并入本文中)，(维因斯伯格V.W.M.(Vanhinsbergh,V.W.M.)，波尔K.A.(Bauer,K.A.)，克尼斯塔T.(Kooistra，T.)，克拉夫特C(Kluft,C)，多杰沃德G.(Dooijewaard,G.),希尔曼M.L.(She函n,M.L.)和纽文辉文W.(Nieuwenhuizen,W.)人类中肿瘤坏死因子融合期间纤维蛋白溶解的进展-组织型纤溶酶原活化剂、1型纤溶酶原活化剂抑制剂和纤维蛋白(原)降解产物的伴随增加(ProgressOfFibrinolysisDuringTumor-Necrosis-FactorInfusionsInHumans-ConcomitantIncreaseInTissue-TypePlasminogen-Activator,Plasminogen-ActivatorInhibitorType-l，AndFibrin(Ogen)DegradationProducts.)血液学(Blood)76(1990)2284-2289，其以引用的方式并入本文中)，(穆勒基I.K.(Mullarky,I.K.),斯达贝F.M.(Szaba,F.M.)，伯格伦K.N.(Berggren,K.N.)，库姆尔L.W.(Kummer,L.W.),维尔海姆L.B.(Wilhelm，L.B.)，帕伦特M.A.(Parent,M.A.)，约翰逊L.L.(Johnson,L丄)和斯密雷S.T.(Smiley,S.T.)月中瘤坏死因子a和Y干扰素而非出血或病原体负荷指示感染期间预防性纤维蛋白沉积的水平(Tumornecrosisfactoralphaandgammainterferon,butnothemorrhageorpathogenburden,dictatelevelsofprotectivefibrindepositionduringinfection.)感染与免疫学(InfectionAndImmunity)74(2006)1181-1188，其以引用的方式并入本文中)，(穆勒基I.K.(Mullarky,I.K.)，斯达贝F.M.(Szaba，F.M.)，伯格伦K.N.(Berggren,K.N.)，库姆尔L.W.(Kummer，L.W.),维尔海姆L.B.(Wilhelm,L.B.)，帕伦特M.A.(Parent,M.A.),约翰逊L.L.(Johnson,L.L.)和斯密雷S.T.(Smiley，S.T.)肿瘤坏死因子a和Y干扰素而非出血或病原体负荷指示感染期间预防性纤维蛋白沉积的水平(Tumornecrosisfactoralphaandgammainterferon,butnothemorrhageorpathogenburden,dictatelevelsofprotectivefibrindepositionduringinfection.)感染与免疫学(InfectionAndImmunity)74(2006)1181-1188)。这些过程可促进粘连形成。促炎性细胞因子释放的减少可增强对腹膜粘连的预防。为此，若干研究人员已测试消炎药物对腹膜粘连的效用，包括非甾体消炎药(NSAID),诸如布洛芬(欧S.H.(Oh，S.H,)，金姆J.K.(Kim,J.K,)，宋K.S.(Song,K.S.),诺河S.M.(Noh，S.M.)，基尔S.H.(Ghil,S.H.)，优可S.H.(Yuk,S.H.)和李J.H.(Lee,J.H.)通过具有溶胶-凝胶转变行为的载有消炎药物的普流尼克混合物预防术后组织粘连(Preventionofpostsurgicaltissueadhesionbyanti-inflammatorydrug-loadedpluronicmixtureswithsol-geltransitionbehavior.)生物医学研究杂志A(JBiomedMaterResA)72(2005)306-16，其以引用的方式并入本文中)，(本特曼B.G.(Bateman,B.G.)，纽雷W.C，Jr.(Nunley，W.C，Jr.)和柯奇因J.D.(Kitchin，J.D.)，第3版，利用布洛芬予页防术后腹膜粘连(Preventionofpostoperativeperitonealadhesionswithibuprofen.)生育与不育(FertilSteril)38(1982)107-8，其以引用的方式并入本文中),(西村K.(Nishimura,K.)，中村R.M.(Nakamura，R.M.)和迪泽佳G.S.(diZerega,G.S,)术后创伤修复的生物化学评估利用布洛芬预防腹膜内粘连形成(Biochemicalevaluationofpostsurgicalwoundrepair:preventionofintraperitonealadhesionformationwithibuprofen.)手术研究杂志(JSurgRes)34(1983)219-26，其以引用的方式并入本文中)，(罗杰斯K.(Rodgers，K.)，吉尔吉斯W.(Girgis，W.)，迪泽佳G.S.(diZerega,G.S.)，布拉肯K.(Bracken,K.)和瑞琪L.(Richer,L.)通过含有非甾体消炎药的脂质体抑制术后粘连(Inhibitionofpostsurgicaladhesionsbycontainingnonsteroidalantiinflammatorydrugs.)国际生育杂志(IntJFertil)35(1990)315-20，其以引用的方式并入本文中)，(李戈兰德E.K.(LeGrand，E.K.)，罗杰斯K.E.(Rodgers，K,E.)，吉尔吉斯W.(Girgis，W.)，坎普洛J.D.(Campeau,J.D.)和迪泽佳G.S.(Dizerega，G.S.)兔粘连预防模型中非甾体消炎药和抗血检素齐U的功效比较(Comparativeefficacyofnonsteroidalanti-inflammatorydrugsandanti-thromboxaneagentsinarabbitadhesion-preventionmodel.)研究性手术杂志(JInvestSurg)8(1995)187-94，其以引用的方式并入本文中)，(李J.H.(Lee,J.H.)，高A.K.(Go,A.K.)，欧S.H.(Oh，S,H.)，李K.E.(Lee,K.E.)和优克S.H.(Yuk,S.H.)载有布洛芬的PLLA-PEG二嵌段共聚物薄膜的组织抗粘连潜力(Tissueanti-adhesionpotentialofibuprofen-loadedPLLA-PEGdiblockcopolymerfilms.)生物材茅斗(Biomaterials)26(2005)671-8，其以引用的方式并入本文中)；和糖皮质激素，诸如地塞米松(霍克尔M.(HockeI，M.)，欧特S.(Ott，S.)，希曼U.(Siemann，U.)和柯斯尔T.(Kissel,T.)利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)AnnalesChirurgiaeEtGynaecologiae76(1987)306-313，其以引用的方式并入本文中)'(布肯麦尔C.C.(Bucke麵ier,C.C.),普斯特雷A.E,(P歸teriA.E.)，哈雷斯R.A.(Harris,R.A.)禾口赫兹S.P.(Hetz,S.P.)使用目标大鼠模型比较抗粘连治疗(Comparisonofantiadhesivetreatmentsusinganobjectiveratmodel.)美国夕卜禾斗医生杂志(AmericanSurgeon)65(1999)274-282,其以引用的方式并入本文中)，(苦库克兹坎T.(Kucukozkan，T.)，尔索易B.(Ersoy，B.)，优格D.(Uygur,D.)和甘多度C.(Gundogdu，C.)盆腔手术后通过色甘酸钠、地塞米松、生理盐水和抑肽酶预防粘连(Preventionofadhesionsbysodiumchromoglycate,dexamethasone,salineandaprotininafterpelvicsurgery.)ANZ手术杂志(ANZJSurg)74(2004)1111-5，其以引用的方式并入本文中)。这些己并入基质材料中，所述基质材料诸如脂质体(罗杰斯K.(Rodgers,K.)，吉尔吉斯W.(Girgis，W.)，迪泽佳G.S.(diZerega,G.S.)，布拉肯K.(Bracken,K.)和瑞琪L.(Richer,L.)通过含有非甾体消炎药的脂质体抑制术后粘连(Inhibitionofpostsurgicaladhesionsby"pwwnwcontainingnonsteroidalantiinflammatorydrugs.)国际生育杂志(IntJFertil)35(1990)315-20，其以引用的方式并入本文中)、聚(L-乳酸)(PLLA)-聚乙二醇(PEG)二嵌段共聚物薄膜(李J.H.(Lee,J.H.),高A.K.(Go,A.K.)，欧S.H.(Oh，S.H.)，李K.E.(Lee,K.E.)和优克S.H.(Yuk,S.H.)载有布洛芬的PLLA-PEG二嵌段共聚物薄膜的组织抗粘连潜力(Tissueanti-adhesionpotentialofibuprofen-loadedPLLA-PEGdiblockcopolymerfilms.)生物材料(Biomaterials)26(2005)671-8，其以引用的方式并入本文中)、泊洛沙姆与藻酸盐水凝胶的混合物(欧S.H.(Oh，S.H.):金姆J.K.(Kim,J.K.);宋K.S.(Song,K.S.);诺禾口S.M.(Noh,S.M.);吉尔S.H.(Ghil,S.H.);优克S.H.(Yuk，S.H.)和李J.H.(Lee，J.H.)，利用溶胶-凝胶转变行为通过载有消炎药物的普流尼克混合物预防术后组织粘连(Preventionofpostsurgicaltissueadhesionbyanti-inflammatorydrug-loadedpluronicmixtureswithsol-geltransitionbehavior.)生物材料研究杂志AUBiomedMaterResA)72(2005)306-16，其以引用的方式并入本文中)和聚(乙交酯-共聚-丙交酯)(PLGA)微米颗粒(霍克尔M.(Hockel,M.)，沃特S.(Ott，S.),希尔曼U.(Siemann，U.)和奇塞尔T.(Kissel,T.)利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠中腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)(AnnalesChirurgiaeEtGynaecologiae)76(1987)306-313，其以引用的方式并入本文中)。已发现，水凝胶基系统在腹膜中的生物相容性通常比疏水聚合物装置(例如由PLGA构成的装置)强(伊欧Y.(Yeo,Y.);海利C(Highley，C);博拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito，T.);玛瑞尼R.(Marini,R.);朗格R.(Langer，R.)和克汉D.(Kohane，D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连&Mcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel,)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)，(克汉D.S.(Kohane，D.S.)，蒂斯J.Y.(Tse,J.Y.)，伊欧Y.(Yeo，Y.)，帕德拉R.(Padera,R.)，舒宾纳M.(Shubina，M.)和朗格R.(Langer，R.)用于腹膜内药物传递的生物可降解聚合微球体和纟内米球体(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)生物医学材料研究杂志第A部分(JournalOfBiomedicalMaterialsResearchPartA)77A(2006)351-361，其以引用的方式并入本文中)，但由于低分子量药物迅速扩散通过水凝胶基质，故具有快得多的释放动力学。一种控制此问题的方法为将小分子与水凝胶连结(马克罗德A.D.(McLeod，A.D.),托伦蒂诺L.(To〗entino，L.)和托泽尔T.N.(Tozer,T.N.)糖皮质激素-葡聚糖连结物作为结肠特异性传递的潜在前药-大鼠中的禾急态药物动力学(GIucocorticoid-DextranConjugatesAsPotentialProdrugsForColon-SpecificDelivery-Steady-StatePharmacokineticsInTheRat.)生物药物学与药物沉积(Biopharmaceutics&DrugDisposition)15(1994)151-161，其以引用的方式并入本文中)，(马克罗德A.D.