用于制备放射性药物组合物的通过多胺接枝的多糖的制作方法

专利名称：用于制备放射性药物组合物的通过多胺接枝的多糖的制作方法
用于制备放射性药物组合物的通过多胺接枝的多糖本申请要求享有美国临时申请第60/952094号的利益，该申请在2007年7月26 日提交，为了所有目的通过弓I用将其完整地并入本文。本发明涉及基于接枝的多糖的新药物组合物，并涉及所述组合物在医学成像、特 别是在闪烁照相术和体内放射治疗中的用途。放射性元素的载体颗粒已在药物和生物学领域中使用了很长时间(关于一般综 述，参见H^feli, 2001)，例如用于通过充足尺寸的非可吸收的微粒(几十微米)估计组织 血流，一旦所述微粒被注射入血管网，其隐蔽在遭遇的第一毛细管网中。尽管所述颗粒可以 玻璃颗粒的形式使用，例如(H3feli等人，1999)，以将特定组织(特别是肿瘤组织)暴露 于电离辐射，但所述颗粒是不可吸收的，这意味着不可能在诊断水平上发展常规体内应用， 并且通常也不可能在治疗水平上发展常规体内应用(当不期望靶组织的完全缺血时)。
微粒在人中最普通的体内用途是用于肺栓塞的闪烁照相诊断。这种普通疾病(在 美国每年有约650000个新病例)由最常常来自下肢的血凝块导致，其通过静脉系统移行， 通过右心并阻断肺部毛细管。如果栓塞是大量的，存在心泵衰竭的风险。为了有效和预防 大栓塞，必需早期检测小栓塞以执行延时抗凝血药治疗方案。X射线螺旋计算机体层摄影术 (X射线扫描仪)是近几年已经广泛使用的方法，但是其在外周栓塞方面表现不良。此外，胸 暴露的电离辐射的剂量能够导致乳癌。因此灌流闪烁照相术目前保留其地位，由气溶胶或 由放射性气体评价通气。历史上，已知可吸收的颗粒的第一类用途之一是使用用99mTc标记的氧化铁颗粒的 肺部灌流闪烁照相术(US 3962412和US 4057616)。这种使用Fe2+铁离子的方法实现了过 锝酸盐的减少和对氧化铁和氢氧化物键合的良好水平，这形成颗粒的核心。但是，这种类型 的技术的缺陷之一是难于得到约几十微米的均勻尺寸。此外，冷冻干燥以标记试剂盒的形 式使用的所述制备物的方法也是需要技巧的。使用蛋白可代替所述颗粒的使用，作为颗粒基质(US 3663685)，特别是卵白蛋白 或血清白蛋白(US 4024233)。存在用于得到均勻尺寸的方法(例如US 6709650)，该方法 通常在制备方面具有相对高水平的复杂性，这导致显著水平的批间差异性。此外，使用碘和 锝标记是相对简单的被证实的方法(例如US 4410507)。在临床实践中，这些产品目前被广 泛用于诊断肺栓塞。但是，对于在人中使用，特别是在静脉内注射之后在肺部灌流闪烁照相 术中，这些颗粒具有3个显著局限性-原位降解动力学常常持续多于4小时的相对长的时期。在使用纤溶剂静脉内治 疗方面，这种持续时间比更短的时期(1至2小时)更不适合，这允许早期诊断和允许在治 疗之后立即随后检验有效性；-这些颗粒可以是免疫原，并且这是优选使用人来源的蛋白的原因；-无论这些颗粒是人来源的还是动物来源的，所有这些制剂潜在地具有传递接触 传染物的风险，特别是病毒接触传染物(HIV、肝炎等)和朊病毒(引起Kreutzfeld-Jacob 病等的非常规可传染因子)，这种传递目前非常难于预防。一个增加安全性的方法是仅仅用 已被保存6个月的白蛋白溶液制备颗粒。除了涉及的附加的花费，这种预防不是完全可靠的，因为供血者之一可以经历血清转变或可以随后声称有疾病，因此在若干年的沉默潜伏期之后(在非常规可传染因子的情况下)可以被发现是携带者(潜在的污染物)。某些团队已经提出使用脂质体，其具有非毒性的特定优势。但是，产生在冷冻干燥 和重构期间稳定的大脂质体(几十微米)是极其困难的。此外，有3个用于标记脂质体的 广泛使用的方法将放射性产品掺入囊泡的内部(在制备期间或使用在内部成为亲水性的 亲脂产品，例如I’ HMPAO-99mTc),使用脂双层的脂肪族核心作为疏水产品的保留系统(例如 111In-喔星)或如在I’ HYNIC-99mTc的情况下的表面接枝络合剂。在上述所有情况下，由于 脂质体的不稳定性，获得良好程度的标记是困难的。为了绕过这些局限性，提议使用完全合成的生物可降解聚合物(ES2096521， Delgado A.等人，2000)。但是，甚至在作者自身来看，使用聚酯难以获得稳定的标记和冷冻 干燥和释放动力学的良好水平的重现性。得到有益的聚合物和颗粒的可实现的方法是使用天然或人造多糖(US 3663685， US 3758678)。某些所述多糖的植物或微生物来源确保没有来自动物界的病原体的传递。除 了它们可以易于制备和低成本(它们中大部分是这样)，其丰富的化学使它们的生物降解 过程易于控制。因此，专利申请FR 2 273 516公开了使用支链淀粉微载体珠，所述支链淀粉微载 体珠是由表氯醇交联的并且是由99mTc标记的，用于肺部灌流闪烁照相术。但是，支链淀粉 羟基基团与锝形成弱键，并且不允许实现稳定的标记。此外，已知用于交联的表氯醇具有高 毒性，并是致突变的。也公开了由放射性元素通过包括至少1个硫原子的胺络合系统接枝的淀粉颗粒 (FR 2 797 769)。通过络合基团的放射性元素的络合比率似乎为相对令人满意的，但是描 述的特定制剂显示非常快的降解动力学(小于10分钟)，其是在体层摄影术方面的限制因 素。降解动力学表现为部分依赖于选择的玉米淀粉的氧化比率和接枝比率。此外，它们似 乎具有有限的保存稳定性。最后，描述于这个文件的络合基团是相对复杂的结构，其可能需 要若干阶段的化学合成，其可以增加放射药物组合物的毒性的风险和其制备成本。在毒理 学水平，没有鉴定研究的化合物的降解的代谢途径，所述途径可以是潜在危险的次级化合 物的来源。更通常地，已固定放射性原子的多糖聚合物用作放射性标记试剂(用99mTc标记的 右旋糖酐)，所述放射性标记试剂用于血管和/或间质区域(作为右旋糖酐分子量的函数， Kellaway I. W.