专利名称：骨替代物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及骨替代物及其制备方法。
背景技术：
骨是主要由细胞；构成有机蛋白网络的I型胶原；以及由纳米大小的羟基磷灰石 晶体所组成的矿物相构成的混杂材料。这种三维的大规模有机/矿物的结合赋予骨组织弹 性和硬度，使得其经受住施加于其上的力。因此，骨是坚硬的、致密的和非常强壮的。Weiner & Wagner (Ann. Rev. Mater, ki.沘，271-298，1998)提供了各个尺度下分 级结构的描述，其可以分成下文所述并由附
图1示例的七个级别-级别1(图la)骨的两个主要构成基本组分，即羟基磷灰石小板和条纹胶原原纤 维构成结构的第一等级。在纳米尺度内，这是结构的最低级别。特别地，磷灰石相的特征在 于存在特征晶面(plans inter r6ticulaires)，如(002)和(300)。在该结构级别上，磷灰 石晶体不具有特定的取向。胶原原纤维的特征在于电子显微镜可见的周期性条纹，其来自 胶原I分子组装，从而诱导67nm的周期位移；-级别2(图lb)羟基磷灰石小板根据它们的c轴，沿条纹胶原原纤维主轴的共排 列(coalignement)构成第二级别，即磷灰石的晶面(002)与原纤维的主轴垂直，并因此根 据胶原原纤维(条纹=67nm)的轴向周期(即根据条纹)取向。使用了术语矿化的胶原原 纤维(宽度100至300纳米)。级别2也在纳米尺度内；-级别3(图Ic)一些矿化的胶原原纤维在平行束中并排组装，从而形成矿化的胶 原纤维(宽度1至3微米)。结构级别3达到微米尺度；-级别4(图Id)其是复杂的，因为矿化的胶原原纤维或纤维可以在三维上有序 化。特别地，在该级别中，可以区分结构域的共存，其中原纤维/纤维在优选方向上在一大 段距离上排列成行和/或根据“胆留型”几何结构形成它们堆叠的拱形结构特征。也可以 区分原纤维/纤维未有序化的结构域(“各向同性”结构域)。该尺度从微米到毫米变化；-级别5(图Ie)密质骨具有毫米大小的平行圆柱结构排列，表示为“骨单位”。在 截面中，这些骨单位表现为由同心胶原薄片组成；-级别6(图If):长骨的富细胞中心部分称为“松质骨”。在这种骨中，骨片形成薄 且不规则行的大孔网络。密质骨/松质骨组合构成结构级别6。该尺度大于一毫米；-级别7(图Ig)最终级别很明显是全骨。现有技术提出了几类合成材料(表示为“植入材料”)或天然材料(表示为“移植 物”)。植入材料通常为生物惰性的，即被有机体容易耐受；或生物相容的，即它们完美地整 合入宿主有机体。移植物为取自其用于本人的人(同体移植)或第三者(异源移植)的骨 组织，并且其通常为骨传导的(ostSo-conducteur)，即其能够引导骨再生长。然而，能够诱导骨重建的骨诱导性骨替代物构成了理想的替代物。这样的材料的 开发是复杂的。使用这样的材料要求使用具有特殊晶相和化学性质的组分以优化其在人体 或动物体中的完美整合，并且因而避免排斥。必须重建该材料的三维结构以提供适，首先，机械性质；以及其次，适合于宿主组织对所述替代物定植(colonisation)的多孔性。使有 机骨网络(20%质量比)有序化的方法及其与组织中矿物相(70%质量比)的结合在体外 非常难再现。已经进行了许多研究以合成骨替代物，特别是涉及胶原矿化的研究。W. Traub et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989，86，9822-9826]研究了火鸡骨腱胶原的矿化，但获得 的材料没有表现出类似于骨的结构。已经进行了使用体外纯化胶原的其他测试，但在进行 测试的强稀释条件未能获得具有在活骨组织中发现的骨密度和三维胶原结构的材料[参 见 D. Lickorish et al. (J. Biomed. Mat. Res. 2004,68A, 19-27) ；S. Yunoki et al. (Mat. Lett.