专利名称：：一种用于抗肝纤维化的复方中药制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及肝病治疗
技术领域：
，具体地说，涉及一种抗肝纤维化药物及其制备技术。
背景技术：
：肝纤维化是肝硬化的早期病理改变和必经阶段，各种致病因素引起的肝脏慢性损伤均可使肝星状细胞(Hepaticstellatecell，HSC)活化、增殖，分泌大量细胞外基质(extracellulermatrix,ECM)，使ECM的合成多于分解，在肝脏沉积而形成肝纤维化。肝纤维化如能早期诊断并予以积极合理治疗，仍然可以逆转、恢复正常。但是一旦发展成为肝硬化，将进行性加重，难以逆转，并可引起许多严重并发症，甚至发展为原发性肝癌，预后十分严峻。肝硬化属祖国医学"积聚"、"鼓胀"的范畴。病因病机复杂，病位主要在肝、脾、肾三脏。始因情志不畅，肝失疏泄，或因饮食不节，嗜酒过度，或虫积水毒所伤，或湿热邪毒内结，日久则肝脾受伤，失于疏泄，气机郁滞，横逆脾胃，乃至气滞血瘀，清浊相混，水湿内停久则及肾。肝、脾、肾三脏俱损，则气滞，血瘀，湿阻成本虚标实之证。换而言之，肝硬化的起因，开始多由于肝气郁结，病在气分；日久则肝血瘀滞，阻凝肝络，肝功能减退；继之则瘀凝益甚，肝络为之窒塞不通，于是损及脾胃，脾失健运，水湿内聚；进一步渐损肾阳；三焦气化失调，水湿内停，酿成鼓胀。晚期血脉瘀阻，气机痞塞，清浊交混，病情日渐加重。研究表明祛除病因后，肝纤维化仍可继续发展，因而有必要进行长期或终身的抗肝纤维化治疗调理。在防治肝纤维化的研究中，祖国医药由于其独特的作用机制和优越性而发挥着越来越大的作用。中医讲究整体调节，辨证施治。在肝纤维化阶段病人主诉和症状很多，但症状轻微，运用中医中药治疗，一方面改善症状，另一方面培本固元。中医药在改善临床症状，提高病人的生存质量及副作用较少等方面有优势，采用中医益气化瘀，清热解毒，健脾益气等治法，在早期阻断或延缓肝纤维化和防止肝硬化方面具有重要的意义。柴胡有和解少阳、升举阳气和疏肝解郁三大作用，《神农本草经》言其有"推陈致新"之作用，所含皂甙有抗肝损伤，降酶利胆等作用，古方小柴胡汤即以其为君药，后人在其基础上加减出了一系列治疗肝炎的方剂。综合分析柴胡制剂如小柴胡汤、柴胡注射液以及柴胡皂甙的实验研究与临床资料显示，柴胡制剂具有确切的抗肝病作用，主要机制为促进肝脏蛋白质合成、增加肝糖原、促进抗体产生、诱发干扰素、增强肝细胞再生、抗炎症反应、抗肝损伤等。甘草，又称"国老"，其主要成分之一的甘草甜素对大鼠实验性肝炎及肝纤维化的实验观察中，提示甘草甜素有促进肝细胞再生的作用，并可抑制纤维增生、降低肝硬化发生率及7—球蛋白的含量，对减轻肝脏间质的炎症反应有明显作用。姜黄素是中药姜黄的提取物，具有广泛的药理作用，如诱导肿瘤细胞凋亡、抗氧化、清除氧自由基等，近年来研究显示姜黄素具有抗肝纤维化的作用，为当前的一个研究热点。我们在以往的姜黄素抗肝纤维化系列研究中，从细胞水平证实姜黄素具有抑制HSC增殖、活化，诱导HSC凋亡的作用；并进一步从动物大体水平证实姜黄素可以预防并治疗四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化；在姜黄素抗肝纤维化过程中，肝脏组织中活化HSC明显减少，HSC凋亡数目增多。我们的系列研究结果显示姜黄素具有抗肝纤维化的作用，其抗肝纤维化作用的机制与抑制HSC活化增殖、诱导HSC凋亡有关。姜黄具有较佳之抗肝纤维化作用；柴胡舒肝解郁，调理气机；甘草补中益气、解毒和胃，与柴胡配合则有舒肝和胃解毒，抗肝损伤，防肝硬化之作用，配合姜黄使用，既使抗肝纤维化的作用更专一，又符合中医辨证论治，综合调治之宗旨°