，等人，1995)，作为通透性指示物(Akgim A.等人，2005)或用于检测警戒淋 巴结(Paiva G.R.等人，2006)，作为允许在体内放射治疗使用中增加放射性原子的量的试 剂(用偶联至蛋白的131I碘化的右旋糖酐，Andersson A.等人，1992)和甚至作为允许增 加放射性示踪剂的肾清除以在用于使用肽或抗体的活性向量化中增加信噪比的试剂(用 99mTc标记的右旋糖酐，Line B. R.，等人，2000)。根据第一目的，本发明涉及包含具有一个或多个式(I)或(II)的络合基团的多糖 的组合物，所述络合基团共价键合至所述多糖 在式(I)和(II)中R0表示氢原子或C1-C6烷基基团；R1, Ra相同或不同，表示氢原子、线性或支链C1-C6烷基基团，并且以相同或不同方 式任选由一个或多个卤素原子(氟、氯、溴、碘)、烷基、烯基、氧代、-C( = O)ORq、-C( = O) Ro、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、烷基(C1-C6)氨基、二烷基(C1-C6)氨基、膦、磷酸酯、膦酸 酯、二膦酸酯基团或非硫化的肽基团取代；或Rp Ra相同或不同，表示-c( = 0)0Rq、-C( = 0)R。、肟基团、非硫化的肽基团、膦
酸酯基团或二膦酸酯基团；Rb表示氢原子、线性或支链C1-C6烷基基团，其以相同或不同方式任选由一个或多 个卤素原子(氟、氯、溴、碘)、烷基、烯基、氧代、C( = 0)0R0, -C( = 0)Rtl、羟基、烷氧基、硫 代、烷硫基、膦、磷酸酯、膦酸酯、二膦酸酯基团或肽基团取代，或Rb表示-C( = 0)0Rq、-C( = 0)R。、肟基团、肽基团、膦酸酯基团或二膦酸酯基团；L1表示线性或支链C1-C6亚烷基基团、线性或支链C2-C6亚烯基基团、亚芳基或双亚 芳基基团，并且当η > 1时，所述基团L1可以相同或不同，任选由一个或多个氧原子间隔， 当η > 1时，所述基团L1能够以相同或不同方式由一个或多个卤素原子(氟、氯、溴、碘)、 烷基、烯基、氧代、-C( = 0)0R0,-C( = 0)Rtl、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、烷基(C1-C6)氨 基、二烷基(C1-C6)氨基、膦、磷酸酯、膦酸酯、二膦酸酯基团或非硫化的肽基团取代；L2表示线性或支链C1-C6亚烷基基团、线性或支链C2-C6亚烯基基团、亚芳基或双亚 芳基基团，当η > 1时，所述基团L2可以相同或不同，任选由一个或多个氧和/或硫原子间 隔，并且当η > 1时，所述基团L2能够以相同或不同方式由一个或多个卤素原子(氟、氯、 溴、碘)、烷基、烯基、氧代、-C( = 0)0R0, -C( = 0)Rtl、羟基、烷氧基、硫代、烷硫基、膦、磷酸 酯、膦酸酯、二膦酸酯基团或肽基团取代；η是在1和6之间的整数，m和ρ相同或不同，可以是0、1或2，m和ρ各自优选表 示0，式(I)或(II)的所有或部分所述基团与至少一种多价金属形成络合物。这些组合物特别的优势是，它们允许实现所述多价原子的提高比率的络合，这允 许在放射性原子方面减少给予患者的放射药物组合物的剂量、改善医学成像方法中的图像 质量和减少毒理学风险。此外，这些组合物具有非常好的肺部采集，在使用剂量下无毒性，可通过生物清除 的已知方法容易地生物降解，可灭菌，并且可以包装成诊断盒的形式。根据本发明的多糖优选以优选球形颗粒的形式，特别是微粒或纳米粒的形式存在。对于毛细管阻断应用(例如肺部灌流闪烁照相术，例如肺栓塞的闪烁照相诊断)来说，颗粒尺寸可以为IOnm至200 μ m，优选为10至100 μ m，更优选约40 μ m。纳米粒，即 那些具有小于Iym的尺寸的颗粒(特别是那些具有在10和500nm之间的尺寸的颗粒，特 别是那些具有约40至SOnm的尺寸的颗粒)，特别适用于根据本发明的组合物的组织内给 药，例如检测岗哨神经节的存在和/或使岗哨神经节显影，用于淋巴闪烁照相术，用于在静 脉内注射之后产生骨髓或淋巴神经节的成像(“标记的胶体闪烁照相术")或还用于在体 内放射治疗中通过所述多糖进行组织的照射。微粒，即那些具有约Iym和更大的尺寸(至多约ΙΟμπι)的颗粒，可以静脉内给 予，特别适用于通过医学成像使单核吞噬细胞系统(例如肝、骨髓)显影或还用于通过体内 放射疗法治疗肝或脾肿瘤。根据本发明可以使用的多糖优选是天然来源的，特别是植物或微生物学来源的。 实例具体包括，淀粉、纤维素、支链淀粉、直链淀粉、琼脂糖、普鲁兰、脱乙酰壳多糖或右旋糖 酐和上述物质的衍生物以及上述物质中的2种或更多种的混合物；淀粉是特别优选的。有利地是，相对于那些以蛋白(例如人白蛋白)和明胶(通常为猪明胶)为基 础 的组合物，多糖减少放射药物组合物的微生物学风险。另一个优势是，根据多糖的氧化比率 或接枝比率，可以调节原位降解动力学，这在使用蛋白的情况下是难以用可再现的方式实 现的。淀粉可以是，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉或小米淀粉等，或衍 生物，例如羟基乙基美沙酮(HES)，其在静脉内注射之后缓慢降解，使其在血容量过低性休 克的情况下可以用作血管填充溶液。这种产品不激活补体，因此不导致继发效应的产生。优选地，络合基团是式⑴的基团，其中队和/或艮表示氢原子。优选地，η是1、2或3。优选地，m或ρ值中的至少一个表示0或m和ρ各表示0。优选地，L1是亚烷基基团，特别是C2-C5亚烷基基团。