，2006，60，999-1002) ；D. A. Wahl et al. (Eur. Cell. Mat. 2006,11,43-56)] L. Addadi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987，84，2732-2736)描述了来自在 由(NH4) CO3粉末于环境温度下热分解所产生的氨气氛下的CaCl2溶液的方解石CaCO3结晶。同样已知的是通过升高pH从酸溶液沉淀胶原。R.L. Ehrman et al. (J. Nat. Cancer Inst. 1956,16,1375-1403)描述了使胶原在乙酸中的溶液与NH3蒸气接触的方法。其转化 为含有细粒的凝胶。没有描述所得材料的结构。Μ. M. Giraud-Guille et al. (J. Mol. Biol. 1995，251，197—202)禾口 (J. Mol. Biol. 1992，224，861-873)描述了利用胶原的浓溶液而获得的“液晶”结构和通过从酸到碱 升高PH而获得的溶胶-凝胶转变。G. Mosser,M. M. Giraud-Guille et al. (Matrix Biol. 2006,25,3-13)描述了这样 的方法，其中将胶原的酸性溶液(5mg/mL)在玻璃微室中逐渐浓缩以获得胶原分子的长久 螺旋结构以及浓度梯度。然后使溶液与氨蒸气接触，以形成胶原原纤维并实现液相中的稳 定结构。B. A.Harley et al. (Biomaterials 2006，27，866-874)描述了也含有糖胺聚糖的 胶原结构基质的生产。将胶原微原纤维与硫酸软骨素在4°C下均勻混合。然后将溶液在模 具中离心分离，超速冷冻，冷冻干燥；然后于105°C下，在50mTorr的真空下交联M小时。没 有描述胶原的纤维状性质。C. Guo et al. (Biomaterials 2007，28，1105-1114)描述了磁性小珠在排列胶原 原纤维溶液中的用途。使维持于4°C下、在磷酸盐缓冲液中制备的浓度为2. 5mg/ml的胶原 溶液与磁性小珠接触。还在细胞的存在下制备了最终胶原浓度为1.2mg/ml的相同样品。 在两种情况下，在通过将温度升高至37°C以诱导原纤维生成期间，将样品置于小于IG的磁 场中。当将细胞整合入基质时还使用CO2气氛。基质是非常松散的，并且没有提及胶原的 纤维性质。M.J. Olsza et al. (Calcif. Tissue Int. 2003，72，583-591)描述了存在或不存 在聚(天冬氨酸)型聚合物的条件下的胶原海绵的钙化作用。胶原海绵由获得自牛腱的I 型胶原构成。矿物为碳酸钙而不是磷酸钙，因此没有获得磷灰石相。没有证明条纹纤维的 存在，并且胶原纤维是无取向的。J. H. Bradt et al. (Chem. Mater. 1999，11，2694-2701)描 述了在4°C下制备两种溶液的方法，第一种为用HCl酸化并含有CaCl2的lmg/mL胶原溶液 (小牛真皮I型胶原)，第二种为含有磷酸根离子的缓冲溶液。然后将磷酸盐溶液与胶原溶 液混合，使得可以实现6. 8的pH，并将整体混合物加热到30°C。共沉淀得到含有磷酸钙、羟 基磷灰石和磷酸八钙的混合物相。另外，胶原纤维为分离的无取向纤维，并且不构成致密基 质。N. Gehrke, N. Nassif et al. (Chem. Mater. 2005，17，6514-6516)描述了在存在或不存在聚(天冬氨酸)型聚合物的条件下，用碳酸钙将预先去矿化的珍珠母的有机网络再矿化。目前没有已知的合成方法使得可以获得这样的骨替代物，其再现在天然骨中所观 察到的与磷灰石晶体矿物相结合的胶原的级别4的三维结构。
发明内容