发明内容本发明的目的在克服现有治疗肝病药物上存在的不足，提供一种组份简单、价格低廉、具有良好抗肝纤维化的复方中药制剂。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种用于抗肝纤维化的复方中药制剂，由如下组分和重量份数组成柴胡5-40，姜黄5-40，黄芩5-40，法半夏5-40。在上述用于抗肝纤维化的复方中药制剂中，还可以添加炙甘草、人参和生姜，其重量份数分别是炙甘草5-40，人参5-40，生姜5-40。在上述用于抗肝纤维化的复方中药制剂中，最佳的组份和重量份数比例是柴胡10，黄芩10，姜黄15，炙甘草10，法半夏10，人参10，生姜10。本发明的复方中药制剂的制备方法是采用煎煮，具体包括如下步骤将各个药材按比例混合，加水搅拌后浸泡；然后武火煮沸后文火煎煮，去渣即可。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果姜黄具活血行气解郁、清肝利胆之功，有较强之护肝退黄之效，临床广泛用于急慢性肝炎、肝硬化、肝癌；姜黄素则具有较佳之抗肝纤维化作用。柴胡舒肝解郁，调理气机，《神农本草经》言其有"推陈致新"之作用，所含皂甙有抗肝损伤，防止纤维增生和脂变，降酶利胆等作用。现有技术公开柴胡、姜黄、炙甘草均具有治疗肝病的作用，但是单独一个药材并没有抗肝纤维化的效果或是效果较差。本发明经过大量的实验研究，将柴胡、姜黄和黄芩及其他组份配合起来，调整其合适配比，制得的复方中药制剂在抗肝纤维化上疗效显著。本发明的复方中药制剂在抗肝纤维化疗效上优于小柴胡汤和姜黄，是一种更安全、廉价、高效的治疗肝纤维化药物。具体实施例方式实施例l复方中药制剂的制备柴胡9克，姜黄6克，黄岑9克，法半夏9克。药材分别加水700ml搅拌后浸泡30分钟，武火煮沸后文火煎煮30分钟去渣成200ml即可。大鼠按照lml/100g体重灌胃。实施例2复方中药制剂的制备柴胡28克，黄芩30克，人参9克，炙甘草10克，法半夏19克，生姜20克，姜黄12克。药材分别加水700ml搅拌后浸泡30分钟，武火煮沸后文火煎煮30分钟去渣成200ml即可。大鼠按照lml/100g体重灌胃。实施例3复方中药制剂的制备柴胡10克，黄芩10克，姜黄15克，炙甘草10克，法半夏10克，人参10克，生姜10克。药材分别加水700ml搅拌后浸泡30分钟，武火煮沸后文火煎煮30分钟去渣成200ml即可。大鼠按照lml/100g体重灌胃。实施例4抗肝纤维化实验1.动物实验条件饲养及实验人员进入动物实验室时必须严格遵守无菌实验室规章制度，穿隔离衣，戴无菌口罩及手套，并经消毒间和缓冲带方可进入实验区。实验动物进入实验室后，由专人喂养，自由饮水、进食，定时光照，每日消毒，动物饲养适应一周后开始实验。2.肝纤维化模型的建立每只大鼠腹腔注射CC140.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周。3.实验分组及处理150只SD大鼠适应饲养一周后，随机分为以下8组A组(正常对照组)20只大鼠，常规饲养，不作其它处理，于第8周结束后处死5只大鼠，其它大鼠共饲养14周。B组(溶剂对照组)20只大鼠，腹腔注射花生油(0.15ml/只/次)，每周3次，共14周，于第8周结束后处死5只大鼠。C组(模型对照组)20只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第8周结束后处死5只大鼠。D组(实施例l):15只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起予复方中药1号方按lml/100g体重灌胃，每周3次，共6周。E组(实施例2):15只大鼠，腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起予复方中药2号方组按lml/100g体重灌胃，每周3次，共6周。F组(实施例3):IO只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起予复方中药3号方组按lml/100g体重灌胃，每周3次，共6周。