特别优选的式⑴的络合基团的实例特别包括那些通过将腐胺NH2(CH2)4NH2、精胺 H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NH2、亚精胺 NH2 (CH2) 3NH (CH2) 4NH2 或尸胺 NH2 (CH2) 5NH2 与氧化的多 糖共价键合得到的基团。这些络合基团是特别有优势的，因为它们衍生自生物起源的多胺，即那些存在于 生物学介质中的多胺，并且这减少组合物的毒性的风险，因为这些产品的降解方法是众所 周知的。此外，这些内源性多胺是商业上以低成本可获得的。络合基团的比例可以是基于多糖的单糖单元的0. 1至200%，优选10至100%。本组合物中存在的多价金属可以选自金属元素，所述金属元素具有20至33的原 子数、38至51的原子数、56至84的原子数或88至103的原子数。多价金属的非限制性实例包括锝的放射性同位素，例如99mTc，94Tc或94mTc,铼的放 射性同位素，例如188Re或186Re,铜的放射性同位素，例如6°CU、61Cu、64Cu或67Cu,锶的放射性 同位素，例如89Sr、铟的放射性同位素，例如111In或113In,钐的放射性同位素，例如153Sm,锡 的放射性同位素，例如113mSn,钪的放射性同位素，例如44Sc,钇的放射性同位素，例如90Y或 86Y,镓的放射性同位素，例如67Ga或68Ga,钆的放射性同位素或镥的放射性同位素，99mTc是特 别优选的。优选地，根据本发明的组合物也含有药用可接受的载体或赋形剂。
优选地，所述组合物包含有效量的通过本发明式(I)或(II)的络合基团采用放射 性元素标记的多糖。根据本发明的组合物优选是药物组合物和/或诊断用组合物。根据本发明的药物组合物可以适于肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、间质、脑内、鞘内或肺内给药，适于通过ORL球、眼、阴道或直肠黏膜或甚至经肠(胃运输)和通过气溶胶 给药的形式存在。它们将因此以溶质、溶液或可注射的悬浮液的形式或以单个或多个剂量散剂或小 瓶的形式存在。为了肠胃外使用，水、水性溶液、生理血清和等渗溶液是最方便使用的载体。可以通过应用或调整本身是已知的和/或在本领域技术人员知识范围之内的任 何方法(特别是那些由 Larock 在 ComprehensiveOganicTransforms，VCH Pub.，1989 中描 述的方法)，或通过应用或调整在下列实施例中描述的方法，制备根据本发明的组合物。根据另一个目的，本发明因此也涉及用于制备根据本发明的组合物的方法，所述 方法包括以下步骤i)使多糖与受控制的氧化剂接触；ii)使氧化的多糖与式(Ia)或(IIa)的化合物接触 其中I^LpIVIVI^Rb、!!!、!!和P如上文所定义，以制备包括共价键合至所述多糖 的式(I)或(II)的络合基团的多糖；iii)任选地，使得到的多糖与还原剂接触；iv)使得到的多糖与多价金属盐接触。根据本发明的方法通常在室温，在水中进行。可以使用的受控制的氧化剂的实例具体包括高碘酸盐，例如高碘酸钠。还原剂的实例具体包括硼氢化钠。不意欲受限于任何具体的理论，多糖的受控制的氧化导致羰基功能的形成，其分 另Ij与式(Ia)或(IIa)的化合物的HN-或HS-基团反应。作为实施例，在受控制的氧化之后，淀粉导致醛功能的形成，其可以与腐胺、精胺、 亚精胺或尸胺的H2N-基团反应，以在还原之后，显著地形成亚胺共价键(-CH = N-)。使得到的多糖与多价金属盐接触(标记反应)的步骤iv)可以实施，在锡、硼酸盐 和衍生物或抗坏血酸类型的还原剂，或任何其它有效地还原放射性多价金属盐(特别是在 锝的情况下)手段的存在下，使用99mTc标记进行所述步骤是有优势的。式(Ia)或(IIa)的衍生物，其中L1, L2, R0, R1, Ra、Rb、m、η禾口 ρ具有与上述式(I) 或(II)中相同的含义，是商业上可获得的或以描述于文献的方法为基础而制备。
根据本发明的方法也可以包括制备的组合物的随后的分离步骤。根据另一个目的，本发明涉及上文定义的组合物的用途，特别是在制备用于医学、 人或兽医学成像的诊断用组合物中的用途，所述成像特别是单光子、双光子或甚至多光子 闪烁照相成像。根据本发明的组合物也特别适用于使患者或动物中的一个或多个器官显影，例如 肺、肝、脾、骨髓或淋巴结。某些根据本发明的组合物也可以用于使警戒淋巴结显影。根据另一个目的，根据本发明的组合物可以用于制备药物组合物，所述药物组合 物用于在患者或动物中通过体内放射疗法治疗癌症，特别是用于治疗淋巴结或者肝肿瘤或 脾肿瘤。 在本文的上下文，通常使用本发明的组合物以将癌性肿瘤，特别是肝和/或脾或 淋巴淋巴结的癌性肿瘤暴露于电离辐射。根据另一个目的，本发明涉及包含一个或多个式(I)或(II)的络合基团的多糖， 所述络合基团共价键合至所述多糖，该多糖如上文所定义。这些多糖实际上特别适用于制备根据本发明的组合物。本发明也涉及包含一个或多个式(I)或(II)的络合基团的多糖，所述络合基团共 价键合至所述多糖，根据如上文所定义的方法的步骤i)至iii)可制备所述多糖。如上所使用的和在本发明的整个描述中，除非另有说明，术语应理解为具有下列 含义术语“多糖”表示从多个单糖单元，特别是10至1000个单糖的连接产生的聚合物。根据本发明，烷基基团是直链或支链饱和烃基团，含有1至6个碳原子，优选1至 4个碳原子。线性(直链)基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基基团。作为支链基团或由一个或多个烷基基团取代的基团可以特别提及的是异丙基、叔 丁基、2-乙基己基、2-甲基丁基、2-甲基戊基和1-甲基戊基基团。根据本发明的烷氧基基团是式-0-烷基的基团，所述烷基如本文之前所定义。根据本发明的烷硫基基团是式-S-烷基的基团，所述烷基如本文之前所定义。亚烷基基团是含有1至6个碳原子的支链或线性二价烃基团。亚烯基基团是直链或线性二价烃基团，含有一个或多个乙烯不饱和。亚烯基基团 特别包括-CH = CH-、-CH2CH = CH-、-C(CH3) = CH_、-CH2CH = CHCH2-基团。亚芳基表示含有6至10个碳原子的二价单环或双环芳香烃基团。亚芳基基团特 别包括亚苯基或亚萘基基团。双亚芳基表示二价系统，其包括2个含有6至10个碳原子的单环或双环芳香烃基 团。双亚芳基基团特别包括亚联苯基或亚联萘基基团。


