专利名称：：别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及别隐品碱及其盐一种新的医药用途，更具体地说是别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用。.技术背景肝病主要包括脂肪肝，乙型/丙型的病毒性肝炎，血吸虫致肝病，酒精性肝病，肝硬化，肝癌等。据了解，我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高流行区，约7.5亿人感染过HBV，慢性HBV携带者约l.2亿人。血吸虫病是由于人或牛、羊、猪等哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种传染病和寄生虫病。主要对肝损害。它流行于70多个国家和地区，有2亿多人及大量牲畜感染。血吸虫致肝病、病毒性肝病、酒精性肝病等都有一个共同的致病过程，即肝纤维化一肝硬化一肝癌"死亡三部曲"。因此肝病的防治已成为我国面临的社会问题之一。解决肝纤维化问题成为防治肝病的关键核心。肝纤维化(Fibrosis)是一种病理状态，是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生(Fibrogenesis，即细胞外基质合成增加)和纤维分解(Fibrolysis，即细胞外基质降解)不平衡的结果，临床医生常将此同肝病慢性化等同提起来。1984年著名肝病学家HansPopper曾提出肝纤维性增生疾病。临床医生如何把这种状态与慢性肝病区别，对诊断、治疗及预后的判断将有很大的启发。肝纤维化是慢性肝损伤的代偿性修复反应，肝脏内结缔组织呈异常增生。生物化学测定表明，每可正常干组织湿重平均有5.5-5.6毫克的胶原。而肝硬化的肝脏高达20毫克以上。肝纤维化是慢性肝病进一步向肝硬化发展的主要中间环节，故阻止和逆转肝纤维的发展，促进肝纤维化的逐步分解吸收，不仅能减轻肝脏损害程度。而且能防止肝硬化的发生。各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25%-40%最终发展为肝硬化甚至肝癌。现在已知肝纤维化是一个可逆转的病变，而肝硬化是不可逆性病变。肝纤维化的治疗应包括祛除原发病因、抗肝纤维化及对症治疗三方面。最有效的治疗是病因治疗。然后这在临床上有时不易做到，且不少病例病因治疗后，主动性肝纤维化仍然继续发展。因此抗肝纤维化治疗是控制肝纤维化进展的重要途径。近年來人们对肝纤维化发病机制与不少的新认识和了解，目前认为肝纤维化形成和发展中肝星状细胞是主要效应细胞，起中心环节作用，参与细胞外机制(ECM)及细胞因子的调控，近来某些新干预研究已初步用于临床。如Rockey等报道Y-干扰素是肝星状细胞激活的强烈抑制剂；维甲酸也可能对肝星状细胞激活有抑制作用；a和Y干扰素可抑制肝星状细胞增生和机制蛋白的合成/或装配；基质金属蛋白酶的活性受生理性抑制物如a2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶抑制剂-1和-2的抑制；多不饱和卵磷脂对狒狒的酒精性肝病发展为肝纤维化有明显的保护作用；近来有人观察到Rwlatxin可降低胶原合成、刺激胶原酶的表达而显示抗肝纤维化作用；糖蛋白decorin可与TGFfU结合，可抑制TGFfU活性，有利于肝纤维化的改善；近年来国内报道中药复方等有抗肝纤维化作用。尽管治疗的药物很多，但目前尚未发现对肝纤维化有特效的药物。因此寻找确切有效的抗肝纤维化药物是今后努力发展的方向。目前，寻找保肝、护肝，逆转肝纤维化的天然药物研究逐渐成为全球热点。别隐品碱(Allocryptopine)是主要从罂粟科等植物中提取分离得到，或者化学合成得到。其药理作用主要为抗心律失常作用，对乌头碱引起的动物心律失常其抑制功效大于烟胺；能阻止乌头碱引起的动物心肌缺钾；静脉注射10mg/kg时,能阻止电刺激引起的动物心房纤维颤动。对葡萄球菌有强的抗菌活性纯度达到98%以上。别隐品碱熔点160161°。溶于乙醇、氯仿、乙醚、醋酸乙酯及稀酸。棱柱状结晶(醋酸乙酯)其分子式C21H23N05,分子量369.40，结构式本发明的目的在于提供别隐品碱及其盐的新的医药用途。，根据对血清小鼠血清中m型胶原(CIII)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)及血清羟脯氨酸(HYP)等指标分析，别隐品碱及其盐可以抑制修复肝纤维化，提供别隐品碱在制备治疗