G组(小柴胡汤对照组)15只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起按lml/100g体重予以小柴胡汤灌胃液灌胃，每周3次，共6周。H组(复方鳖甲软肝片组)15只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起按lml/100g体重予以复方鳖甲软肝片胃液灌胃，每周3次，共6周。I组(姜黄对照组)15只大鼠，腹腔注射CCU0.025ml(用花生油1:6稀释)，每周3次，共14周，于第9周起按lml/100g体重予以姜黄液灌胃，每周3次，共6周。动物实验共14周，留取标本后进行相关指标检测。4.标本收集动物实验结束后，试管编号，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝剂的普通干净玻璃试管中。静置使其充分凝固，离心分离血清，置于-2(TC保存待检；剖开大鼠腹腔暴露肝脏，留取肝脏左叶，留取部分肝组织于4%中性福尔马林液固定，部分于-170°C液氮中保存待检。5.血清学检测血清分离后于一80°C冰箱保存待测。肝功能指标ALT、AST及ALB采用全自动生化分析仪自动检；肝纤维化指标HA、LN、PC-m采用智能放免7测量仪自动检测；生长因子TNF-o;、TGF-/31采用双抗夹心ELISA方法检测；6.新鲜肝组织MDA、SOD、Hyp检测参照测定试剂盒说明书进行测定；7.肝脏病理学观察7.1.HE及Masson胶原染色常规制作石蜡切片，厚度3/mi，裱片于普通载玻片上常规行HE染色及Masson胶原染色，并各组大鼠肝纤维化程度评分，得分越高，表示纤维化程度越重；7.2免疫组织化学染色采用sabc方法分别进行i型、m型胶原蛋白免疫组织化学染色。8.统计分析数据采用Mean士SD表示，使用SPSS12.0统计软件统计分析。P<0.05为差异具有显著性。9.造模结果比较第8周末处死的正常组与模型组大鼠，模型组大鼠肝脏大体观色泽偏暗，表面油腻、欠光滑，体积未见明显变化，肝脏边缘变纯，质地较实，有结节感；血清ALT、AST、HA、LN、PC-III明显升高；病理切片观察有较多纤维生成，证实肝纤维化形成，造模成功。9.1血清学检测9丄1肝功能指标(ALT、AST及ALB)的变化(见表l)表1各组大鼠血清ALT、AST活性及ALB含量的比较(；±幻Hi]动物数ALT(U/L)AST(U/L)ALB(U/L)A:正常组1539.22±5.00656.67±1.55433.44±1.990B:阴性对照1536.34±3.34579.34±2.67834.23±2.345C:模型组13567.45±2.678#334.23±3.124#28.34±3.245#D:l号方组14270.35士1据※125.73士2.622※29.18±1,96*E:2号方组15247.53士3.154※91.25土2.553※30.06±2.529*F:3号方组15158.64土4.862※^85.49土2.396※^32.37士2.702※0G:小柴胡汤组14269.45士1.733※126.45士2扁※29.45士1.00※H:复方鳖甲组1378.56士1,745※76.23士1篇※3L76士2.78※I:姜黄组15273.48士2.61※130.15土2.64※30.81士2.49※与模型对照组比较，*P<0.05，※PO.01;与正常对照组比较，#P<0.01;与小柴胡汤组比较0尸<0.05结果显示较之A组、B组，C组大鼠血清中ALT、AST活性含量明显升高，而ALB含量有所降低，差异具有统计学意义；D、E、F、G、H禾口I组与C组相比，升高的ALT、AST下降明显，其下降的幅度随着姜黄剂量的增大而增大，差异具有统计学意义。