fil:在荧光胺的存在下，使用光学荧光显微镜观察到的尸胺与淀粉颗粒的偶联。图2和3 静脉内接受用4MBq 99mTc标记的20%氧化淀粉颗粒的大鼠在刚刚注射 之后(图2)和在15分钟之后(图3)的典型闪烁照相成像(前部投影)。
图4、5、6 静脉内接受用4MBq的99mTc标记的偶联至尸胺的50%氧化淀粉颗粒的大鼠在注射后15分钟(图4)、30分钟(图5)和90分钟后(图6)的典型闪烁照相成像 (前部投影)。图7、8、9 静脉内接受用4MBq的99mTc标记的偶联至尸胺的50%氧化淀粉颗粒的 大鼠在注射后5分钟(图7)、15分钟(图8)和30分钟后(图9)的典型闪烁照相成像(前 部投影)。图10和η 通过光学显微术(在IOx放大倍数下)观察到的标记的50%氧化淀 粉微粒在与尸胺反应之前(图10)和之后(图11)的形态学特征。ail 使用Coulter Multisizer 3计数器测量的偶联至尸胺的氧化淀粉微粒的 尺寸分布的实例。^13 温度(Bi)、反应时间(B2)、还原剂等效值(B3)和最后还原时间(B4)对包 含于最终微粒中的氮的百分比的效果的图研究。fi!4 模建4个试验参数(胺/淀粉等效值；反应的pH ；淀粉的氧化水平和在反 应介质中的淀粉浓度)对尸胺与淀粉微粒的偶联收率的效果的二维图研究。图15 在对雄件Wistar大鼠静脉内沣射用99mTc标记的淀粉微粒(制剂C)之后拍 摄的图像。平面图像(同一开窗)是在持续120分钟的动力学研究的10、20、60和120分 钟提取的(180个45-秒图像)。图16 从对雄件Wistar大鼠静脉内沣射用99mTc标记的淀粉微粒(制剂C)之后进 行的动力学闪烁照相研究得到的时间_活性曲线的实例。图17 在对雄性Wistar大鼠静脉内注射用99mTc标记的淀粉微粒(制剂C)之后折 摄的典型图像。图像是X射线成像连同注射后10、20和90分钟进行的静态闪烁照相采样 (同一开窗)(600-秒静止)的结果。图18、19和20 在使用由99mTc标记的淀粉微粒(制剂C)静脉内注射雄性Wistar 大鼠之后采集的尿代谢物通过凝胶渗透色谱法的分离。使用具有1500道尔顿的排除极限的S印hadex G15柱(18)、使用具有5000道尔顿 的排除极限的P6柱(19)和使用具有10000道尔顿的排除极限的S印hadex G50 (20)洗脱 采集的不同尿样品。下列实施例说明本发明，但是不产生限制。使用的原料是已知的产品或按照已知 方法可制备的产品。实施例 N0. ι -.im^m^mmmm 通丄寸与荧光Η安反应石角证偶联淀粉颗粒的受控制的氧化将10g(对应于0. 055摩尔的葡萄糖单元)在36和50 μ m之间筛分的马铃薯淀粉 (符合欧洲药典的专论的天然马铃薯淀粉)分散于IOOml水中。加入先前溶解于IOOml水 中的0. 028摩尔的高碘酸钠(NaIO4)，即6g。在室温，将悬浮液搅拌18小时。在18小时之 后，得到50%氧化淀粉的颗粒悬浮液。通过离心采集氧化的淀粉，然后使用200ml水漂洗3 次。通过偶联至天然多胺将氧化的淀粉功能化在漂洗之后，将Ig淀粉，即0. 0055摩尔的葡萄糖单元在60ml水中温育，并在室温与0. 00385摩尔的天然多胺(腐胺、尸胺、精胺或亚精胺)(即0. 0077摩尔的NH2(1.4eq))在 10ml水中的溶液接触18小时。为了稳定形成的亚胺，在搅拌下，历经1小时，将0. 56g(即 0. 015摩尔)NaBH4加入改性淀粉悬浮液。然后将颗粒倾析，过滤并用200ml水洗涤3次，然 后冻干。通过光学荧光显微术确证淀粉_胺的偶联通过使用光学荧光显微术观察在将100 u 1的3mg/ml荧光胺(C17H1(104)溶液添加 至用尸胺功能化的淀粉颗粒(10mg在300 yl水中)期间形成的荧光络合物，确证尸胺与淀 粉颗粒的偶联。由荧光显微术确证的这种荧光络合物的形成表明，通过所述胺对清洁的荧 光胺的特异性反应在功能化的淀粉颗粒上存在伯胺功能基(NH2)，所述荧光胺然后转变为 黄绿色，这证实了淀粉/氧化的胺的偶联的功效。No. 2 氧化的马铃薯淀粉颗粒作为用于肝和脾的闪烁照相成像的放射示踪剂淀粉颗粒的警控制的氧化如在实施例1中，将在36和50iim之间筛分的10g (对应于0. 055摩尔的葡萄糖 单元)的马铃薯淀粉(符合欧洲药典的专论的天然马铃薯淀粉)分散于100ml水中。将先 前溶解于100ml水中的0. 0112摩尔(即2. 4g)的高碘酸钠(NaI04)加入颗粒悬浮液。在 室温，将悬浮液搅拌18小时。在18小时之后，得到20%氧化淀粉的颗粒悬浮液。通过离心 采集氧化的淀粉，用200ml水漂洗3次，然后冻干。用-Tc标记的反应在惰性气氛下，将20mg的20%氧化并冻干的淀粉放置在空的洗脱烧瓶中。加 A 4ml的生理血清，然后加入20ii g的SnCl2，2H20。加入lml的185MBq/ml过锝酸钠溶液 (Na+99mTc04-)。将溶液搅拌1分钟，通过在0. 22 y m过滤器上过滤lml的溶液和用5ml生理 血清漂洗过滤器，检验放射化学纯度(RCP)。放射化学纯度如下RCP =(在滤器上的活性/总活性)xlOO ；在实施例2中，所述RCP大于99%。在大薩冲静fe内沣射后勿分布的丨Xltt照才目、昆影在标记之后，将4MBq的用99mTc标记的20 %氧化淀粉颗粒静脉内注射(阴茎静脉) 入体重为约200g的雄性Wistar大鼠。