(McLeod，A.D.),弗雷德D.R.(Friend,D.R.)和托泽尔T,N.(Tozer,103T.N.)糖皮质激素-葡聚糖连结物作为结肠特异性传递的潜在前药-水解大鼠胃肠道内容物(Glucocorticoid-DextranConjugatesAsPotentialProdrugsForColon-SpecificDelivery-HydrolysisInRatGastrointestinal-TractContents.)药物科学杂志(JournalOfPharmaceuticalSciences)83(1994)1284-1288，其以引用的方式并入本文中)，(周S,Y.(Zhou,S.Y.),梅Q.B.(Mei，Q.B.)，刘L.(Liu，L.)，郭X.(Guo，X.)，邱B.S.(Qiu,B.S.)，赵D.H.(Zhao，D.H.)和曹C.H.(Cho,C.H.)糖皮质激素连结物于大鼠胃肠道中的传递和其对于溃疡性结肠炎的治疗(Deliveryofglucocorticoidconjugateinratgastrointestinaltractanditstreatmentforulcerativecolitis.)中国药理学报(ActaPharmacologicaSinica)22(2001)761-764，其以引用的方式并入本文中)，(庞Y.N.(Pang，Y.N,)，张Y.(Zhang,Y.)和张Z.R.(Zhang,Z.R.)酶依赖性前药的合成和其用于结肠标耙的潜力的评估(Synthesisofanenzyme-dependentprodrugandevaluationofitspotentialforcolontargeting.)世界肠胃病学杂志(WorldJournalOfGastroenterology)8(2002)913-917，其以引用的方式并入本文中)，(珀亚尼T.(Pouyani，T.)和普雷斯特维奇G.D.(Prestwich,G.D.)透明质酸寡糖的官能化衍生物-药物载剂和新颖生物材料(FunctionalizedDerivativesofHyaluronic-AcidOligosaccharides-DrugCarriersandNovelBiomaterials.)生物连结物化学(BioconjugateChemistry)5(1994)339-347，其以引用的方式并入本文中)，(普雷斯特维奇(Prestwich)等人，透明质酸的受控化学修饰酰肼衍生物的合成、应用和生物降解(Controlledchemicalmodificationofhyaluronicacid:synthesis,applications,andbiodegradationofhydrazidederivatives.)控释杂志(JournalOfControlledRelease)53(1998)93-103,其以引用的方式并入本文中)，(雷洁思维奇(Rajewski)等人，聚合前药-透明质酸的氢化可的松酯的酶促和非酶促水解(EnzymaticAndNonenzymaticHydrolysisOfAPolymericProdrug-HydrocortisoneEstersOfHyaluronic-Acid.)国际制药学杂志(InternationalJournalOfPharmaceutics)82(1992)205-213，其以引用的方式并入本文屮)，(艾夫特(Everts)等人，使用E-选择素定向免疫连结物将地塞米松选择性细胞内传递到活性内皮细胞中(SelectiveintracellulardeliveryofdexamethasoneintoactivatedendothelialcellsusinganE-selectin-directedimmunoconjugate.)免疫学杂志(JournalOflmmunology)168(2002)883-889，其以引用的方式并入本文中)，(梅尔吉特(Melgert)等人，使地塞米松靶向库普弗细胞对大鼠肝炎禾0纤维化的影响(TargetingdexamethasonetoKupffercells:Effectsonliverinflammationandfibrosisinrats.)肝脏学(Hepatology)34(2001)719-728，其以引用的方式并入本文中)。这些连结物可控制释放动力学，但连结物聚合物本身可迅速从腹膜内清除。为解决水凝胶基质释放消炎药物和水凝胶扩散到腹膜外的问题，设计并合成组合原位交联特性和药物连结的水凝胶(波亚尼T.(Pouyani,T.)和普雷斯特维奇G.D.(PrestwichG.D.)透明质酸寡糖的官能化衍生物-药物载剂和新颖生物材料(FunctionalizedDerivativesofHyaluronic-AcidOligosaccharides-DrugCarriersandNovelBiomaterials.)生物连结化学(BioconjugateChemistry)5(1994)339-347，其以引用的方式并入本文中)。已制造出经由酯键联与有效合成糖皮质激素激动剂地塞米松连结并且还经酰肼基或醛基修饰从而使其能通过腙键与其它HA交联的HA。在本文中，表征这些材料并在活体外和活体内证实其消炎活性。材料与方法柳地塞米松、琥珀酸酐、乙醇、l-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、4-二甲基氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)、无水丙酮、二甲亚砜(DMSO)、己二酸二酰肼(ADH)、羟基苯并三唑(HOBt)、高碘酸钠、乙二醇、肼基甲酸叔丁酯、氯化钠、磷酸和钠都购自阿尔德里奇公司(Aldrich)。HA(Mw-490kDa或1.36MkDa)是购自基因酶公司。方兹透欲處凝-3二凝二激,^M-AZ)TO浙透剪處麼-,OM-ALZ)J游会成如所述执行合成(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型手术后腹部粘连("'fwcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)27(2006)4698-4705,其以引用的方式并入本文中)，(布尔皮特P.(BulpiU，R)等人，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学木才半斗石开究杂'志(JBiomedMaterRes)47(1999)152-169其以引用的方式并入本文中)，(贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G);帕德拉R.(Padera，R.);朗格R.(Langer，R.)和克汉D.S.(Kohane，D.S.)'通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadeby!'wcross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)25(2004)4797-4804，其以引用的方式并入本文中)。HA-ADH和HA-ALD分别是由1.36MDaHA和4卯kDaHA合成。邀塞^松-游必虔#必会成本程序是基于先前报导(庞Y.N,(Pang,Y.N.)，张Y.(Zhang,Y.)和张Z.R.(Zhang,Z.R.)酶依赖性前药的合成和其用于结肠标耙的潜力的评估(Synthesisofanenzyme-dependentprodrugandevaluationofitspotentialforcolontargeting.)世界肠胃病学杂志(WorldJournalOfGastroenterology)8(2002)913-917，其以引用的方式并入本文中)，(艾夫特(Everts),阔克R.J.(Kok,R.J,),埃斯基斯多特S.A.(Asgeirsdottir,S.A.)，迈尔吉特B.N.(Megert，B.N.),穆伦纳T.J.M.(Moolenaar，T.J.M.)，康宁G.A.(Koning,G,A.)，范路因M.J.A.(vanLuyn,M.J.A.)，梅吉尔D.K.R(Meijer，D.K.F.)和莫伦纳G.(Molema,G.)使用E-选择素定向免疫连结物将地塞米松选择性细胞内传递到活性内皮细胞中(SelectiveintracellulardeliveryofdexamethasoneintoactivatedendothelialcellsusinganE-selectin-directedimmunoconjugate.)免疫学杂志(JournalOfImmunology)168(2002)883-889，其以引用的方式并入本文中)。氮气下，将2.455g地塞米松(6.25mmol)、10.52g琥珀酸酐和0.795g4-二甲基氨基吡啶溶解于400ml无水丙酮中。室温下将溶液搅拌整夜。蒸发丙酮后，将白色晶体溶解于36ml乙醇中，随后逐渐添加84ml纯水。将溶液在4'C下保持2天，并且沉淀出白色针状晶体。将其过滤并且在减压下干燥。执行此再沉淀2次(产率90-95%)。,秀基jr劝教亚嚴邀塞苯松-游莉瀠盗^V/W-^x-d游#成本程序是基于先前报导(珀亚尼T.(Pouyani,T.)和普雷斯特维奇G.D.(Prestwich，G.D.)透明质酸寡糖的官能化衍生物-药物载剂和新颖生物材料(FunctionalizedDerivativesofHyaluronic—AcidOligosaccharides匿DrugCarriersandNovelBiomaterials.)生物连结物化学(BioconjugateChemistry)5(1994)339-347,其以引用的方式并入本文中)。将1.3930gdex-suc、0.3355gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)禾b0.6040mg二环己基碳化二亚胺(DCC)溶解于80ml丙酮中，且在室温下搅拌16小时，产生白色结晶沉淀。通过过滤回收晶体，蒸发去除丙酮并获得干燥的白色晶体，且不经进一步纯化即使用(产率90-95%)。透敏廣潔-5:潔二腐U齿塞,松-游劝麼益^M-dexJ游合成本程序是基于先前报导(珀亚尼T.(Pouyani，T.)和普雷斯特维奇G.D.(Prestwich,G.D.)透明质酸寡糖的官能化衍生物-药物载剂和新颖生物材料(FunctionalizedDerivativesofHyaluronic-AcidOligosaccharides-DrugCarriersandNovelBiomaterials.)生物连结物化学(BioconjugateChemistry)5(1994)339-347，其以引用的方式并入本文中)。将100mgHA-ADH溶解于13.33mlNaHC03缓冲液(pH=8.5)中。将125.8mgNHS-dex-suc溶解于26.67mlDMF(二甲基甲酰胺)中。经30分钟将NHS-dex-suc溶液倒入HA-ADH溶液并在室温下搅拌18小时。在300ml丙酮中使聚合物再沉淀，随后对水透析3天。将纯化产物冻干并随后于4'C下存储(产率70-80%)。厨盘/火凝應'^mx,/mx-z)0^游虔y吝制备HA-DEX与HA-ALD交联的圆盘水凝胶(HAX-DEX)。使用双管注射器(百特公司(Baxter),伊利诺伊斯州迪尔费德(Deerfield，IL))将HA-DEX禾QHA-ALD的2%(w/v)水溶液注射到夹于两个载片之间的橡胶模具中。所制备的水凝胶的直径和厚度分别为1.2cm和3.5mm。以相同方式制备HA-ADH与HA-ALD交联的圆盘水凝胶(HAX)。褒^激游表f将地塞米松和地塞米松-琥珀酸盐溶解于d6-DMSO中，并将HA-ADH和HA-DEX溶解于D20中，并通过'H-NMR光谱(瓦里安技术公司(Varian):优尼提300型分光光度计(Unity300spectrophotometer"分析。通过使用亚特兰蒂斯(Atlantis)dC18分析柱(dC18，4.6x250mm'粒径5pm)的高效液相色谱(安捷伦技术公司(Agilenttechnologies)1100系列)验证dex-suc、NHS-dex-suc、HA-ADH和HA-DEX的合成和纯度。流动相为乙腈与NaH2P04/H3P04缓冲液的混合物(60/40,pH3.8)。流速为1ml/min并且在246nm测量UV吸光度(惠普公司(HewlettPackard):G1314A)。如报导，在碱水解琥珀酸盐连接基后通过HPLC分析与HA偶联的地塞米松的量(艾夫特(Everts)等人，使用E-选择素定向免疫连结物将地塞米松选择性细胞内传递到活性内皮细胞中(SelectiveintracellulardeliveryofdexamethasoneintoactivatedendothelialcellsusinganE-selectin-directedimmunoconjugate.)