发明内容肝纤维化药物中的应用。本发明的新的医药用途在于，提供了别隐品碱或其药用盐用作制备预防和治疗肝纤维化药物。别隐品碱对抗肝纤维化有明显的生物活性，但其在水中溶解性很低，而且易发生变化，因此，以盐形式存在既能保持其稳定性，而与有机酸或无机酸成盐增加在水中的溶解性，有利于抗肝纤维化的治疗。所述的别隐品碱的药用盐中包括药用无机酸盐、药用有机酸盐，无机酸可來自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸或氢溴酸；有机酸可来自醋酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、酒石酸、苹果酸、枸椽酸或咖啡酸。本发明的别隐品碱药用盐可以是从植物中(特别是罂粟科植物，如博落回、血水草等)提取别隐品碱，经反应得到的盐；或是直接从合成中反应的得到。由于本发明的别隐品碱或其药用盐在预防和治疗肝纤维化有很好地效果，可用于治疗哺乳动物，包括人。可有效地应用于包括血吸虫所致、酒精性、四氯化碳和二甲基亚硝胺所致的肝纤维化。本发明的应用还涉及预防和治疗抗血吸虫致肝纤维化的药物组合物，包括别隐品碱或其药用盐。所述的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本发明所述的药物剂型包括口服、注射剂型。所述的口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂，注射剂型包括粉针剂、注射液。具体的实施方式本发明别隐品碱的制备可以是取博落回果荚原药材，拣去杂质，称取20kg，加入酸水提取二次，每次3小时。然后用柱层析分离，加盐酸结晶分离得到纯度大于98%别隐品碱盐酸盐。或者是从血水草植物中提取，然后用柱层析分离，加硫酸结晶分离得到纯度大于98%的别隐品碱硫酸盐。实验分述如下1、小鼠口服别隐品碱急毒毒性试验昆明种小鼠一次灌胃，根据预试验，最高计量定位800mg/kg,，以1/2的比例递减，即为25、50、100、200、400、800mg/kg。5个计量组。连续观察14天，大剂量组(800mg/kg)药后5-10分钟活动稍减少，20分钟内，尸检可见心脏淤血，其他各脏器未见明显异常。存活者第15天全部解剖，肉眼检查主要脏器未见明显异常。死亡率用bliss法求得LD50为400mg/kg(置信度为95%).2、别隐品碱盐药效试验方案。2.1药物(1)别隐品碱盐酸盐(纯度达于98%)，试验前制备成lmg/mL浓度，再用倍比稀释法分别配成不同浓度。(2)秋水仙碱传统抗纤维化药物，用于治疗对照药(15mg/kg)(3)吡喹酮传统治疗血吸虫病药物，用于模型组杀虫(500mg/kg)2.2动物昆明种小鼠150只，雌雄各半。鼠重2022g，中南大学实验动物中心提供。2.3动物分组随机将动物分成2个组，第1组为正常动物对照组(20只小鼠)，其余为血吸虫致肝纤维化模型组(用日本血吸虫尾呦24条经腹部皮肤感染)。2.4试验方法与结果第l组为正常对照组，给予生理盐水等容积灌胃。其余造模成功的动物再随即分为第2第6组(共5组)，每组20只小鼠。自感染后第7周开始给予吡喹酮(500mg/kg'd)治疗2天，杀灭成虫。第2组，继续以生理盐水等容积灌胃。第14周末次给药24h后,将动物断颈处死，取肝脏称重后，备检。第36组按以下方法处理。