在注射之后立即进行30kCps的闪烁照相采样，然后 在15分钟之后进行30kCps的闪烁照相采样。在使肺(上区域)、肝和脾(下右手区域)显 影期之后，活性快速(在15分钟之内)集中在肝和脾(固定点在图像的下右手区域)(图 2 禾口 3)。No. 3 偶联至尸胺的氧化的马铃薯淀粉颗粒作为用于肺灌流的闪烁照相成像的放 射示踪剂淀粉颗粒的受控制的氧化将在36和50 ii m之间筛分的10g(对应于0. 055摩尔的葡萄糖单元)的马铃薯淀 粉(符合欧洲药典的专论的天然马铃薯淀粉)分散于100ml水中。加入先前溶解于100ml 水中的0. 028摩尔(即6g)的高碘酸钠(NaI04)。在室温，将悬浮液搅拌18小时。在18小 时之后，得到50%氧化淀粉的颗粒悬浮液。通过离心采集氧化的淀粉，然后用200ml水漂洗 3次。
通过偶联至尸胺将氧化的淀粉功能化将10g氧化的淀粉(即0. 055摩尔的葡萄糖单元)在600ml水中温育，并且在室 温，与溶解于100ml水中的4g尸胺(NH2(CH2)5NH2)，即0. 0385摩尔的尸胺，即0. 077摩尔的 NH2(1. 4eq)接触18小时。为了稳定形成的亚胺，在搅拌下，历经1小时，将5. 6g (即0. 15摩 尔)NaBH4加入改性淀粉悬浮液。然后将颗粒倾析，过滤并用200ml水洗涤3次，然后冻干。使用-Tc标记的反应在惰性气氛下，将20mg偶联至尸胺和冻干的淀粉放置在洗脱烧瓶中。加入 4ml的生理血清，然后加入60ii g的SnCl2，2H20。加入1ml的185MBq/ml过锝酸钠溶液 (Na+99mTc04-)。将溶液搅拌1分钟，通过在0. 22 y m过滤器上过滤1ml的溶液和用5ml生理 血清漂洗过滤器，检验放射化学纯度(RCP)。放射化学纯度如下RCP =(在滤器上的活性/总活性)xlOO ；在实施例3中，所述RCP大于95%。在大鼠中静脉内沣射后牛物分布的闪烁照相显影在标记之后，将4MBq用99mTc标记的偶联至尸胺的50%氧化淀粉颗粒静脉内注射 (阴茎静脉)入体重为约200g的雄性Wistar大鼠。在注射之后立即进行30kCps的闪烁照 相采样，在15分钟、30分钟和然后90分钟之后(图4至5)进行30kCps的闪烁照相采样。 在只有肺显影的阶段之后，脾的活性和然后肾的活性快速增加，伴随在90分钟之后肺活性 显著的减少。应注意，在图4至6中，无论何时分析，肝中显著不存在活性。同样地，也注意 到，肺的初始图像的良好视见度和几乎完全不存在肝和脾的显影。在30分钟，可以观察到 脾和肾的定影的开始，这2个要素基本上在90分钟时增加，伴随肺活性的显著减少。No. 4金属还iC齐II (SnCL),将偶联至尸fl安的氧补,的马I今薯淀liBfM乍为用 于肺灌流的闪烁照相成像的放射示踪剂。淀粉颗粒的受控制的氧化将在36和50 ii m之间筛分的10g(对应于0. 055摩尔的葡萄糖单元)的马铃薯淀 粉(符合欧洲药典的专论的天然马铃薯淀粉)分散于100ml水中。加入先前溶解于100ml 水中的0. 028摩尔(即6g)的高碘酸钠(NaI04)。在室温，将悬浮液搅拌18小时。在18小 时之后，得到50%氧化淀粉的颗粒悬浮液。通过离心采集氧化的淀粉，然后用200ml水漂洗 3次。通过偶联至尸胺将氧化的淀粉功能化将10g氧化的淀粉(即0. 055摩尔的葡萄糖单元)在600ml水中温育，在室温 与溶解于100ml水中的4g尸胺(NH2(CH2)5NH2)，即0. 0385摩尔的腐胺，即0. 077摩尔的 NH2(1. 4eq)接触18小时。在搅拌下，历经1小时，将5. 6g(即0. 15摩尔)NaBH4加入改性 淀粉悬浮液，以稳定形成的亚胺。然后将颗粒倾析，过滤并用200ml水洗涤3次，然后冻干。不使用还原剂，使用-Tc标记的反应将1ml的185MBq/ml过锝酸钠(Na+99mTC04_)溶液放置在I so link 烧瓶中，所述烧 瓶含有下列冻干形式的混合物8. 5mg酒石酸钠、2. 85mg四硼酸钠、7. 15mg碳酸钠和4. 5mg 硼烷碳酸钠(sodiumboranocarbonate)。将烧瓶放置在100°C的干水浴中20分钟。通过添 加1ml的0. 1N盐酸(HCI)溶液中和得到的溶液。在中和之后，在惰性气氛下，将溶液放置
11在烧瓶中，所述烧瓶含有20mg的偶联至尸胺的氧化淀粉。将悬浮液搅拌15分钟，并通过在0. 22 y m过滤器上过滤1ml的溶液和用5ml生理 血清漂洗过滤器，检验放射化学纯度(RCP)。放射化学纯度如下RCP =(在滤器上的活性/总活性)xlOO ；在实施例4中，所述RCP大于95%。在大鼠中静脉内沣射后牛物分布的闪烁照相显影在标记之后，将4MBq用99mTc标记的偶联至尸胺的50%氧化淀粉颗粒静脉内注射 (阴茎静脉)入体重为约200g的雄性Wistar大鼠。历经90分钟，以30-秒间隔，在注射之 后立即进行连续动力学闪烁照相采样(图7至9)。在5分钟之后(图7)，观察到几乎只有 肺的显影和低肝和肾活性。在注射之后15分钟(图8)和30分钟(图9)观察到稳定的肺 活性。应注意，在图7至9中，无论何时分析，脾中不存在显著的活性。同样地，在所述时间 段内，没有观察到肝和肾活性增加(图8和9)，这可以解释为肺捕捉的高水平稳定性。No. 5 使用天然多胺偶联氧化的淀粉微粒。在尸胺的存在下，将按照实施例1制备的50%高碘酸盐氧化的马铃薯淀粉颗粒温 育(18小时，在室温)。在通过光学显微术(图10和11)和使用Coulter Multisizer if 数器的粒度显微术(图12)分析形态学之后，偶联至尸胺的颗粒在形态学方面(图11)和 在尺寸分布方面(图12)表现为相当均勻。