免疫学杂志(JournalOflmmunology)168(2002)883-889，其以引用的方式并入本文中)。力微游藩如所报导测量胶凝时间(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley,C);博拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito，T.);玛瑞尼R.(Marini,R.);朗格R.(Langer，R,);克汉D.(Kohane,D.),原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)27(2006)4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。简单来说，在使用磁力棒搅拌下，将0.1ml27。(w/v)HA-ALD水溶液添加到0.1ml2%(w/v)HA-DEX或HA-ADH水溶液中，并测量混合物变为水凝胶小球的时间。利用流变仪(TA仪器公司AR1000(TAInstruments:AR1000),德拉华州纽卡斯特(Newcastle,Delaware))测量圆盘凝胶的剪切模量。如上文所述制备圆盘水凝胶，随后使其在PBS缓冲液(pH=7.4)中膨胀5天，并且以重量分析方式测量膨胀体积。以不同剪切应力执行蠕变和松弛测试。由应力与应变之间的线性关系的斜率计算剪切模量G。应力与应变之间的拟合线的R2值高于0.95。存力分界使用人类间皮细胞系(CRL-9444:ATCC)使用MTT分析(普洛麦格公司(Promega))测定在存在HA、HA-ADH、HA-ALD和HA-DEX的情况下活体外细胞活力。37'C下于5免C02中，使细胞在完全生长培养基(具有伊尔氏BSS(Earle'sBSS)、0.75mML匿谷氨酰胺和1.25g/L碳酸氢钠且补充有3.3nM表皮生长因子、400nM氢化可的松、870nM胰岛素、20mMHEPES和10%胎牛血清的培养基199)中生长并维持。将5xl(^个细胞放入24孔培养板的各孔中并在37'C下于5呢C02中培育整夜。将培养基用含有不同浓度HA、HA-ADH、HA-DEX或HA-ALD的培养基替换。添加这些材料后第3天，执行MTT分析。将100微升四氮唑盐溶液添加到各孔中且在37'C下培育4小时。使用lml清洁剂溶液将由活性线粒体产生的紫色甲臜溶解且随后在570nm通过板读数器(分子装置公司SpectraMax384型(MolecularDevices:SpectraMax384))测量。针对未将测试材料添加到培养基中的孔标准化吸光度值。邀塞术挖释及浙/MX-Z^X餘i^动力学如上文所述使用2%(w/v)凝胶前体溶液制备圆盘状HAX-DEX水凝胶。将圆盘状水凝胶浸泡于4mlDMEM(杜贝卡氏经修饰伊格氏培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium):GIBCO目录号10569-010)、具有0.5%BSA(牛血清白蛋白阿尔德里奇公司)的DMEM或具有10%FBS(胎牛血清GIBCO目录号10082-147)的DMEM中，且在37。C下培育8天。第l天、第2天、第3天和第5天时将培养基用新鲜培养基完全替换并在-8(TC存储，随后添加到细胞中。以重量分析方式测量HAX和HAX-DEX圆盘的降解时程。在若干时间点时测量水凝胶的重量Ws。将膨胀体积Q(%)以Q-Ws/Wi计算，其中Wi为水凝胶的初始重量。岩i^/、厨必嚴"'反,潘應游劍多C57/B16小鼠购自塔科尼克公司(纽约哈德孙(Hudson,NY))。将2ml3%(w/v)无菌硫代乙醇酸盐溶液(DIFCO实验仪器公司(DIFCOLaboratories),密歇根州底特律(Detroit,MI))注射到腹腔中。注射后4天，通过C02对小鼠实施安乐死并注射6ml冰冷的含有5mMEDTA的PBS缓冲液。在用镊子搅动腹膜后，吸出含有巨噬细胞的溶液。将细胞立即放入在冰上冰冷的DMEM中，随后洗涤，计数并涂板。获得每只小鼠约107个细胞。将含有10%(v/v)FBS的DMEM中的5xl(^个细胞添加到96孔培养板的各孔中并在37'C下于5呢C02中培育整夜。幼l多^激发游反凝潘應产主潘應历f通过用20微升/孔PBS缓冲液去除非粘附细胞。随后将100Ml具有10%FBS的DMEM和lOO)iil与水凝胶预培育的培养基(第2.2.9部分)或已知浓度的地塞米松添加到各孔中的粘附巨噬细胞中。在37。C下于5%C02中培育24小时后，将25900ng/mlLPS(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO)目录号L-4391)添加到各孔中以达100ng/ml的最终浓度。再培育16小时后，收集培养基并在-80'C下存储直到分析。通过ELISA(酶连免疫吸附剂分析)测量TNF-a、IL-6和地塞米松于所述培养基中的浓度。TNF-(x、IL-6和地塞米松的EUSA试剂盒分别购自R&D系统公司(多塞特(DuoSet)目录号DY406)、百利达公司(BioLegend)(小鼠IL-6ELISAMAXtm組(得拉斯(Deluxe))和尼奥吉有限公司(NeogenCorporation)。活伴^/实验依照麻省理工学院委员会(MassachusettsInstituteofTechnologyCommittee)关于动物护理所批准的方案，遵照有关实验室动物的护理和使用的NIH指导(NIH公告#85-23，1985年修订)护理动物。利用氧气中的2-3%异氟垸对重25-30g的雄性SV129小鼠实施麻醉。刮开背部中线且用70%异丙醇水溶液清洗。在背部中线中用双管注射器(一个注射器中有0.5mlHA-DEX，另一注射器中有0.5mlHA-ALD)经皮下注射1mlHAX-DEX。注射后2天，处死动物并使用标准技术处理组织以供组织学分析。统^学分析通过韦尔奇t检验(Welch'st-test)(各组之间具有不等方差的t检验)分析数据。为比较培养基在释放动力学测试中的作用，在韦尔奇t检验之前执行ANOVA。在具有相同培养基和凝胶的不同时间点之间的的比较中使用配对t检验。利用卡雷达格拉夫@(KaleidaGraph)(斯尼吉软件公司(SynergySoftware))进行所有统计检验。p值<0,05被认为是统计学显著的。结果覆^激nAD//,ft4掘w游表,所有材料都是根据图32中的方案合成。分别通过NMR光谱在4.48和4.70ppm到4.78和5.03ppm处地塞米松的21-亚甲基质子的化学位移来确定dex-suc的合成。此外，24-亚甲基和25-亚甲基质子的化学位109移出现在2.59ppm处。通过HPLC测量的地塞米松、dex-suc和NHD-dex-suc的洗脱时间分别为4.9min、5.5和7.9min。通过HPLC，地塞米松转化成dex-suc和NHS-dex-suc的效率分别为〉99%和96%。通过^-NMR光谱确定HA-ADH的合成；48.4%D-葡糖醛酸残基被ADH修饰(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利C(Highley,C);博拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini，R.);朗格R.(Langer,R.)和克汉D.(Kohane，D.)，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)27(2006)4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。这是由1.62ppm处ADH残基的甲基质子的峰的积分值与2.00ppm处N-乙酰基-D-葡糖胺残基的甲基质子的峰的积分值的比率计算得到。通过HPLC禾卩'H-NMR确定由HA-ADH合成HA-DEX。通过HPLC领J量，HA匿DEX在246nm下具有UV吸光度峰值，而HA-ADH则没有。HA-DEX的停留时间为3.0min。利用NMR光谱，通过2.63ppm处dex-琥珀酸盐中琥珀酸盐连接基的24-亚甲基和25-亚甲基质子的化学位移的出现也确定由HA-ADH合成HA-DEX。由2.63卯m处琥珀酸盐连接基的亚甲基质子的峰的积分值与2.00ppm处N-乙酰基-D-葡糖胺的甲基质子的峰的积分值的比率确定，13.1%D-葡糖醛酸残基与NHS-dex-suc的琥珀酸盐连接基反应。由此，计算得到35.3%(=48.4%-13.1%)ADH残基未经琥珀酸盐连接基修饰，且27%(=13.1%/48.4%)HA-ADH残基与NHS-dex-suc反应。初步研究证实，此HA-地塞米松产物在较短时间段内释放大部分地塞米松，由于化合物具有高效力，故此在生物上是不合需要的。此外，利用一些聚合物系统的经验(例如，聚(乳酸-共聚-乙醇酸)微球体(克汉D.S.(Koh纖，D.S.)，蒂斯J.Y.(Tse，J.Y.)，伊欧Y.(Yeo,Y.)，帕德拉R.(Padera，R.)，舒宾纳M.(Shubina,M.)和朗格R.(Langer，R.)用于腹膜内药物传递的生物可降解聚合微球体和纳米球体(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)生物医学材料研究杂志第A部分(JournalOfBiomedicalMaterialsResearchPartA)77A(2006)351-361，其以引用的方式并入本文中)表明增加此材料的疏水性可能对其用于某些所需用途(例如腹膜中)的生物相容性不利。因此，通过彻底透析来减少地塞米松负荷。HPLC分析终产物时，终产物中与地塞米松偶联的HA-ADH的百分比仅为0.1-0.2%(n=3)，表明几乎所有的HA-ADH在透析过程中都因琥珀酸盐连接基水解而释放。如通过材料于溶液中增加的浊度所证实，即使此极低的地塞米松对HA的最终修饰程度也对所述连结物于水中的溶解度具有影响。此终产物在下文中被称为HA-DEX。|凝麽OMX,/MX-DEA^游表fHAX-DEX的胶凝时间(22.3±0.5sec)比HAX长(3.5±1.0;各组中n=4，p<0.0001),预计这是因为HA-ADH上可用于交联的酰肼基团的数量因地塞米松修饰而降低27%。在PBS缓冲液中浸泡5天后，当在PBS中交联时，HAX和HAX-DEX与初始体积相比膨胀206.2±14.9%和235.6±36.9%(n=4，p=0.21)。HAX和HAX-DEX的剪切应力值分别为32.4±17.2Pa(n:4)和22.1±13.5Pa(n=4),但差异并不统计学上显著。这些值显示两种水凝胶高度可变形，且表明HAX-DEX以与HAX大致相同的程度交联。合^^康合#^//审座一银應话力游嚴称HAX禾HHAX-DEX凝胶在其降解期间释放出聚合物片段，诸如HA-ADH、HA-ALD或HA-DEX。进行MTT分析以研究合成聚合物对间皮细胞活力的影响。未经修饰的HA、HA-ALD禾flHA-ADH(都为n=4)展现细胞活力的较小降低(图33)。(对于未经修饰的HA和HA-ADH,在所有浓度下，与对照相比p<0.005。对于HA-ALD,在0.3、0.6、0.9和1.5%下，p分别为0.4、0.07、0.017和0.003)。HA-DEX(n=4)引起间皮细胞活力的较大降低(例如，HA-ADH与HA-DEX之间比较；在所有浓度下p<0.005)(图33)。瓶游潜孝基炉邀塞术松游释,动力学浙/大凝皮沐茨游好程将HAX-DEX凝胶培育于细胞培养基(DMEM)中。在第1天、第2天、第3天、第5天和第8天时，改变培养基并且如方法中所述使用ELISA测量所释放的地塞米松的浓度(图34)。在独立组中，使用作为更具代表性的生理学相关流体的培养基0.5%牛血清白蛋白(BSA)或10%胎牛血清(FBS)。在所有三种情况下，前三天地塞米松的释放是以相对恒定的速率发生，随后逐渐降低。所释放的地塞米松总量分别为DMEM中0.94±0.20pg;具有BSA的DMEM中1.33±0.39吗；和具有FBS的DMEM中1.02±0.41Hg，这分别与DMEM中总共释放17.8±3.8%的经连结地塞米松、具有BSA的DMEM中总共25.3±7.4%的经连结地塞米松和具有FBS的DMEM中总共19.3±7.8%的经连结地塞米松相对应。因此，在释放实验期间，约20%地塞米松因琥珀酸盐连接基的裂解而以游离药物形式释放。在这些实验结束时，无凝胶块状物存留；推测其余80%地塞米松是以与聚合物片段连结的形式释放。所释放的培养基的GPC也证实经地塞米松衍生化的大分子(macromer)的存在，但直接测定以此方式释放的量是不可能的。除第5天时BSA培养基中的地塞米松浓度高于纯DMEM(p=0.031)和FBS培养基(p=0.009)外，在任何时间点时不同培养基中地塞米松的浓度都无统计学显著的差异。HAX和HAX-DEX水凝胶随之在细胞培养基中膨胀和降解(图35)。二者都在数天内展现膨胀。第1天时就膨胀来说HAX与HAX-DEX之间不存在统计学显著的差异，但到第3天时，HAX-DEX在DMEM+BSA和DMEM+FBS中比HAX膨胀得大(p〈0.05)。