9丄2血清肝纤维化指标的变化(见表2)表2各组大鼠血清HA、LN、PC-III的比较(x±S)组别动物数HA(mg/L)LN(mg/L)PC-III(ug/L)A:正常组15214.2±41.9228.2±7.92120.9±15.72B:阴性对照15217.4±32.6732.9±8.78112.9±12.88C:模型组13423±12.91#296.3士48.97#255.73±67.91#D:l号方组14260.8i41.63※171.6±24.56※150.8±89.06*E:2号方组15251.4±13.68※158.6±8,61※145.1土90.29※F:3号方组15227.3士43.61※C36.4士14J3※C135.7土90.43※0G:小柴胡汤组14350.4±58.45*243.7士13.16*160.9±50.86※H:复方鳖甲组13234.2士35.22※144.8±7.42※173.55±30.93※I:姜黄组15314.26i48.34※200.43士15.26※169.22士72.61※与模型对照组比较，*f<0.05，※PO.01;与正常对照组比较，#户<0.01;与小柴胡汤组比较O化0.05结果显示较之A组、B组，C组大鼠血清中HA、LN、PC-m水平明显升高，差异具有统计学意义；D、E、F、G、H和I组与C组比较，升高的HA、LN、pc-m呈不同程度地降低，差异具有统计学意义。9.2新鲜肝组织MDA、SOD、Hyp检测(见表3)表3各组大鼠肝组织MDA、SOD及Hyp的的比较(；士幻<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与模型对照组比较，*尸<0.05，※i^0.01;与正常对照组比较，#尸<0.01;与小柴胡汤组比较0尸0.05结果显示较之A组、B组，C组大鼠血清中MDA、Hyp水平明显升高，SOD活性明显下降，差异具有统计学意义；D、E、F、G、H和I组与C组比较升高的MDA、Hyp水平不同程度地降低，降低的SOD含量不同程度升高，差异具有统计学意义。9.3肝脏病理学观察9.3.1肝脏大体观察处死动物后取得肝脏，吸干表面血液，肉眼下观察各组肝脏。A、B组无明显差别，肝脏颜色鲜红，表面光滑，边缘锐利，与周围组织无粘连、易分离，质地软、脆，触之易碎；C组体积多无明显改变，部分有明显增大，颜色呈暗红，表面有泥沙样结节，肝脏边缘明显变钝、厚，质地较实，触之硬、韧，不易碎，多与大网膜粘连，不易分离。D、F、I组外观好于C组，颜色偏暗，部分体积增大明显；F、G、H组接近正常组肝组织；9.3.2HE染色A组、B组肝小叶结构完整，肝细胞大小均匀，无变性、坏死，无炎细胞浸润，肝索排列整齐；C组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎细胞浸润，肝细胞气球样变性、脂肪变性明显，多分布于界板周围，可见较多双核肝细胞，汇管区纤维组织明显增生，部分可见假小叶形成。D、E、I组与造模组比较，无明显差异；F、G组和H组可见汇管区有少量的纤维组织增生，未见假小叶形成，可见少量炎细胞浸润，肝细胞气球样变性、脂肪变性较C组明显减轻；9.3.3Masson胶原染色A、B组仅在血管壁、汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成；C组见汇管区大量胶原纤维增生，分布广泛，增生的胶原纤维形成纤维分隔，部分相互连接形成较粗大的纤维间隔，可破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶，有假小叶形成。D、G、I组与造模组比较，胶原纤维减少；有差异。E、F、和H组胶原纤维明显减少，与模型组有显著差异。只见汇管区有较多的纤维组织增生，少部分亦见胶原向周边延伸，无假小叶存在；9.3.4肝纤维化半定量评分(SSS)综合HE及Masson染色的镜下表现，按照肝纤维化半定量评分方法，进行单盲读片并予以评分。