重要的是选择均勻的颗粒-尺寸分布，以增加在肺部毛细管阻断的颗粒的比例， 所述颗粒最佳为约20至40 y m。当小于10 u m时，颗粒具有不在肺被正确阻止的风险，以及 不被单核吞噬细胞的系统(特别是在肝和脾)捕捉的风险。No. 6 H佳仆,偶联至尸fl安的立的泡丨备4勿禾Pffell齐II A、B、C的泡丨备。为了最佳化微粒制备物，建立多个试验计划以测定用于将氧化的淀粉偶联至尸胺 的反应的最佳参数。第一试验计划可以揭示影响或不影响偶联反应的因素。第二试验计划 可以定量测定试验参数的影响，并因此得到最适于制备能有效地络合"mTc的微粒的反应条 件。基于14个试验(表1)，第一试验计划可以测定4个试验变量(B1 反应温度；B2 反应时间；B3 还原剂等效值；B4 还原时间)的定性影响。在2个水平(1个低和1个高) 测定各试验变量。在所有试验中，通过测量包含于最终微粒中的氮的百分比(由元素分析 测量的主要判断点)、偶联反应的收率和得到的微粒的粒度分布(CoulterMultisizer 计 数器)，评价反应。得到的结果(图13)表明，特定的反应参数(B3 还原剂等效值；B4 还 原时间)对在最终微粒中的氮含量影响弱或缺少影响，相反的是，温度和反应时间对在最 终微粒中的氮含量具有更正面的和显著的影响。因此温度和反应时间的增加允许增加尸胺 与氧化淀粉微粒的偶联，因此更利于另一次"mTc被微粒络合。表1 试验计划N0. 1，研究4个因素(Bl、B2、B3和B4)对尺寸响应和在偶联反应 结束时淀粉微粒中的氮百分比的定性影响。实施例平均尺寸 ％颗粒Bl B2 B3 B4%氮编号(iim) < 10um
12CN 101861171 A说 明 书11/16 页—1234567891011121314—关于第二试验计划，进行该计划以能定量最佳化偶联，模建对不同试验参数的变 化在微粒的氮含量方面的响应。第二试验计划包含25个试验，并且以使用Doelhert基质为 基础(表2)。研究的参数是胺/淀粉等效值的数值(在5个水平测定的)、反应的pH(在 7个水平测定的)，淀粉的氧化程度(在7个水平测定的)以及最后在反应介质中的淀粉浓 度(在3个水平测定的)。如第一试验计划的情况一样，针对所有试验，通过测量包含在最 终微粒中的氮的百分比和偶联收率(通过元素分析的主要判断点)，以及得到的微粒的粒 度分布(使用CoulterMultisizer 计数器测量的次要判断点)，评价反应。得到的结果在 偶联收率方面，可以将响应模建为在试验参数(图14)方面的变化的函数。在图14中的环 形表示，在二维模式中，在第二试验计划期间研究的试验区域。在所述第二试验计划期间， 可以测定氧化的淀粉和尸胺之间的偶联为具有接近100%收率的最大程度的条件(在图14 中环形的上右手部分)。所有这些结果可以最佳化从氧化的淀粉和尸胺的偶联产生的微粒制备物。使用试 验计划，以确定理想试验条件，所述理想试验条件用于得到具有期望应用需要的性质的微 粒制备物。因此从这些计划得到3个类型的制剂(制剂A、B和C)，所述制剂具有用于医学 成像中诊断应用的理想形态学特征。表2:第二试验计划，通过反应收率和在偶联反应结束时在淀粉微粒中的氮百分 比，研究4个因素-胺/淀粉等效值(在5个水平测定的)、反应的pH (在7个水平测定的)、 淀粉的氧化水平(在7个水平测定的)以及最后在反应介质中的淀粉浓度(在3个水平测 定的)_对响应的定量影响。
制剂A的制备将4g的50%氧化淀粉(即0. 022摩尔的葡萄糖单元)在120ml水中温育，与溶解 于120ml水中的2268mg尸胺(NH2(CH2)5NH2)接触。在40°C的温度下，在搅拌下，将悬浮液 放置在暗处18小时。为了稳定形成的亚胺，在搅拌下，历经15分钟，将溶解于IOml水中的 420mg的NaBH4加入改性淀粉悬浮液。然后将颗粒倾析，过滤并用200ml水洗涤3次，然后 冻干。制剂B的制备将4g的58. 75%氧化淀粉(即0. 022摩尔的葡萄糖单元)在120ml水中温育，与 溶解于250ml水中的4048mg尸胺(NH2 (CH2) 5NH2)接触，调节悬浮液的pH至8. 8。在40°C的 温度，在搅拌下，将悬浮液放置在暗处18小时。为了稳定形成的亚胺，在搅拌下，历经60分 钟，将溶解于IOml水中的760mg的NaBH4加入改性淀粉悬浮液。然后将颗粒倾析，过滤并 用200ml水洗涤3次，然后冻干。制剂C的制备将4g的65%氧化淀粉(即0. 022摩尔的葡萄糖单元)在120ml水中温育，与溶 解于158ml水中的2920mg尸胺(NH2 (CH2) 5NH2)接触，将悬浮液的pH调节至8. 8。在40°C的 温度，在搅拌下，将悬浮液放置在暗处18小时。为了稳定形成的亚胺，在搅拌下，历经60分 钟，将溶解于IOml水中的420mg的NaBH4加入改性淀粉悬浮液。然后将颗粒倾析，过滤并 用200ml水洗涤3次，然后冻干。No. 7 偶联至尸胺的颗粒的牛物分布和代谢研究了在99mTc的络合和静脉内给药之后，偶联至尸胺的微粒((实施例6的制剂 A、B、C)的药物动力学性质。为了实现上述目的，在健康动物中进行2个类型的研究-动态和静态闪烁照相研究；-淀粉微粒的生物分布和尿代谢物的色谱分离的研究。a)闪烁照相研究使用不同的现成可用的试剂盒进行闪烁照相研究，所述试剂盒含有50 μ g的SnCl2 和有关的按照实施例6制备的A、B和C的制剂的20mg微粒。在使用过锝酸钠(99mTcO4)溶 液标记之后，检验不同试剂盒的放射化学纯度，在各种情况下结果大于95% (表3)。表3 3种不同现成可用的试剂盒的体外和体内特征，所述试剂盒含有50μ g的 对雄性Wistar大鼠(n = 3)进行120min持续时间的动态研究(图15)。它们可 以建立时间-活性曲线(图16)，从其可以得到不同活性比率(表3)。