HAX-DEX的降解速率比HAX快，因此第5天时HAX-DEX凝胶的体积显著降低。/M掘X游游炎歸地塞米松使经脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞中IL-6和TNF-a的产量剂量依赖性降低(图36)。在无地塞米松的情况下经LPS刺激的细胞中IL-6和TNF-(x的浓度分别为773±13ng/ml和11723±87pg/ml(n=4)。低于l(T9M的地塞米松浓度对所述两种分子的产量没有影响。为研究HAX-DEX的消炎效用，利用由在前述部分中的实验中的HAX和HAX-DEX产生的释放培养基处理LPS剌激的原代腹膜巨噬细胞。在暴露于腹膜巨噬细胞后，测量所述培养基中IL-6(图37)和TNF-a(图38)的浓度。图36与图37和38的比较揭示出，由利用HAX的释放实验得到的培养基不会明显削弱IL-6或TNF-a的产量。相比之下，暴露于由HAX-DEX得到的培养基会使二者产生明显降低。与HAX分别历时3天和5天相比，在HAX-DEX中见到腹膜巨噬细胞对IL-6(图37)禾nTNF-a(图38)产量的统计学显著抑制。生激布^性,蕴织及应向雄性SV129小鼠中经皮下注射1mlHAX或HAX-DEX(各自n=4)。注射后2天，对动物实施安乐死并将其刮开。解剖后，如经由皮肤和皮下组织中可看出，HAX-DEX袋的轮廓界限比HAX清晰。尽管HAX凝胶略有粘性，但其流动性强得多且已扩散到组织平面中。HAX-DEX凝胶易于以离散实体的形式从其囊袋中去除(摘出)(图39A)。HAX-DEX凝胶比HAX凝胶清晰。这些发现与上文所示的活体外结果(其中HAX-DEX降解比HAX快)形成对比。HAX-DEX凝胶涂片的所有经染色部分都表明几乎完全不存在白细胞浸润，而只有1个HAX凝胶涂片具有致密的嗜中性粒细胞和巨噬细胞聚集。此外，凝胶-组织界面处的组织和残余凝胶展现在HAX中比在HAX-DEX凝胶中强得多的细胞浸润(图39B-D)。讨论本文中已描述释放经连结地塞米松的交联HA水凝胶的合成和表征。此系统的特征在于将使得易于在腹膜内施用和存留。水凝胶有意识地极低装载地塞米松。如上文所述，一个问题在于基质的过度疏水性将削弱HA基质的生物相容性。此外，地塞米松药力强烈，其包括减弱创伤愈合、免疫抑制、高血压、胃肠出血等。因此，剂量最小化对于在使全身作用或使邻近创伤的裂开最小化的同时能够提供局部消炎活性极为重要。即使利用所述极低装载量，水凝胶也可临床上释放有效浓度的药物历时数天，而不会发生将会由透析掉的地塞米松所引起的大量突然释放。相反，通过HAX-DEX与HAX相比细胞毒性的适度增加可确定这些关于装载量的考虑的重要性。然而，应注意已知交联水凝胶缓慢降解，故活体外获得的游离HAX-DEX的浓度不太可能在活体内出现。多位研究人员已报导甾体糖皮质激素受体激动剂于预防腹膜粘连形成的效用(霍克尔M.(Hockel，M.)等人，利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)AnnalesChirurgiaeEtGynaecologiae76(1987)306-313，其以引用的方式并入本文中)，(布肯麦尔C.C.(Buckenmaier，C.C.)等人，使用目标大鼠模型比较抗粘连治疗(Comparisonofantiadhesivetreatmentsusinganobjectiveratmodel.)美国夕卜禾斗医生杂志(AmericanSurgeon)65(1999)274-282，其以引用的方式并入本文中)，(库克科兹肯T.(Kucukozkan,T.)等人，盆腔手术后通过色甘酸钠、地塞米松、生理盐水和抑肽酶预防粘连(Preventionofadhesionsbysodiumchromoglycate，dexamethasone,salineandaprotininafterpelvicsurgery.)ANZ手术杂志(ANZJSurg)74(2004)1111-5，其以引用的方式并入本文中)。据报导，这些化合物都是通过减少间皮细胞和腹膜巨噬细胞产生细胞因子等机制起作用。在本文中，通过测量地塞米松释放的效用研究两种细胞因子。TNF-a是急性发炎和腹膜粘连形成的重要细胞因子(霍姆达尔L.(Homdahl，L.)和艾弗森M.L.(Ivarsson，M.L.)细胞因子、共凝聚和纤维蛋白溶解在腹膜组织修复中的作用(Theroleofcytokines,coagulation,andfibrinolysisinperitonealtissuerepair.)欧洲手术杂志(EuropeanJournalOfSurgery)165(1999)1012-1019，其以引用的方式并入本文中)，(穆斯特尔S.E.(Mutsaers，S.E.)间皮细胞其结构、功能和其在浆膜修复中的作用(Mesothelialcells:Theirstructure,functionandroleinserosalrepair.)呼吸病学(Respirology)7(2002)171-191其以引用的方式并入本文中)。其刺激间皮细胞分泌多种介体纤溶酶原活化剂抑制剂(PAI)(沃维尔S.A.(Whawdl，S.A.)等人，肿瘤坏死因子介导的人类腹膜间皮细胞释放纤溶酶原活化剂抑制剂-l(TumorNecrosisFactor-MediatedReleaseOfPlasminogen-ActivatorInhibitor-1ByHumanPeritonealMesothelialCells.)英国手术杂志(BritishJournalOfSurgery)81(1994)214-216,其以引用的方式并入本文中)，(沃维尔S.A.(Whawell，S.A.)和辛普森J.N.(Thompson,J.N.)细胞因子诱导的人类间皮细胞释放纤溶酶原活化剂抑制齐!j-l(Cytokine-InducedReleaseOfPlasminogen-ActivatorInhibitor-1ByHumanMesothelialCells.)欧洲手术杂志(EuropeanJournalOfSurgery)161(1995)315-318，其以引用的方式并入本文中)，其减缓纤维化(维因斯伯格V.W.M.(Vanhinsbergh，V.W.M.)，波尔K.A.(Bauer,K.A.)，克尼斯塔T.(Kooistra，T.)，克拉夫特C(Kluft,C)，多杰沃德G.(Dooijewaard,G.)，希尔曼M.L.(Sherman,M.L.)和纽文辉文W.(Nieuwenhuizen,W.)人类中肿瘤坏死因子融合期间纤维蛋白溶解的进展-组织型纤溶酶原活化剂、1型纤溶酶原活化剂抑制剂和纤维蛋白(原)降解产物的伴随增加(ProgressOfFibrinolysisDuringTumor-Necrosis-FactorInfusionsInHumans-ConcomitantIncreaseInTissue-TypePlasminogen-Activator，Plasminogen-ActivatorInhibitorType-l，AndFibrin(Ogen)DegradationProducts.)血液学(Blood)76(1990)2284-2289，其以引用的方式并入本文中)，(穆勒基I.K.(Mullarky,I.K.)等人，肿瘤坏死因子a和Y干扰素而非出血或病原体负荷指示感染期间预防性纤维蛋白沉积的水平(Tumornecrosisfactoralphaandgammainterferon,butnothemorrhageorpathogenburden,dictatelevelsofprotectivefibrindepositionduringinfection.)感染与免疫学(InfectionAndImmunity)74(2006)1181-1188，其以引用的方式并入本文中)；IL-l、IL-6(穆斯特尔S.E.(Mutsaers，S.E.)间皮细胞其结构、功能和其在浆膜修复中的作用(Mesothelialcells:Theirstructure,functionandroleinserosalrepair.)呼吸病学(Respirology)7(2002)171-191,其以引用的方式并入本文中)和前列腺素(托普利N.(Topley，N.)，皮特森M.M.(Petersen，M.M.)，麦肯兹R.(Mackenzie,R.)，纽贝文A.(Neubauer,A.)，斯坦连沃E.(Stylianou,E.),卡维尔V.(Kaever，V,)，戴维斯M.(Davies,M.)，科尔斯G.A.(Coles,G.A.)，琼雷斯A.(Jorres，A.)和威廉姆斯J.D.(Williams,J.D.)人类腹膜间皮细胞前列腺素合成-通过腹膜巨噬细胞得到的细胞因子诱导环氧化酶信使Rna(HumanPeritonealMesothelialCellProstaglandinSynthesis-InductionOfCyclooxygenaseMessenger-RnaByPeritonealMacrophage-DerivedCytokines.)国际肾脏期干ij(KidneyInternational)46(1994)900-909，其以引用的方式并入本文中)，其加速腹膜发炎；IL-8(穆斯特尔S.E.(Mutsaers，S.E.)间皮细胞其结构、功能和其在浆膜修复中的作用(Mesothelialcells:Theirstructure,functionandroleinserosalrepair.)呼吸病学(Respirology)7(2002)171-191，其以引用的方式并入本文中)、单核细胞趋化蛋白-l(MCP-1)(穆斯特尔S.E.(Mutsaers，S.E.)间皮细胞其结构、功能和其在浆膜修复中的作用(Mesothelialcells:Theirstructure,functionandroleinserosalrepair.)呼吸病学(Respirology)7(2002)171-191,其以引用114的方式并入本文中)等，其诱导嗜中性粒细胞和单核细胞募集。因此，抑制TNF-ct的活性具有抑制腹膜粘连的潜在价值。IL-6是由包括巨噬细胞、成纤维细胞和间皮细胞的多种细胞产生。在间皮细胞中IL-1和TNF-a以剂量依赖性方式诱导其产生((TopIey)等人，人类腹膜间皮细胞合成白细胞介素-6-受IL-l-(3禾QTnf-a诱导(HumanPeritonealMesothelialCellsSynthesizeInterleukin-6-InductionByII-1-BetaAndTnf-Alpha,)国际肾脏期刊(KidneyInternational)43(1993)226-233，其以引用的方式并入本文中)。其具有多种涉及粘连形成的作用，包括刺激间皮细胞分泌PAI(沃维尔S.A.(Whawell,S.A.)等人，细胞因子诱导人类间皮细胞释放纤溶酶原活化剂抑制剂-1(Cytokine-InducedReleaseOfPlasminogen-ActivatorInhibitor-1ByHumanMesothelialCells.)欧洲i手术杂志(EuropeanJournalOfSurgery)161(1995)315-318，其以引用的方式并入本文中)；抑制间皮细胞增殖(兰弗朗科(Lanfrancone)等人，人类腹膜间皮细胞产生许多细胞因子(粒细胞集落刺激因子[Csf]、粒细胞-单核细胞-Csf、巨噬细胞-Csf、白细胞介素-l[Il-l]和11-6)并且经II-1活化并刺激以生长(HumanPeritonealMesothelialCellsProduceManyCytokines(GranulocyteColony-StimulatingFactor[Csf]，Granulocyte-Monocyte-Csf，Macrophage-Csf,Interleukin-1[II-1]，And11-6)AndAreActivatedAndStimulatedToGrowByll-l.血液学(Blood)80(1992)2835-2842，其以引用的方式并入本文中)；和诱导血管内皮生长因子(VEGF)释放，由此促进血管生成(克汉(Cohen)等人，白细胞介素6诱导血管内皮生长因子表达(Interleukin6inducestheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor.)生物化学杂志(JournalofBiologicalChemistry)271(1996)736-741,其以引用的方式并入本文中)，如TNFa或TGF-(3。已证实腹膜中HA基基质的生物相容性以及实际上其用于预防腹膜粘连的适应性(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型手术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Bzomfl"n'ak)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。