专利名称：一种壳聚糖纳米纤维及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，涉及生物可降解纳米纤维的制备方法
与应用，具体涉及一种壳聚糖纳米纤维及其制备方法和应用。
背景技术：
天然高分子壳聚糖具有低毒性、良好的生物相容性和生物可降解性，在生物医用领域应用广泛。壳聚糖的结构与细胞外基质(ECMs)中的糖胺聚糖有相似之处，能制备成具有不同微观形貌的宏观形状，并且具有一定力学强度适应不同部位的组织缺损修复要求的三维多孔支架，可作为细胞的三维载体，用于组织工程领域，修复或重建病损组织。研究表明在组织工程、创伤修复等领域，纳米制备技术的应用可以进一步改进壳聚糖的生物医用性會g [M. N. V. Ravi K丽r， R. A. A. Muzzarelli， C. Muzzarelli， H. Sashiwa， A. J. Domb，Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives, Chem. Rev. 104，6017 6084(2004).]。 细胞在动物体内生存的微环境(细胞外基质)大多是由直径为50 500nm的蛋白多糖和胶原纤维构成的三维纳米支架，因此具有与天然细胞外基质相似的组成及结构的壳聚糖纳米纤维是构造组织工程支架的优良材料。高分子纳米纤维的制备方法主要有静电纺丝、自组装和相分离等，目前使用较多的是采用静电纺丝技术来制备壳聚糖纳米纤维及壳聚糖纳米复合纤维[1. K. Ohkawa， D. Cha， H. Kim， et al. Electrospinning of Chitosan.Macromol. Rapid Commun. 25，1600 1605(2004). 2. Bhattaai N， Edmondson D， Veiseh 0，et al. Electrosp皿 chitosan-based nanofibers andtheir cellular compatibility,Biomaterials， 26， 6176 6184 (2005).]。但通常，静电纺丝技术需要专门设备且工艺较复
杂。针对这种情况，本发明采用相分离技术制备了生物可降解的壳聚糖基纳米纤维，可以采用非常简单的工艺实现对天然细胞外基质的仿生模拟，具有良好的生物相容性。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷与不足，本发明的目的首先在于提供一种生物可降解的壳聚糖纳米纤维的制备方法，是采用简单的工艺实现对天然细胞外基质的仿生模拟。
本发明的目的还在于提供一种上述方法得到的壳聚糖纳米纤维，其表现出良好的细胞和组织相容性，特别适于组织工程、创伤修复及药物/生物活性物质释放等领域的应用。 本发明的再一 目的在于提供上述壳聚糖纳米纤维的应用。 本发明的目的通过以下的技术方案来实现 —种壳聚糖纳米纤维的制备方法，包括如下步骤 (1)壳聚糖用酸溶解成壳聚糖溶液； (2)将步骤(1)所得壳聚糖溶液进行相分离； (3)将步骤(2)所得产物冷冻干燥、洗涤、再冷冻干燥即得到壳聚糖纳米纤维。
为更好的实现本发明 作为优选，步骤(l)中，所述壳聚糖脱乙酰度为70% 100%、重均分子量为2000 150万；所述酸的体积浓度为0. 005% 0. 5%。
作为优选，步骤(i)中，所述壳聚糖与酸的质量体积比为io—4 : i io—3 : i。 作为优选，步骤(1)中，所述酸为乙酸、盐酸或己二酸。 作为优选，步骤(2)中，所述的相分离为在液氮中冷冻相分离lmin 24h。 作为优选，步骤(3)中，所述冷冻干燥为在-S(TC下冷冻1 7天。 作为优选，步骤(3)中，所述洗涤先后采用含0. 01 lmol/L的NaOH的乙醇水溶
液、去离子水来洗涤壳聚糖纳米纤维；所述乙醇水溶液中，乙醇与水的体积比为80 : 20
99 : i。 本发明还提供一种壳聚糖纳米纤维，就是用上述任一种方法制备得到的。 作为优选，本发明所得壳聚糖纳米纤维的直径为50 500nm。 本发明的壳聚糖基纳米纤维可以应用于组织工程和创伤修复等领域，主要是用于
制备该领域所用的材料。 本发明与现有技术相比具有如下优点大大简化了壳聚糖基纳米纤维的工艺步骤，并在性能上实现对天然细胞外基质的仿生模拟，具有良好的生物相容性。本发明还可以通过改变工艺参数达到控制纳米纤维机械性能、生物降解性能的目的，在组织工程、创伤修复及药物及生物活性物质释放等领域具有广阔应用前景。
图1是实施例1所得壳聚糖纳米纤维的扫描电镜照片。 图2是实施例2所得壳聚糖纳米纤维的扫描电镜照片。 图3是实施例3所得壳聚糖纳米纤维的扫描电镜照片。 图4是成骨细胞和骨髓间充质干细胞在壳聚糖纳米纤维支架体外培养的生长曲线。 图5是壳聚糖纳米纤维支架种植于新西兰大白兔的股骨髁部负重区照片。 图6是术后一个月股骨髁缺损部位的修复照片。 图7是术后一个月股骨髁缺损部位的空白组照片。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。 下述实施例中所用试剂无特别说明均为市售化学分析纯。