也进行了结合扫描 仪成像的闪烁照相静态采样，以在解剖学上示踪示踪剂在不同时间的分布(图17)。这些不同研究可以观察示踪剂在静脉内注射之后的主要肺部定位(图15和17)， 取决于制剂，肺半衰期在1. 5和3小时之间(表3)。在动态研究期间得到的时间-活性曲 线揭示了示踪剂的肾和尿的消除，其具有相对于时间保持恒定的肝、消化和血管活性的性 质(图16)。制剂C的体外和体内特征是放射化学纯度(％ ) :98士2 ；颗粒尺寸在4和90 iim之间；肺半衰期(h):3士0.50 ；肺的活性/血管活性比率[t = 30min] :310士 116。这些特征非常有助于它们作为用于肺部灌流的闪烁照相成像的放射药物的临床应用。b)生物分布研究使用现成可用的试剂盒进行生物分布研究，所述试剂盒含有50y g的SnCl2和 20mg制剂C的微粒(所述制剂具有最有助的闪烁照相特征)。在使用过锝酸钠(99mTc04)溶 液标记之后，将lOMBq的用99mTc标记的淀粉微粒的悬浮液静脉内注射入雄性Wistar大鼠 (n = 8)。在注射后15和120分钟，处死动物(n = 4，各个时间点)，取出它们的器官，洗涤， 称重和使用克计数器计数。结果证实了示踪剂的肺分布，因为在肺中发现多于80%的注射 的活性(表4)。这种肺的活性是相对稳定的，因为在120分钟之后，在肺中依然存在70% 的注射活性。如在闪烁照相研究期间揭示的，示踪剂的消除主要是尿消除。表4 在静脉内注射入雄性Wistar大鼠之后15和120分钟的用99mTc标记的淀粉 微粒(制剂C)的生物分布的研究(n = 4，各个时间点)。结果表示为注射剂量的百分比 (%D. I.),并表示为注射剂量/克器官的百分比(％ D. I. /g器官)。
16 为了完善这些生物分布结果，进行了通过尿代谢物的色谱分离实施的研究。在将 用"mTc标记的淀粉微粒(制剂C)静脉内注射入雄性Wistar大鼠(n = 2)之后，将动物放 入代谢笼，其允许在给予示踪剂后12个小时期间内采集尿。因此能使用不同多孔性的凝胶渗透柱(S印hadex G15、P6和S印hadex G50)洗脱 不同尿的样品，其可以得到放射标记的尿代谢物的分子分布的第一表征(图18、19和20)。 使用具有1500道尔顿的排除极限的S印hadex G15柱(图18)洗脱揭示了几乎50%的尿代 谢物的分子分布大于排除极限。使用具有5000道尔顿的排除极限的P6柱(图19)的洗脱 揭示了几乎40%至50%的尿代谢物的分子分布大于排除极限。最后，使用具有10000道尔 顿的排除极限的S印hadex G50柱的洗脱(20)揭示了几乎30至40%的尿代谢物的分子分 布大于排除极限。作为结论，凝胶渗透色谱法提供了关于尿代谢物的近似分子分布的信息， 约50 %的所述分布由比1500道尔顿更小的分子(对应于8个葡萄糖单元)形成，约10 %的 分子尺寸在1500和5000道尔顿之间(8至27个葡萄糖单元)，约10%的分子尺寸在5000 和10000道尔顿之间(27至55个葡萄糖单元)，以及最后约30%的分子比10000道尔顿更 大。使用用99mTc标记的改性淀粉微粒进行所有闪烁照相和生物分布研究揭示了与放 射药物的体内用途一致的生物学表现。在静脉内注射之后，控释的特征和来自其肺部储库 的99mTc的同质性是如下组合的结果-特别均勻的尺寸和形态学；-偶联络合剂的化学的良好控制17
-关于保留放射示踪剂"mTc的有效络合剂的选择。参考文献Hafeli，U0 2001，Radioactive Microspheres For MedicalApplications. In Bulte J，de Kuyper M (eds)Focus onbiotechnology. Kluwer Academic PublishingHSfeli U0，Casillas S，Dietz DW, Pauer GJ，Rybicki LA, Conzone SD，Day DE， Hepatic Tumor Radioembolization in a RatModel Using 186/188 Radioactive Rhenium Glass Microspheres,Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. ,Vol. 44,No. l，pp. 189—199， 1999Delgado HA,Diaz Acevedo RV,Evora Garcia CM,MailoIEJ,Soriano Torres Ml， Microspheres of biodegradable syntheticpolymers in the manufacture of reactive equipment for thepreparation of radiopharmaceuticals.专利 ES 2096521，1997. Delgado A， Soriano I， Sanchez E， Oliva M， Evora C， Radiolabeled biodegradable microspheres for lung imaging. Eur JPharm Biopharm. 2000 Sep ；50 (2) 227~36Kellaway IW, Seale L，Spencer PS.The in vitrocharacterization and biostability of "mTc-dextran and itsaccumulation within the inflammed paws of adjuvant-inducedarthritic rats. Pharm Res. 1995 Apr ； 12 (4) :588_93Akgun A，Tani Acar E，Taner MS，Ozcan Z，0k E. Scintigraphic diagnosis of protein-losing enteropathy secondary toamyloidosis. Turk J Gastroenterol. 