地塞米松确切地因其效力而被选择用于与HA基质连结，因此有可能利用最少可能地改变生物良性基质-尤其希望避免使其具有疏水性来实现给定的炎性作用。媒剂的生物相容性极为重要一项研究表明，由疏水聚合物聚-DL-乙交酯-共聚-丙交酯(PLGA)构成的具有低地塞米松负荷的微球体使粘连加剧，而具有较高地塞米松负荷的微球体减少粘连形成。这表明，聚合物微球体的引起粘连的作用(一种随后经证实的特性)抵消地塞米松用于预防粘连的作用(克汉(Kohane)等人，用于腹膜中药物传递的生物可降解聚合物j散球体禾口纟内米球体(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)(JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA)77A(2006)351-361，其以引用的方式并入本文中)。预聚合物HA-DEX可能会导致比本文所使用的其它前体大分子低的细胞活力，但重要的是，应注意已知地塞米松的药理学作用和分析的性质，故这可反映抗增殖作用而非直接毒性作用。此外，可能未交联HA-DEX的浓度将比混合后此处所测试的浓度低得多。事实上，所述结果表明HAX-DEX的生物相容性可比拟HAX的生物相容性，且引起甚至更轻微的发炎反应。结论如抑制巨噬细胞TNF-a和IL-6产生所证实，透明质酸与地塞米松的原位可交联连结水凝胶具有适当的可操纵性且释放生物学有效的地塞米松。在活体内，HAX-DEX凝胶以比HAX凝胶低的发炎细胞浸润缔合。5,#雄遂絲杀鍵微极凝遂,财微茨雄蕭遂引言本实例描述含有糖皮质激素受体激动剂布地奈德的原位交联透明质酸水凝胶(障壁装置)。选择布地奈德是因为已知其在粘连形成中的发炎作用。选择透明质酸是因为已知其在腹膜中的生物相容性。使用双管注射器施用包括两种可交联前体液体的系统，从而在不到10秒内形成有弹力且持久的水凝胶。在兔腹膜粘连形成的重度重复侧壁缺损-盲肠擦伤模型的二次损伤后，将此调配物或对照品施用到受损部位。在所有经生理盐水治疗的动物中发展较大粘连。在用生理盐水屮的布地奈德或无布地奈德的水凝胶治疗的动物中，粘连形成和面积略有减轻。在经水凝胶中的布地奈德治疗的动物中，粘连的发生率和面积明显减少。在大鼠中皮下注射时，展现水凝胶中的布地奈德相比单独水凝胶发炎减少。总的来说，透明质酸水凝胶中的布地奈德对于预防重度重复损伤模型中的粘连合宜且极为有效。其为一种术后粘连预防的潜在有前景的系统；因此，本发明涵盖认可障壁装置的效用可由同时发生的药物传递极大增强。腹膜粘连为可在手术创伤或感染后形成的腹部与盆腔中结构之间的持续组织连接。术后粘连的发生率高达80%且通常导致严重临床结果，诸如疼痛、不孕或肠梗阻(迪泽佳GS(diZeregaGS)腹膜、腹膜愈合和粘连形成(Peritoneum,peritonealhealing,andadhesionformation.),迪泽佳GS(diZeregaGS)编，腹膜手术(PeritonealSurgery.)纽约(NewYork):施普林格(Springer),2000.第3-37页；其以引用的方式并入本文中)。在预防粘连的尝试中，多位研究人员已施用干预粘连形成中的关键事件的药剂(迪泽佳GS(diZeregaGS)腹膜、腹膜愈合和粘连形成(Peritoneum,peritonealhealing,andadhesionformation.),迪泽佳GS(diZeregaGS)编，腹膜手术(PeritonealSurgery.)纽约(NewYork):施普林格(Springer),2000.第3-37页；其以引用的方式并入本文中)。粘连形成的发病机理的炎性组分己成为使用多种甾体消炎药的药物疗法的常用标靶(苦库克孜坎T(KucukozkanT)，埃索以B(ErsoyB)，尤格D(UygurD)，甘多度C.(GundogduC)盆腔手术后通过色甘酸钠、地塞米松、生理盐水和抑肽酶预防粘连(Preventionofadhesionsbysodiumchromoglycate，dexamethasone,salineandaprotininafterpelvicsurgery.)ANZ手术杂志(ANZJSurg)2004;74(12):1111-U15;霍克尔M.(Hockel,M.)，欧特S.(Ott,S.)，希曼U.(Si函nn，U.)，柯斯尔T.(Kissel，T.)利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)A謹lesChirurgiaeEtGynaecologiae1987;76:306-313;布肯麦尔C.C.(Buckenmaier,C.C.)，普斯特雷A.E.(PusateriA.E.)，哈雷斯R.A.(Harris,R,A.)，赫兹S.P.(Hetz，S.P.)使用目标大鼠模型比较抗粘连治疗(Comparisonofantiadhesivetreatmentsusinganobjectiveratmodel.)美国夕卜禾斗医生杂志(AmericanSurgeon)1999;65:274-282;马瑞尔J(MaurerJ)，邦纳温特L.(BonaventuraL.)孕酮水溶液于手术后粘连形成的作用(Theeffectofaqueousprogesteroneonoperativeadhesionformation.)生育与不育(FertilSteril)1983;39(4):485-489;伽赞尼伽A(GazzanigaA)，詹姆斯J(JamesJ)，肖伯J(ShobeJ)，欧普海姆E.(OppenheimE.)大鼠中腹膜粘连的预防。地塞米松、甲基泼尼松龙、异丙嗪和人类纤溶酶的作用(Preventionofperitonealadhesionsintherat.Theeffectsofdexamethasone,methylprednisolone,promethazine,andhumanfibrinolysin.)外科学档案(ArchSurg)1975;110(4):429-432;和詹森R.(JansenR.)腹膜内附件改进年轻女性盆月空手术的失败(Failureofintraperitonealadjunctstoimprovetheoutcomeofpelvicoperationsinyoungwomen.)美国产科学与妇科医学杂志(AmJObstetGynecol)1985;153(4):363-371，所有文献都是以引用的方式并入本文中)。然而，这些药剂预防粘连的效用在动物模型(伽赞尼伽A(GazzanigaA)，詹姆斯J(JamesJ)'肖伯J(ShobeJ),欧普海姆E.(OppenheimE.)大鼠中腹膜粘连的预防。地塞米松、甲基泼尼松龙、异丙嗪和人类纤溶酶的作用(Preventionofperitonealadhesionsintherat.Theeffectsofdexamethasone,methylprednisolone,promethazine,andhumanfibrinolysin.)夕卜禾斗学档案(ArchSurg)1975;110(4):429-432，其以引用的方式并入本文中)和临床试验(詹森R.(JansenR.)腹膜内附件改进年轻女性盆腔手术的失败(Failureofintraperitonealadjunctstoimprovetheoutcomeofpelvicoperationsinyoungwomen.)美国产科学与妇禾斗医学杂志(AmJObstetGynecol)1985;153(4):363-371，其以引用的方式并入本文中)中并不一致，尤其在预防粘连复发时更是如此(拉森B.(LarssonB.)盆腔粘连的手术后形成和再形成的予页防(Preventionofpostoperativeformationandreformationofpelvicadhesions.)特尔特纳KH(TreutnerKH)，斯库姆普里科V(SchumpelickV)编辑腹膜粘连(PeritonealAdhesions.)柏林斯普林格-伏拉格特罗出版社(Berlin:Springer-VerlagTelos)，1997.第331-334页，其以引用的方式并入本文中)。药物从腹膜中快速清除会引起腹膜内施用药物的有限效用。使药物保持较高局部浓度的适当传递系统可能使其生物作用最大化。在本实例中，已选择原位可交联透明质素水凝胶(HAX)作为消炎化合物的药物传递系统。在先前实例中，己证实HAX对于预防兔侧壁缺损-盲肠擦伤模型中的腹膜粘连具有优良效用，而此与纳米颗粒存在无关(伊欧Y(YeoY)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(hs/似cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;和伊欧Y.(Yeo，Y.)，依托T.(Ito,T.)，博拉斯E.(Bellas,E.)，海利CB(Highley，CB)'玛瑞尼R.(Marini,R.),克汉DS(Kohane,DS)，用于预防手术后腹部粘连的含有聚合纳米颗粒的原位可交联透明质酸水凝胶(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelscontainingpolymericnanoparticlesforpreventingpost-operativeabdominaladhesions.)夕卜禾斗学纟己事(AnnSurg)2006报导中，两篇文献都是以引用的方式并入本文中)。布地奈德具有可比拟地塞米松的有效的糖皮质激素活性(医师桌上手册(Physicians'DeskReference):汤姆逊PDR(ThomsonPDR)，2006,其以引用的方式并入本文中)且在全身吸收后迅速转化成无活性代谢物(医师桌上手册(Physicians'DeskReference):汤姆逊PDR(ThomsonPDR)，2006，其以引用的方式并入本文中)。在本实例中使用严格的重复损伤动物模型证实布地奈德的抗粘连活性。使用生物可相容HAX可显著改进其抗粘连活性，从而完全预防大部分所测试的动物中的粘连。材料与方法嚴泣#文凝ffi4好主激飾备遵循先前所报导的方法合成原位可交联HA衍生物并加以分析(伊欧Y.(Yeo，Y.);海利CB(Highley，CB);博拉斯E.(Bellas,E.);依托T.(Ito,T.);玛瑞尼R.(Marini,R.);朗格R.(Langer,R.)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/wcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;布尔皮特P.(Bulpkt，P.);艾斯奇曼D.(Aeschlimann，D.)，化学修饰透明质酸的新策略官能化衍生物的制备和118其用于形成新颖生物可相容水凝胶的用途(Newstrategyforchemicalmodificationofhyaluronicacid:Preparationoffunctionalizedderivativesandtheiruseintheformationofnovelbiocompatiblehydrogels.)生物医学*才料石if究杂志(JBiomedMaterRes)1999;47:152-169;和贾X.Q.(Jia，X.Q.);克鲁姆博G.(Colombo,G.);帕德拉R.(Padera，R.);朗格R.(Langer，R.):克汉D.S.(Kohane,D.S.)，通过原位交联透明质酸来延长坐骨神经阻断(Prolongationofsciaticnerveblockadebyj,'fwcross-linkedhyaluronicacid.)生物材料(Biomaterials)2004;25(19):4797-4804,所有所述文献各自以引用的方式并入本文中)。简单来说，通过将己二酸二酰肼与HA主链中的羧基连结来制备HA-己二酸二酰肼(HA-ADH)，并且通过使HA与高碘酸钠反应来制备HA-醛(HA-CHO)。布邀^,主潘益^r^7布邀袭,/MX必粼备首先将布地奈德溶解于乙醇中以制成8.2mg/ml的储备溶液。通过将0.16ml储备溶液添加到10ml生理盐水中来制备布地奈德-生理盐水。对于布地奈德-HAX，将0.08ml布地奈德储备溶液分别添加到5mlHA-ADH(20mg/ml)禾B5mlHA-CHO(20mg/ml)中。通过使用百特双管注射器经由同一个出口洗脱两种前体溶液来制备布地奈德-HAX凝胶。布地奈德-生理盐水和布地奈德-HAX含有0.13mg/ml布地奈德。杀邀袭薪-/^义游表,如先前所述，在室温下测量布地奈德-HAX的原位胶凝时间(伊欧(Yeo)等人原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物禾才茅斗(fi/0maMn'ak)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。简单来说，在生理盐水中制备20mg/mlHA-ADH和HA-CHO溶液。如上文所述，将布地奈德添加到各溶液中以达0.13mg/ml。