第3组，为秋水仙碱组，自感染后第7周开始杀灭成虫，然后以15mg/kg-d的剂量灌服秋水仙碱，连续治疗，第14周末次给药24h后断颈处死，取肝脏称重后，备检。第4，5，6组分别为低、中、高浓度的别隐品碱盐酸盐治疗组，自感染后第7周开始杀灭成虫，然后入药剂量分别为25mg/kgA50mg/kg-d,100mg/kg'd。第14周末次给药24h后，断颈处死，取肝脏称重后，备检；检测指标与检测方法(1)肝组织病理形态学观察HE和VG染色后，用光学显微镜镜检，观察肝组织中胶原纤维的分布情况。(2)小鼠肝组织纤维化指标检测对小鼠模型血清中的III型胶原(cni)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)及肝组织中的羟脯氨酸(HYP)的含量指标进行免疫组化测定，检测方法按照Sigama公司提供的试剂盒中的步骤进行。(3)统计分析数据以x±s表示，组间比较采用完全随机的方差分析，P<0.01时有统计意义。2.5检测结果2.5.1指标检测结果见表1(N=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注**P<0.01与对照组比较；AAP〈0.01与模型比较由表1可以看出，与正常对照组相比，模型对照组中III型胶原、HA、LN的含量明显升高很多，这表明血吸虫虫卵导致了小鼠模型的肝纤维化形成；中高剂量组(治疗组4、5组)的药物效果可以使小鼠血清中的III型胶原和肝组织中的HYP含量显著降低，其中血清中的HA、LN含量降低效果以高剂量组的最好。说明别隐品碱对小鼠肝纤维化具有明显的降低III、HA、LN和HYP的作用，对实验性血吸虫致小鼠肝纤维化具有很好的疗效。2.5.2肝组织学观察结果正常对照组肝脏呈红褐色，质软，表面光滑，镜下肝组织的肝小叶结构完整。从模型对照组肝脏的病理切片中可见一定量的肝细胞损伤和较为明显的肝纤维组织增生(胶原纤维沉积)，由血吸虫虫卵引起的结节较严重，较多的虫卵肉芽肿病灶已纤维化,部分肝组织可见纤维疤痕形成及纤维铐化的虫卵结节,其中央为死亡钙化的虫卵,周围为增生的纤维组织,肝细胞索排列紊乱,并有假小叶形成。其余各组均可见不同程度的肝纤维组织增生，其中低剂量组的肝脏结缔组织增生，炎症反应,部分肉芽肿中心出现明显的纤维化，周围为增生的纤维组织，与模型组无太大差异。中剂量别隐品碱组胶原纤维减少不明显,但炎性细胞浸润及肝细胞坏死程度明显比模型组轻。高剂量别隐品碱组肝小结构清晰可见，仅见有零星肝细胞坏死和炎性细胞浸润，胶原纤维及成纤维母细胞明显减少，由此可见高剂量的别隐品碱对小鼠肝纤维化具有较明显的护肝和预防肝纤维化作用。以下为小鼠抗二甲基亚硝胺性所致急性肝纤维化动物实验纤维化试验，1.1药物(1)别隐品碱盐酸盐(纯度达于98%)，试验前制备成1mg/mL浓度，再用倍比稀释法分别配成不同浓度。(2)秋水仙碱传统抗纤维化药物，用于治疗对照药(15mg/kg)(3)二甲基亚硝胺(DMN)用于造模型(200mg/kg)1.2动物50只清洁级大鼠，wistar种，雌雄各半。鼠重160180g，中南大学实验动物中心提供。1.3动物分组随机将动物分成5个组，第1组为正常动物对照组(IO只)，其余为DMN致肝纤维化模型组)。第2组秋水仙碱药物对照组(10只)，第3组低浓度对照组(10只)25mg/kg，第4组中浓度对照组(10只)50mg/kg，第5组高浓度对照组(IO只)100mg/kg。1.4试验方法与结果第l组为正常对照组，给予生理盐水等容积灌胃。除正常组外，其余各组动物均进行肝纤维化模型制备以O.5XDMN溶液(1:199生理盐水稀释)按体重10mg/kg剂量腹腔注射，每周连续3天，每天l次，第l周每次用2/3剂量，以后用全量，共4周，在制备模型的同时，药物高、中、低剂量组和秋水仙碱治疗组均灌胃给药，每天1次，共四周，正常组和模型组均予等量生理盐水灌胃。第4周末处死动物，分离血清，待检；取肝组织切片观察。