2005 Mar ；16(1) :41_3Paiva GR,Filho RS,Ferreira LM,Wagner J,Nogueira SA,Novo NF,Juliano Y， Rocha JL Phytate technetium-"111 versusdextran 500 technetium-"111 in the sentinel lymph node biopsy. ActaRadiol. 2006 Feb ；47(1) 65-70Andersson A，Capala J，Car Is son J. Effects ofEGF-dextran-tyrosine-131l conjugates on the clonogenic survival ofcultured glioma cells. J Neurooncol. 1992 Nov ；14(3) 213-23Line BR, Weber PB，Lukasiewicz R，Dansereau RN. Reduction of background activity through radiolabeling of antifibrinFab ' with "mTc-dextran. J Nucl Med. 2000 Jul ；41 (7) 1264-70.
权利要求
制备组合物的方法，所述组合物包含多糖，该多糖具有一个或多个通过将腐胺NH2(CH2)4NH2、精胺H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2、亚精胺NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2或尸胺NH2(CH2)5NH2与所述多糖共价键合得到的络合基团，该络合基团的全部或一些与至少一种多价金属形成络合物，所述方法包括以下步骤i)使多糖与受控制的氧化剂接触；ii)使氧化的多糖与选自腐胺、精胺、亚精胺或尸胺的络合化合物接触；iii)任选使在步骤ii)中得到的多糖与还原剂接触；以及iv)使在步骤ii)或步骤iii)中得到的多糖与多价金属盐接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述多价金属是99mtc。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中在锡、硼酸盐和衍生物或抗坏血酸类型的 还原剂的存在下，进行步骤iv)。
4.包含多糖的组合物，所述多糖具有一个或多个通过将腐胺nh2(ch2)4nh2、精胺 h2n (ch2) 3nh (ch2) 4nh (ch2) 3nh2、亚精胺 nh2 (ch2) 3nh (ch2) 4nh2 或尸胺 nh2 (ch2) 5nh2 与所述多糖 共价键合得到的络合基团，该络合基团的全部或一些与至少一种多价金属形成络合物，所 述组合物能够根据权利要求1至3任一项的方法得到。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述多糖呈颗粒的形式。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述颗粒尺寸是lonm至200u m。
7.根据权利要求4至6任一项的组合物，其中所述多糖是来自植物或微生物。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述多糖选自淀粉、纤维素、支链淀粉、直链淀粉、琼 脂糖、脱乙酰壳多糖、普鲁兰或右旋糖酐、它们的衍生物和它们中的两种或多种的混合物。
9.根据权利要求4至8任一项的组合物，其中所述多价金属选自原子数为20至33、原 子数为38至51、原子数为56至84和原子数为88至103的金属元素。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述多价金属选自锝、铼、铜、锶、铟、钐、锡、钪、钇、 镓、钆或镥的放射性同位素，特别优选"mtc。
11.根据权利要求4至10任一项的组合物，它还包括药用可接受的赋形剂。
12.用于人或动物药典的诊断或药物组合物，它包含根据权利要求4至11的组合物。
13.根据权利要求4至11任一项的组合物在制备用于医学或兽医学成像的诊断用组合 物中的用途。
14.根据权利要求13的用途，用于闪烁照相成像。
15.根据权利要求14的用途，用于肺栓塞的闪烁照相诊断。
16.根据权利要求14的用途，用于检测警戒淋巴结或用于淋巴闪烁照相术。
17.根据权利要求4至11任一项的组合物的用途，用于通过医学成像使患者或动物中 的一个或多个器官显影。
18.根据权利要求17的用途，其中所述被成像的器官是肺、肝、脾、骨髓或淋巴结。
19.根据权利要求4至11任一项的组合物的用途，用于制备通过体内放射治疗在患者 或动物中治疗癌症的药物组合物。
20.根据权利要求19的用途，用于治疗淋巴结或者肝肿瘤或脾肿瘤。
全文摘要
本发明涉及以接枝的多糖和特别具有放射活性的多价金属络合试剂为基础的新药物组合物。本发明还涉及所述组合物在医学成像、特异性闪烁照相术和体内放射疗法中的用途。
文档编号A61K51/12GK101861171SQ200880104311
公开日2010年10月13日 申请日期2008年7月25日 优先权日2007年7月26日
发明者B·德尼佐, F·安德雷, F·拉克勒, J·J·勒热纳 申请人:希洛药物实验室