在连续搅拌下，将100微升HA-ADH溶液与100微升HA-CHO溶液混合。将溶液形成与所述盘底部分离的固体小球时的时间视为胶凝时间。通过扫描电镜分析(SEM)检査冻干布地奈德-HAX内部结构的形态。将布地奈德-HAX凝胶冻干且在液氮中冷却后破碎。将样本用钯和金(150埃厚)溅涂并且使用扫描电镜(JEOLJSM6320，美国JEOL有限公司，马萨诸塞州皮伯迪(Peabody,MA))观察。布邀紊葸于生潘—盆水^游溶"^^游激量如所述测定布地奈德于生理盐水中的最大溶解度(金纳诺AR(GennaroAR)编辑，雷明顿药学理论和实践(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.)第20版，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA):利平科特.威廉斯&威尔金斯工作室(LippincottWilliams&Wilkins)，2000,其以引用的方式并入本文中)。首先，将增加量的布地奈德与生理盐水混合以在所述系统中提供25mg/ml到0.002mg/ml的布地奈德浓度。在37'C下将混合物连续搅拌24小时，且随后以12,000rpm离心5分钟以使溶液相与固体相分离。通过高效液相色谱(HPLC)测量溶液相中布地奈德的浓度。通过外推直线区段(其斜率为0)到y轴测定布地奈德于生理盐水中的饱和溶解度。在独立实验中，如上文所述制备布地奈德-生理盐水0.13mg/ml，将其分成1ml的等分试样，且在连续搅拌下于37'C下培育。在定时间隔时，取得布地奈德-生理盐水等分试样并以12,000rpm离心5分钟以分离出0.8ml上清液以供HPLC分析。将潜在含有沉淀布地奈德的剩余0.2ml溶解于0.8ml乙腈中并利用HPLC加以分析。话银//布邀^/#释威动力学在夹于两个玻璃载片之间的橡胶模具中制备圆盘状布地奈德-HAX。所制备的水凝胶的直径和厚度分别为8mm和3.5mm(约150pl)。将布地奈德-HAX凝胶称重且放入艾本多夫管(eppendorftube)中，向其中添加含有10U/ml透明质酸酶的1ml磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，并在连续搅动下在37'C下培育。在简短旋转减弱后对释放培养基0.5ml取样，且替换0.5ml新鲜培养基。将释放样本冷冻直到HPLC分析。布邀杀薪游///^(:分界色谱系统是由装备有自动进样器的HPLC溶剂传递系统和UV检测器(IIOO系列，安捷伦技术公司(AgilentTechnologies),加州帕罗奥多(PaloAlto,CA))组成。分析柱为亚特兰蒂斯dC18(dC18;4.6x250mm;粒径5pm)。流动相为30:70的0,1%乙酸与乙腈的混合物，且流速为lml/min。将5样本注射到预先平衡的柱上，随后用流动相洗涤10min。将UV检测器设置在248nm。通过将色谱图中的峰面积与布地奈德标准品的浓度相关来得到校准曲线。停留时间6.1min。检出限0.2Hg/ml。游话沐/l7滋—历依照麻省理工学院委员会(MassachusettsInstituteofTechnologyCommittee)关于动物护理所批准的方案，遵照有关实验室动物的护理和使用的NIH指导(Nffl公告弁85-23，1985年修订)护理动物。扁教,/MX舰m利用氧气中的2-3%异氟烷对雄性斯普拉格-道利大鼠(Sprague-Dawleyrat)(320g-420g)实施麻醉。由双管注射器(一个注射器中有0.5mlHA-ADH，另一注射器中有0.5mlHA-CHO)注射1ml布地奈德-HAX或HAX。如上文所述制备含有0.13mg/ml布地奈德的布地奈德-HAX。因此，给与大鼠的布地奈德的总量为0.3-0.4mg/kg。通过添加乙醇代替布地奈德储备溶液来制备HAX(阴性对照)。将布地奈德-HAX或HAX经皮下注射到背部中线中。注射后2天(n=5)或5天(n=4)，处死动物以检査组织反应。使用标准技术处理组织以供组织学分析。Jf过布邀袭蘑-a4X厥银履虜教遂如先前研究中[tPA]所述经由重复剖腹术诱发雌性白化兔(西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus)，新西兰白(NewZealandWhite))(3±0.5kg)中的腹膜粘连。简单来说，执行盲肠擦伤和腹壁切开以诱发新生粘连(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型手术后腹部粘连(/""'似cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel,)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。1周后执行第二次剖腹术以切割粘连并在与第一次剖腹术中损伤相同的位置引入其它损伤。去除损伤处的过量血液，且随后使用百特双管注射器将10ml布地奈德-生理盐水或布地奈德-HAX施用于再擦伤区域(n=6)。两种调配物都含有1.3mg布地奈德(0.44mg/kg)。手术者关于治疗的特性未知。如别处所述采用手术后护理(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/""'仏cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料()2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。第2次剖腹术后通过静脉内注射戊巴比妥钠处死动物。使用所报导的方法的修改方法对粘连评分(伯恩斯JW(BurnsJW)等人，通过用透明质酸溶液预涂组织预防组织损伤和术后粘连(Preventionoftissueinjuryandpostsurgicaladhesionsbyprecoatingtissueswithhyaluronicacidsolutions.)手术研究杂志(JSurgRes)1995;59:644-652，其以引用的方式并入本文中)0分=无粘连；1分=利用重力将会分离的组织粘连；2分=可通过钝器解剖分离的组织粘连；3分=需要利器解剖的粘连。如果存在多种具有不同得分的粘连，选择较高的得分作为代表性得分。测量2分或3分粘连的面积以供粘连的定量评估。评估人员关于各动物所接收的治疗未知。将由尸检回收的组织固定于10%福尔马林中，包埋于石蜡中，切片并用苏木素和伊红染色以供组织学检查。统^学分折将来自活体内实验的数据以平均值与第25个百分点和第75个百分点表示，这是因为其并不总是遵循正态分布，且使用SPSS软件(伊利诺州芝加哥市(Chicago,IL))在克鲁斯凯-沃利斯检验后使用曼-惠特尼U检验或利用费雪准确检验进行统计学推断。认为在双尾检验上小于0.05的p值为统计学显著。结果布见德-組凝層雄在连续搅拌下混合后，两种HA衍生物(20mg/ml)(二者都含有0.13mg/ml布地奈德)的溶液在4,l士1.7sec内形成布地奈德-HAX凝胶，这与无布地奈德时HAX凝胶的胶凝时间类似(3.9土l.sec，双尾t检验时p-0.72)。在SEM下(图40),冻干布地奈德-HAX凝胶展现多孔网络(交联水凝胶的典型)(贾X(JiaX)，波迪克JA(BurdickJA)，克波勒J(KoblerJ),克里夫顿RJ(CliftonRJ),罗索沃斯基JJ(RosowskiJJ),载特斯SM(ZeitelsSM)等人，原位可交联透明质酸基水凝胶的合成和表征以及用于声带再生的潜在应用(SynthesisandCharacterizationofCross-LinkableHyaluronicAcid-BasedHydrogelswithPotentialApplicationforVocalFoldRegeneration.)高分子(Mac讓olecules)2004;37(9):3239-3248;和伊欧Y(YeoY)，博迪克JA(BurdickJA)，海利CB(HighleyCB)，玛瑞尼R(MariniR)，朗格R(LangerR)，克汉DS.(KohaneDS.)壳聚糖和UV可交联壳聚糖的腹膜应用(PeritonealapplicationofchkosanandUV-cross-linkablechitosan.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2006;78A(4):668-675;两篇文献都是以引用的方式并入本文中)。漆巡袭翁f主湮益水^游溶游度根据美国药典(UnitedStatesPharmacopoeia)分类，布地奈德"实际上不可溶"于水中(溶解度<0.1mg/ml)(美国药典，洛克威尔MD(Rockville，MD):美国药典委员会有限公司(UnitedStatesPharmacopeialConvention,Inc.))。为评估本文所研究的调配物中布地奈德的可溶部分，测量其在37'C下于生理盐水中的溶解度。使不同量的布地奈德粉末在37t:下溶解整夜。与不溶解的固体相分离的溶液中布地奈德的浓度在0.027mg/ml下达到稳定，此定义为在37'C下布地奈德于生理盐水中的饱和溶解度(图41A)。选择0.44mg/kg作为布地奈德剂量以供根据先前使用地塞米松预防粘连的实验的活体内研究(苦库克孜坎T(KucukozkanT)，埃索以B(ErsoyB)，尤格D(UygurD)，甘多度C.(GundogduC.)盆腔手术后通过色甘酸钠、地塞米松、生理盐水和抑肽酶预防禾占连(Preventionofadhesionsbysodiumchromoglycate,dexamethasone，salineandaprotininafterpelvicsurgery.)ANZ手术杂志(ANZJSurg)2004;74(12):1111-1115;霍克尔M.(Hockel,M.)，欧特S.(Ott,S.)，希曼U.(Siemann,U.)，柯斯尔T.(Kissel,T.)利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)AnnalesChirurgiaeEtGynaecologiae1987;76:306-313;和布肯麦尔C.C.(Buckenmaier,C.C.),普斯特雷AE(PusateriAE)，哈雷斯RA(Harris,RA),赫兹SP(Hetz，SP)使用目标大鼠模型比较抗粘连治疗(Comparisonofantiadhesivetreatmentsusinganobjectiveratmodel.)美国夕卜禾斗医生杂志(AmericanSurgeon)1999;65:274-282,所有所述文献都是以引用的方式并入本文中)。在这些研究中，地塞米松的剂量在0.33到4mg/kg的范围内。已知布地奈德的糖皮质激素效力与地塞米松相当(全身作用比可的松强40倍)(医师桌上手册(Physicians'deskreference):汤姆逊PDR(ThomsonPDR)，2006，其以引用的方式并入本文中)，故本文所使用的布地奈德的剂量与其它研究中所使用的地塞米松剂量范围的下限相当。为将lOml布地奈德-生理盐水或布地奈德-HAX的剂量提供给3kg兔，故制备出含有0.13mg/ml布地奈德的布地奈德-生理盐水和布地奈德-HAX。为测定在37'C下布地奈德的溶液浓度的改变，将布地奈德-生理盐水在37'C下培育，且随时间流逝分析溶液相。制备后不久，布地奈德-生理盐水即在溶液相中含有0.13±0.004mg/ml布地奈德(=98.5±3.5%系统中的总布地奈德)。在37。C下培育时，布地奈德的浓度在2小时内迅速降低，在12小时内达到0.034±0.001mg/ml(=25.2±0.7%系统中的总布地奈德)(图41B)。在剩余0.2m中回收沉淀形式的剩余物(图41B)。菸沐//布邀袭艚释,动力学在含有10单位/毫升透明质酸酶(其提供与先前研究中的受损腹膜中的凝胶降解速率相当的活体外凝胶降解速率)的PBS中检查HAX的布地奈德释放动力学(伊欧Y.(Yeo，Y.)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型屮手术后腹部粘连("w'mcross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705;和伊欧Y.(Yeo,Y.);依托T.(Ito,T.);博拉斯E.(Bellas,E.);海利CB(Highley,CB);玛瑞尼R.(Marini,R.);克汉DS(Kohane，DS)，用于预防手术后腹部粘连的含有聚合纳米颗粒的原位可交联透明质酸水凝胶(/cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)外科学档案(AnnSurg)2006报导中，所述两篇文献都是以引用的方式并入本文中)。为使释放动力学反映已溶解的布地奈德的释放，并入药物的量低于其饱和溶解度(0.027mg/mD。62.6±6.8%的预期布地奈德在24小时内(图42)从HAX凝胶释放。甚至在凝胶完全降解后也无显著的进一步释放。