指标检测结果见表2(N=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注**P<0.01与对照组比较；AAP<0.01与模型比较由表2可以看出，与正常对照组相比，模型对照组中III型胶原、HA、LN的含量明显升高很多，这表明二甲基亚硝胺导致了大鼠模型的肝纤维化形成；药物对照组和低中高剂量组(治疗组3、4、5禾口6组)的药物效果可以使大鼠血清中的III型胶原、HA、LN含量和肝组织中的HYP含量显著降低。说明别隐品碱对大鼠肝纤维化具有明显的降低III胶原、HA、LN和HYP的作用，对实验性DMN致大鼠肝纤维化具有很好的疗效。肝组织学观察结果正常对照组肝脏呈红褐色，质软，表面光滑，镜下为正常结构。DMN对照组肝脏体积缩小，质硬，色黄，肝表面呈细小结节状，镜下为正常结构大部破坏，肝小叶结构紊乱，汇管区周围纤维化明显，沿肝板延伸形成纤维间隔，部分区域有桥样间隔形成。药物对照组和低中高剂量组肝小结构清晰可见，未见明显纤维化间隔形成，纤维组织增生明显减轻。综上所述，本发明通过从细胞学实验证实-对肝细胞症状明显减轻作用；通过动物实验说明别隐品碱对急性肝损伤具有保护作用。结果说明别隐品碱具有确切的抗肝纤维化作用，因此可用来制备预防和治疗肝纤维化的药物。权利要求1、别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，将别隐品碱或其药用盐用作制备预防和治疗肝纤维化药物。2、根据权利要求1所述的别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，所述的别隐品碱的药用盐中包括药用无机酸盐、药用有机酸盐。3、根据权利要求2所述的别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸或氢溴酸；有机酸选自醋酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、酒石酸、苹果酸、枸椽酸或咖啡酸。4、根据权利要求1或2或3所述的别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，别隐品碱药用盐是从罂粟科植物中提取别隐品碱，经反应得到的盐；或是直接从合成中反应的得到。5、根据权利要求1或2或3所述的别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，应用于治疗哺乳动物、人的药物。6、根据权利要求1或2或3所述的别隐品碱及其盐在抗肝纤维化中的应用，其特征在于，应用于包括血吸虫所致、酒精性、四氯化碳或二甲基亚硝胺所致的肝纤维化。7、一种预防和治疗抗肝纤维化中的药物组合物，其特征在于，包括别隐品碱或其药用盐。8、根据权利要求7所述的一种预防和治疗抗肝纤维化中的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。9、根据权利要求7所述的一种预防和治疗抗肝纤维化中的药物组合物，其特征在于，药物药物组合物剂型包括口服、注射剂型。10、根据权利要求7所述的一种预防和治疗抗肝纤维化中的药物组合物，其特征在于，所述的口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂；注射剂型包括注射液、粉针剂。全文摘要别隐品碱及其盐在抗肝纤维化治疗中的应用，本发明将别隐品碱应用于抗肝纤维化治疗。别隐品碱是从罂粟科植物(如博落回、血水草等)中提取分离得到的白色晶体，本发明通过从细胞学实验证实-对肝细胞症状明显减轻作用；通过动物实验说明别隐品碱对急性肝损伤具有保护作用。结果说明别隐品碱具有确切的抗肝纤维化作用，因此可用来制备预防和治疗肝纤维化的药物。文档编号A61P11/00GK101327211SQ200810031528公开日2008年12月24日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者利姚,曾建国,明钟申请人:长沙世唯科技有限公司