实施例1 称取0. 1克壳聚糖(脱乙酰度90%，重均分子量为5万)溶于100毫升0. 5%的乙酸溶液中，常温下磁力搅拌配制成浓度为0. 1 %的壳聚糖乙酸溶液。将壳聚糖溶液置于液氮中冷冻24h，在-S(TC下冷冻干燥7天，得到的壳聚糖纳米纤维先后用1. Omol/L的Na0H乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为90 : 10)及去离子水清洗，再在-8(TC下冷冻干燥7天后得到壳聚糖纳米纤维，其直径大小为250 400nm，如图1所示。
实施例2 称取0.05克壳聚糖(脱乙酰度95%，重均分子量为35万)溶于100毫升0.25%的乙酸溶液中，常温下磁力搅拌，配制成浓度为0.05%的壳聚糖乙酸溶液。将壳聚糖溶液置于液氮中冷冻12h，在-S(TC下冷冻干燥3天，得到的壳聚糖纳米纤维先后用0. 5mol/L的NaOH乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为95 : 5)及去离子水清洗，再在-S(TC下冷冻干燥3天后得到壳聚糖纳米纤维，其直径大小150 350nm之间，如图2所示。
实施例3 称取0. 01克壳聚糖(脱乙酰度95 % ，重均分子量为150万)溶于100毫升0. 005 %的盐酸溶液中，常温下磁力搅拌配制浓度为0. 01%的壳聚糖盐酸溶液。将壳聚糖溶液置于液氮中冷冻lmin，在-S(TC下冷冻干燥1天，得到纳米纤维先后用0. 01mol/L的NaOH乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为99 : 1)及去离子水清洗，再在-8(TC下冷冻干燥l天后得到壳聚糖纳米纤维，其直径大小为50 500nm之间，如图3所示。
应用实施例 将实施例2制得的壳聚糖纳米纤维裁成厚度为3mm，直径与24孔培养板孔径大小相当的支架，垫于孔底。SD大鼠的成骨细胞(OB组)与骨髓间充质干细胞(BMSCs组)分别接种于壳聚糖纳米纤维支架中，每孔加入200 ii L细胞悬液，细胞浓度为1 X 105个细胞/mL，然后置于0. 05% C02， 37t:孵育箱中培养。分别在接种后1周、2周和3周，吸出培养液，PBS漂洗吸出悬浮的细胞后，胰酶消化，用MTT法测定细胞的生长曲线，如图4所示。成骨细胞和骨髓间充质干细胞在壳聚糖纳米纤维支架中均能快速生长，说明壳聚糖纳米纤维支架具有良好的生物相容性。 将实施例2制得的壳聚糖纳米纤维支架用于新西兰大白兔的股骨髁缺损修复。首先将壳聚糖纳米纤维支架种植于股骨髁部负重区，如图5所示。术后一个月观察股骨髁缺损部位(箭头指示部位)的修复情况，如图6所示。与缺损股骨髁的空白组(如图7)相比，壳聚糖纳米纤维支架修复的股骨髁缺损部位组织生长较好，支架材料与缺损部位的边界变得模糊，周围有软组织生长，壳聚糖纳米纤维支架已发生部分降解，缺损部位得到了较好的修复。 实施例1和3所得壳聚糖纳米纤维进行上述实验，可达到大致相同的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)壳聚糖用酸溶解成壳聚糖溶液；(2)将步骤(1)所得壳聚糖溶液进行相分离；(3)将步骤(2)所得产物冷冻干燥、洗涤、再冷冻干燥即得到壳聚糖纳米纤维。
2. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所 述壳聚糖脱乙酰度为70% 100%，重均分子量为2000 150万；所述酸的体积浓度为 0. 005% 0. 5%。
3. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述壳聚糖与酸的质量体积比10—4 : i io—3 : i。
4. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述酸为乙酸、盐酸或己二酸。
5. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述的相分离为在液氮中冷冻相分离lmin 24h。
6. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述 冷冻干燥为在-S(TC下冷冻1 7天。
7. 根据权利要求l所述的壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述 洗涤是先后采用含0. 01 lmol/L的NaOH的乙醇水溶液、去离子水来洗涤壳聚糖纳米纤 维；所述乙醇水溶液中，乙醇与水的体积比为80 : 20 99 : 1。
8. 根据权利要求1 7中任一项所述的方法制备得到的壳聚糖纳米纤维。
9. 根据权利要求8所述的方法制备得到的壳聚糖纳米纤维，其特征在于所述壳聚糖 纳米纤维的直径为50 500nm。
10. 权利要求8所述的壳聚糖基纳米纤维在制备组织工程或创伤修复材料中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种壳聚糖纳米纤维及其制备方法和应用，包括如下步骤(1)壳聚糖用酸溶解成壳聚糖溶液；(2)将步骤(1)所得壳聚糖溶液进行相分离；(3)将步骤(2)所得产物冷冻干燥、洗涤、再冷冻干燥即得到壳聚糖纳米纤维。本发明制备的壳聚糖基纳米纤维可生物降解，具有仿细胞外基质的结构，在组织工程、临床创伤修复等领域应用前景广阔。
文档编号A61L27/20GK101736438SQ20091021440
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者屠美, 曾戎, 查振刚, 赵剑豪, 陈昊东 申请人:暨南大学