各组得分结果见表4。结果显示A、B组得分无统计学差异；C组肝纤维化评分明显升高；D、E、F、G、H和I组得分呈不同程度降低，与C组比较，差异均具有统计学意义。表4各组SSS评分结果比较(^±幻SSS得分A:正常组0.143±0.242B:溶剂组0.120±0.316C:模型组21.722±7.488#D:l号方组14.533士4.831※E:2号方组12.648士3細※F:3号方组11.824士5.683※0G:小柴胡汤组16.313士6.676※H:复方鳖甲组7.250士3.676※I:姜黄组14.88士4.69※与模型对照组比较，*户<0.05，※PO.01;与正常对照组比较，#P<0.01;与小柴胡汤组比较，0尸<0.059.3.5I型、III型胶原蛋白免疫组织化学染色阴性对照片未见阳性表达，阳性对照片可见阳性表达。A、B组肝脏I、m型胶原阳性染色有少量表达，i型胶原主要分布于汇管区的结缔组织和中央静脉管壁，m型胶原主要在大血管管壁。c组肝脏i、m型胶原阳性染色表达显著增加，广泛存在于纤维间隔及肝细胞内；I型胶原为宽而粗大的纤维条索，免疫组化强阳性，相比之下，m型胶原为较纤细条索；与c组相比，D、E、F、G和I组病变程度显著减轻，I、III型胶原的量增加逐渐减少；H组仅见到有少量的纤维存在，且条索短，但与A、B组仍有差别。通过彩色图像分析软件自动分析得出阳性部分所占面积比，结果如表5结果显示比较A、B两组，阳性染色所占面积比例无统计学差异；C组阳性染色所占面积比例明显升高；D、E、F、G、H和I组的阳性表达面积比例均有不同程度降低，各组与C组相比差异均有统计学意义。表5各组免疫组化图像分析面积百分比(％)_组别i型胶原in型胶原A:正常组0.739±0.4520.712±0.345B:溶剂组0.872±0.4690細±0.469C:模型组13.041±1.346#11.637士1.654弁D:l号方组6.362士1.553※5.961士2.534※E:2号方组4.966士0.853※3.668士0.821※F:3号方组3.153士3.022※C3.296士2.349※^G:小柴胡汤组6.756士1,306※7.796±1.452*H:复方鳖甲组3.328士0.861※3.699士1.093※I:姜黄组_6.496士1.244※5.337士2.164※与模型对照组比较，*尸<0.05，※PO.01;与正常对照组比较，#P<0.01;与小柴胡汤组比较，0尸<0.05。权利要求1.一种用于抗肝纤维化的复方中药制剂，其特征在于包括如下组分和重量份数柴胡5-40，黄芩5-40，姜黄5-40，法半夏5-40。2.如权利要求1所述的用于抗肝纤维化的复方中药制剂，其特征在于还包括炙甘草5-40，人参5-40，生姜5-40。3.如权利要求1所述的用于抗肝纤维化的复方中药制剂，其特征在于柴胡IO，黄芩IO，姜黄15，法半夏IO，炙甘草IO，人参IO，生姜IO。4.权利要求1所述复方中药制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤将各个药材按比例混合，加水搅拌后浸泡；然后武火煮沸后文火煎煮，去渣即可。全文摘要本发明公开了一种用于抗肝纤维化的复方中药制剂及其制备方法。用于抗肝纤维化的复方中药制剂，由如下组分和重量份数组成柴胡5-40，姜黄5-40，黄芩5-40，法半夏5-40。本发明经过大量的实验研究，将柴胡、姜黄和黄芩及其他组分配合起来，调整其合适配比，制得的复方中药制剂在抗肝纤维化上疗效显著。本发明的复方中药制剂在抗肝纤维化疗效上优于姜黄和小柴胡汤，是一种更安全、廉价、高效的治疗肝纤维化药物。文档编号A61K36/9066GK101664539SQ20091019214公开日2010年3月10日申请日期2009年9月8日优先权日2009年9月8日发明者何雅军,霞吕,舒建昌,黎成科申请人:舒建昌