可通过取样期间降解HAX凝胶(其为半固体)的损失来解释负荷量与总释放量之间的差异。凝胶本身在第二天内降解，因此只有少量松散凝胶碎片到第8天时仍能观察到。疆布见射泉盤/微颜雄为评估布地奈德-生理盐水与布地奈德-HAX的抗粘连功效，使用重复损伤模型。由于诱发比常规侧壁缺损-盲肠擦伤模型更强的粘附的模型将便利展现与已证实极为有效的HAX本身相比改进的抗粘连功效，故使用所述模型是相当引人注目的(伊欧Y.(Yeo，Y.)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型中手术后腹部粘连(/"jtocross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(Biomaterials)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。如上文所述，将兔盲肠擦伤并产生侧壁缺损。1周后，100%动物发展2分和/或3分粘连。将这些粘连溶解且将盲肠和侧壁损伤部位再擦伤。将布地奈德-生理盐水或布地奈德-HAX施用于再受损区域上。历史对照是由来自同时进行的实验的用单独生理盐水(n=6)或单独HAX(n=6)治疗的动物提供。l周后，对动物实施安乐死以供尸检。两组在存活期间经历类似的重量损失(图43A)(p=0.378);二者与用单独生理盐水或HAX治疗的历史对照组的情形相当(各自ii=6，p=0.272，克鲁斯凯-沃利斯检验)。在83%用布地奈德-生理盐水治疗的动物中发展3分粘连(图43B)。尽管粘连得分与生理盐水治疗的对照组无统计学差异，但粘连面积大致减少3倍(p=0.01)。HAX中的布地奈德明显降低粘连得分和面积，甚至优于布地奈德治疗的动物的情形。67%所测试动物中的粘连完全得到预防。在剩余动物(n=2)中，粘连面积为1.6和4.6cm2,其明显小于生理盐水治疗的对照[tPA](p=0.003)、布地奈德-生理盐水(p=0.046)和HAX[tPA](p=0.022)。组织学检査时，从粘连取得的样本为连接盲肠平滑肌与腹壁骨骼肌层的纤维状结缔组织。在布地奈德-生理盐水和布地奈德-HAX组中，观察到与未受影响的腹膜表面相当的愈合盲肠和腹壁的表面再生上皮(图44)。两组之间下层肉芽组织的厚度和细胞组成不存在明显差异。^7"恭邀袭翁-a4X游资织友应为验证布地奈德-HAX的消炎作用，对雄性斯普拉格-道利大鼠(Spmgue-Dawleyrat)皮下注射存在或不存在布地奈德的HAX，从而形成离散肿胀。注射后2天和5天'由未知的解剖者采集凝胶。大体解剖后，HAX凝胶呈现相当大程度的发炎(图45A),以及遮蔽植入物的高血管化的半透明或不透明较厚组织层，其无法与下层皮肤解剖分离(图45B)。相比之下，布地奈德凝胶展现少得多的血管化和发炎，因此可看出清晰的凝胶(图45C)且在大部分情况下可显而易见与周围组织解剖分离的凝胶(图45D)。组织学评定揭示注射后2天两种水凝胶之间的对比，因此其易于为未知观察者区别。在不存在布地奈德的样本中，由水凝胶占据的空间被发炎细胞、尤其嗜中性粒细胞湮没(图45E)。在存在布地奈德的样本中，发炎反应极大减少，从而使水凝剂在很大程度上保持完整(图45F)。第5天时，已不可利用大体解剖或组织学检查区别各组。讨论在此处证实可通过使用可在受损表面处保持较高局部药物浓度的药物传递系统来显著改进布地奈德的抗粘连功效。布地奈德为实际上不溶于水的化合物，且在37'C下于生理盐水中的饱和溶解度为0.027mg/ml。超出所述溶解度界限的布地奈德-生理盐水的部分经2小时迅速沉淀(图41B)。因此，施用于腹膜的布地奈德-生理盐水实际上为饱和溶液与布地奈德沉淀悬浮液的混合物。如果沉淀保留在腹膜中，那么所述沉淀本身可充当连续药物释放的储集器。如与生理盐水治疗的对照相比，布地奈德-生理盐水使粘连面积明显减少，但3分粘连的频率与对照并无不同。药物效用受到相对低剂量的限制和/或布地奈德-生理盐水迅速从腹膜中除去是可能的。然而，当与HAX组合时，相同剂量却高度有效。在大鼠模型中，使用PLGA微米颗粒进行的地塞米松的局部持续传递对于预防粘连比地塞米松晶体悬浮液有效(霍克尔M.(Hockel，M.)，欧特S.(Ott,S.),希曼U.(Siemann,U.)，柯斯尔T.(Kissel，T.)利用通过新颖治疗系统传递的持续腹膜内地塞米松预防大鼠腹膜粘连(PreventionOfPeritonealAdhesionsInTheRatWithSustainedIntraperitonealDexamethasoneDeliveredByANovelTherapeuticSystem.)AnnalesChirurgiaeEtGynaecologiae1987;76:306-313，其以引用的方式并入本文中)，但只有3使用大量提供较高剂量地塞米松(4mg/kg)的微米颗粒时才出现此情形。少量微米颗粒使得粘连加剧。先前已证实PLGA微米颗粒木身诱发腹膜粘连(克汉DS(KohaneDS)，提斯JY(TseJY)，伊欧Y(YeoY)，帕德拉R(PaderaR)，舒伯纳M(ShubinaM)，朗格R.(LangerR.)用于腹膜中药物传递的生物可降解聚合微球体和纳米球体(Biodegradablepolymericmicrospheresandnanospheresfordrugdeliveryintheperitoneum.)生物医学材料研究杂志(JBiomedMaterRes)2006;77A(2):351-361，其以引用的方式并入本文中)。这些报导的一种解释为媒剂的促粘连作用会抵消地塞米松的粘连预防活性。本文所述系统的效用可部分归因于媒剂本身不引起粘连的事实且事实上其具有内在抗粘连活性(伊欧(Yeo)等人，原位可交联透明质酸水凝胶预防兔模型手术后腹部粘连(/"cross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel.)生物材料(别wna"r!'。k)2006;27:4698-4705，其以引用的方式并入本文中)。皮下实验的有益之处在于，布地奈德凝胶的消炎作用可能持续至少2天但少于5天，这与活体外实验中布地奈德释放的持续时间大致相同。因此，此相对简短的药物释放期似乎可解释存在与不存在布地奈德的水凝胶之间的结果差异。这等同于以下观点粘连形成的关键事件通常是在前2-3天中发生，并且表明粘连预防所需的药物释放的持续时间可能极短。尽管粘连预防的许多方法已在临床实验中失败，但在实验动物中存在引人注目的功效数据。一个起作用的原因可能为其是在相对容许的动物模型中评估，其中粘连预防相对容易(维斯曼DM(WisemanDM.)动物粘连模型设计、变量和相关性(Animaladhesionmodels:design,variables,andrelevance.),迪泽佳GS(diZeregaGS)编辑，腹膜手术(PeritonealSurgery)纽约斯普林格(NewYork:Springer),2000.第459-476页，其以引用的方式并入本文中)。这是使用更具挑战性的重复损伤模型的一个原因。布地奈德-HAX易于制备和操纵，在存在血液和腹膜液的情况下有效并且能经由剖腹术或内窥镜施用。等效物和范畴所属领域技术人员将使用仅一种常规实验认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范畴不打算限于上述实施方式，而是如随附权利要求书所述。在权利要求书中，除非另作相反说明或另外由上下文显而易见，否则诸如"一"和"所述"的冠词可意谓多种。除非另作相反说明或另外由上下文显而易见，否则认为在一组一个或多个成员之间包括"或"的权利要求书或实施方式满足一个、多个或所有所述组的成员存在于、用于给定产物或方法中或以其它方式与给定产物或方法相关。本发明包括严格地所述组的一个成员存在于、用于给定产物或方法中或者以其它方式与给定产物或方法相关的实施例。本发明还包括所述组的多个或所有成员都存在于、用于给定产物或方法中或者以其它方式与给定产物或方法相关的实施例。此外，应了解本发明涵盖将来自一个或多个权利要求或来自实施方式相关部分的一个或多个限定、要素、条款、说明性术语等引入另一权利要求中的所有变更、组合和改变。举例来说，可对视另一权利要求而定的任何权利要求加以修改以使其包括一个或多个见于视同一基础权利要求而定的任何其它权利要求中的限定。此外，当权利要求叙述一种组合物时，除非另作指示或者除非所属领域技术人员显而易见将引起抵触或矛盾，否则应了解包括出于本文中所揭示的任何目的使用所述组合物的方法，并且包括根据本文所揭示的制备方法或所属领域中已知的其它方法中的任一方法制备组合物的方法。举例来说，应了解本发明的任何组合物都可用于抑制任何位置处和/或由本文所讨论或所属领域中已知的任何原因引起的粘连形成、进展和/或复发。还应了解，根据本文所揭示的制备组合物的方法制备的任何组合物都可用于抑制任何位置处和/或由本文所讨论或所属领域中已知的任何原因引起的粘连形成、进展和/或复发。此外，本发明涵盖根据本文所揭示的制备组合物的任何方法制备的组合物。在要素是以例如马库西群组(Markushgroup)形式以列表提供的情况下，应了解也揭示所述要素的各个亚组并且可从所述群组中去除任何要素。还应注意，术语"包含"打算为开放式的并且容许包涵其它要素或步骤。应了解，一般来说，在本发明或本发明各方面提及包含特定要素、特征、步骤等时，本发明的某些实施例或本发明各方面是由或基本上由所述要素、特征、步骤等组成。出于简洁的目的，在本文中这些实施例并未以这些词特别说明。因此，对于包含一个或多个要素、特征、步骤等的本发明各实施例来说，本发明还提供由或基木上由这些要素、特征、步骤等组成的实施例。当给定范围时，包括端点。此外，应了解，除非另作指示或者从上下文和/或所属领域技术人员中的一者的理解显而易见，否则以范围表示的值可采取本发明不同实施例中所述范围内的任何特定值，除非上下文中另外清楚指示，否则精确到所述范围下限单位的十分之一。还应了解，除非另作指示或者从上下文和/或所属领域技术人员中的一者的理解显而易见，否则以范围表示的值可采取指定范围内的任何子范围，其中将所述子范围的端点表示成达与所述范围下限单位的十分之一相同的精确程度。此外，应了解本发明的任何特定实施例可明确地从一个或多个权利要求中排除。本发明组合物和/或方法的任何实施例、要素、特征、应用或方面(例如，任何水凝胶前体、任何多糖衍生物或非多糖聚合物(例如任何HA衍生物或纤维素衍生物)、任何分子量范围、任何交联剂、水凝胶前体之间的任一类共价键、任一类生物活性剂或特定药剂、任何粒径和/或材料组成、任何投药途径或位置、投与组合物的任何目的等)都可排除在任一个或多个权利要求之外。举例来说，在本发明某些实施例中，生物活性剂不为抗增殖剂。出于简短的冃的，排除一个或多个要素、特征、目的或方面的所有实施例都未在本文中明确陈述。权利要求1.一种抑制粘连的方法，所述方法包含以下步骤将第一水凝胶前体投与给个体体内位置处；和将第二水凝胶前体投与所述个体体内所述位置处，其中所述第一水凝胶前体为纤维素衍生物或葡聚糖衍生物；其中所述第二水凝胶前体为葡聚糖衍生物；其中在所述第一与所述第二水凝胶前体相互接触后，所述水凝胶前体交联形成水凝胶；且其中所述水凝胶抑制粘连。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一水凝胶前体包含第一官能团；其中所述第二水凝胶前体包含第二官能团；并且其中所述第一和所述第二官能团在生理条件下相互反应形成共价键。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一水凝胶前体或所述第二水凝胶前体中的至少一种包含非多糖部分。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素衍生物选自由MC衍生物、CMC衍生物和HPMC衍生物组成的群组。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一水凝胶前体为CMC衍生物且所述第二水凝胶前体为羧甲基葡聚糖衍生物。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二水凝胶前体为CMDX-ADH并且所述第一水凝胶前体选自由MC-CHO、CMC-CHO和HPMC-CHO组成的群组。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二水凝胶前体为CMDX-ADH且所述第一水凝胶前体为CMC-CHO。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一水凝胶前体为第一葡聚糖衍生物且所述第二水凝胶前体为第二葡聚糖衍生物。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一葡聚糖衍生物为CMDX-ADH且所述第二葡聚糖衍生物为CMDX-CHO。10.根据权利要求所述的方法，其中所述水凝胶前体是以溶液形式投与。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶前体是以内窥镜方式或使用注射器投与。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶是在所述水凝胶前体相互接触后介于1与100秒内形成。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶前体实质上是在不存在游离交联剂的情况下投与。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含纤维素衍生物的溶液，其中所述纤维素衍生物的浓度大于5mg/ml。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含纤维素衍生物的溶液，其中所述纤维素衍生物的浓度大于25mg/ml。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含纤维素衍生物的溶液，其中所述纤维素衍生物的浓度大于50mg/ml。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含葡聚糖衍生物的溶液，其中所述葡聚糖衍生物的浓度大于5mg/ml。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含葡聚糖衍生物的溶液，其中所述葡聚糖衍生物的浓度大于25mg/ml。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含投与至少一种包含葡聚糖衍生物的溶液，其中所述葡聚糖衍生物的浓度大于50mg/ml。20.根据权利要求1所述的方法，其另外包含在投与所述第一和所述第二水凝胶前体之前，破坏所述位置处存在的粘连的步骤。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含以与水凝胶前体形成的溶液或单独溶液形式投与生物活性剂。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物活性剂为消炎剂。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述消炎剂为非甾体消炎剂。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非甾体消炎剂选自由以下组成的群组塞来考昔(celecoxib)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、水杨酸盐(salicylate)、菲诺洛芬(fenoprofen)、布洛芬(ibuprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯方酸盐(meclofamate)、甲氯芬那酸盐(meclofenamate)、美洛昔康(meloxicam)、萘普生(naproxen)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、水杨酸水杨酸酯(salsalate)、萘丁美酮(nabumetone)、阿司匹林(aspirin)、奥沙普秦(oxaprozin)和托美汀(tolmetin)。26.根据权利要求23所述的方法，其中所述消炎剂为甾体消炎剂。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述甾体消炎剂选自由以下组成的群组地塞米松(dexamethasone)、氟米龙(fluorometholone)、泼尼松龙(prednisolone)、氯替泼诺(loteprednol)、甲羟松(medrysone)、泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松(methylpredisolone)、布地奈德(budesonide)、可的松(cortisone)、禾li美索龙(rimexolone)、氯倍他索(clobetasol)、卣贝他索(halobetasol)、氢化可的松(hydrocortisone)、曲安奈德(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、肤轻松(fluocinolone)禾口氟西柰德(fluocinonide)。28.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二水凝胶前体是以重量计介于1:10与10:1之间的比率投与。29.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述水凝胶前体有生物活性剂与其共价连接。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物活性剂为消炎剂。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述消炎剂为非甾体消炎剂。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非甾体消炎剂选自由以下组成的群组塞来考昔、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、水杨酸盐、菲诺洛芬、布洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯方酸盐、甲氯芬那酸盐、美洛昔康、萘普生、吡罗昔康、舒林酸、水杨酸水杨酸酯、萘丁美酮、阿司匹林、奥沙普秦和托美汀。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述消炎剂为甾体消炎剂。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述甾体消炎剂选自由以下组成的群组地塞米松、氟米龙、泼尼松龙、氯替泼诺、甲羟松、泼尼松、甲基泼尼松、布地奈德、可的松、利美索龙、氯倍他索、卤贝他索、氢化可的松、曲安奈德、倍他米松、肤轻松和氟西柰德。36.根据权利要求1所述的方法，其另外包含将多个颗粒与所述水凝胶前体一起投与，从而使所述颗粒截留于由交联所述水凝胶前体形成的水凝胶中。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述颗粒为包含选自由以下组成的群组的材料的纳米颗粒(腿oparticle)或微米颗粒(microparticle):聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚(P-氨基酯)、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇和其衍生物、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二氧环己酮)、聚(亚烷基烷基化物)、聚乙二醇与聚原酸酯的共聚物、生物可降解聚氨酯以及任一前述聚合物的掺合物或共聚物，和脂质体。38.根据权利要求36所述的方法，其中所述颗粒在投与前是与水凝胶前体一起存在于溶液中。39.根据权利要求36所述的方法，其中所述颗粒包含生物活性剂。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物活性剂为消炎剂。42.—种组合物，其包含(a)纤维素衍生物；(b)葡聚糖衍生物；和(c)多个颗粒。43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述颗粒为包含选自由以下组成的群组的材料的纳米颗粒或微米颗粒聚(内交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚(p-氨基酯)、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇和其衍生物、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二氧环己酮)、聚(亚垸基垸基化物)、聚乙二醇与聚原酸酯的共聚物、生物可降解聚氨酯以及任--前述聚合物的掺合物或共聚物，和脂质体。44.根据权利要求42所述的组合物，其中所述颗粒生物可降解。45.根据权利要求42所述的组合物，其中所述颗粒包含生物活性剂。46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述生物活性剂为消炎剂。48.根据权利要求42所述的组合物，其中所述组合物为水凝胶，其中所述纤维素衍生物与所述葡聚糖衍生物相互交联。49.根据权利要求42所述的组合物，其中所述纤维素衍生物或所述葡聚糖衍生物有生物活性剂与其共价连接。50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。51.—种将颗粒投与至体内位置的方法，其包含将包含颗粒、第一水凝胶前体和第二水凝胶前体的组合物投与至所述位置；其中所述第一水凝胶前体为纤维素衍生物或葡聚糖衍生物；其中所述第二水凝胶前体为葡聚糖衍生物；且其中所述第一与所述第二水凝胶前体在投与后形成截留所述颗粒的水凝胶。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物是以一种或多种溶液的形式投与，所述溶液中的至少一种含有颗粒。53.根据权利要求51所述的方法，其中所述颗粒包含生物活性剂。54.根据权利要求51所述的方法，其中所述颗粒为包含选自由以下组成的群组的材料的纳米颗粒或微米颗粒聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚((3-氨基酯)、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇和其衍生物、聚原酸酯、聚縮醒、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二氧环己酮)、聚(亚烷基烷基化物)、聚乙二醇与聚原酸酯的共聚物、生物可降解聚氨酯以及任一前述聚合物的掺合物或共聚物，和脂质体。55.—种将生物活性剂投与给个体的方法，其包含以下步骤将包含生物活性剂、第一水凝胶前体和第二水凝胶前体的组合物投与至位置；其中所述第一水凝胶前体为纤维素衍生物或葡聚糖衍生物；其中所述第二水凝胶前体为葡聚糖衍生物；且其中所述第一与所述第二水凝胶前体形成其中截留所述生物活性剂的水凝胶。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物活性剂与水凝胶前体共价连接。57.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物活性剂为治疗剂，其选自由以下组成的群组抗感染剂、消炎剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗凝剂、蛋白水解剂、增强蛋白水解的药剂、自由基清除剂、抗氧化剂、纤维性修复抑制剂和RNAi剂。58.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物活性剂为消炎剂。59.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物活性剂与颗粒以物理方式缔合。60.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物活性剂与纳米颗粒或微米颗粒以物理方式缔合，所述纳米颗粒或微米颗粒包含聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚(P-氨基酯)、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇和其衍生物、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(二氧环己酮)、聚(亚垸基垸基化物)、聚乙二醇与聚原酸酯的共聚物、生物可降解聚氨酯以及任一前述聚合物的掺合物或共聚物，和脂质体。全文摘要本发明提供抑制粘连的组合物和方法。所述方法涉及将含有水凝胶前体(诸如多糖衍生物，例如透明质酸、纤维素或葡聚糖的衍生物)的溶液投与给个体例如因手术、损伤或感染形成粘连的部位处。所述水凝胶前体(例如多糖衍生物)在其投与后交联形成保持组织分离的水凝胶。在本发明某些实施例中，一种或两种溶液含有例如聚合纳米颗粒或微米颗粒的颗粒，从而形成含有所述颗粒的复合水凝胶。所述溶液、颗粒或二者可含有生物活性剂，诸如有助于抑制粘连的药剂。所述生物活性剂可与水凝胶前体共价连接。文档编号A61F13/00GK101448474SQ200780018405公开日2009年6月3日申请日期2007年4月12日优先权日2006年4月12日发明者丹尼尔·S·柯哈内,乔治·凯沃尔克·科多基安,伊都田一,允杨,罗伯特·S·兰格申请人:麻省理工学院;E.I.杜邦内穆尔公司;通用医院公司