本发明的目的是提供合成材料及其制备方法，所述合成材料可以用作结构非常接 近活骨(级别4)结构的生物相容性骨替代物。本发明的合成材料包含有机相(I)和矿物相(II)。所述有机相(I)包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，以及它们未有序化 的各向同性结构域，其中所述条纹的周期为约67nm，所述原纤维是根据联合了排列成行的 结构域和胆留型结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的。所述矿物相(II)包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包 含至少钙离子和至少磷酸根离子。在本发明的材料中，所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原 纤维的纵轴共排列。所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。在所述材料中，各种结构域(胆甾型、线型和各向同性)的数量级为约50微米。根据一具体实施方案，矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。对本申请的目的而言，术 语“纯羟基磷灰石”旨在表示不含诸如透钙磷石的其他结晶磷酸盐相的羟基磷灰石。在本发明的一具体实施方案中，矿物相由化学计量的下式(I)的羟基磷灰石晶体 组成Ca10 (PO4)6(OH)2(I)根据本发明的一具体实施方案，式(I)的羟基磷灰石晶体的Ca/P原子比为1. 67。根据本发明的另一实施方案，矿物相包含磷灰石晶体，其还包含至少氢氧根离子， 其中磷酸根离子(B型)和/或氢氧根离子(A型)部分地由碳酸根离子代替。在这些羟基磷灰石中，晶体结构的一个或多个位置可以不含离子。在这种情况下， 它们为包含称为一个或多个离子间隙的非化学计量羟基磷灰石。在另一实施方案中，矿物相包含磷灰石晶体，其包含Ca2+离子、PO43-离子和0H—离 子，其中Ca2+、PO43-或0H—离子的至少一种部分地由其他离子代替。在能够部分地代替Ca2+离子的离子中，可以提及Mg2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Zn2\ Cd2+、 Pb2+、Na+、K+ 和 Eu3+离子。在能够部分地代替P043_离子的离子中，可以提及C032_、Si043_、As043_、Mn043_、V043_、 CrO43-和 HPO42-离子。在能够部分地代替0H—离子的离子中，可以提及C032—、F—、Cl—、Br—、Γ、S2—和02_离子。本发明的材料还可以含有少量的蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分 子。术语“少量”意图表示小于2%的比例。本发明材料的特征可以通过光学显微镜分析、扫描电子显微镜SEM分析、透射电 子显微镜TEM分析和X-射线衍射分析确定。
通过偏振光光学显微镜观察到本发明材料的半薄部分显示出双折射的性质。在理 想的情况下，在显微平台旋转期间，对与这些条纹的运动有关的交替亮带和暗带的观察表 明了螺旋结构。通过SEM分析，本发明材料的样品显示出包埋于矿化层中的定向原纤维，并且无 约一毫米的单独晶体聚集。对本发明材料所拍的小角X-射线散射照片显示出胶原原纤维的各向异性信号和 D = 67nm的谐波周期。广角X-射线散射照片显示出磷灰石相的主峰。原纤维信号与矿物 信号之间存在的共排列表征了本发明的材料。更特别地在原纤维排列成行的区域中局部地 证实这一共排列。本发明的材料可以通过以下方法获得制备作为有机相(I)的前体的胶原的初始 酸性水溶液，以及至少一种矿物相(II)的前体的水溶液；并且通过将PH升高到至少7来沉 淀该胶原。其特征在于-胶原在酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定；-矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐，-矿物相(II)的沉淀通过使矿物相前体溶液与有机相(I)接触来进行，所述接触 在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。接触的持续时间根据沉淀速度和最终材料中预想 的矿物填充物水平而设置。在所述方法的第一实施方案中，将有机相(I)的胶原在使其与矿物相(II)的前体 的中性溶液接触前沉淀。在这种情况下，矿物相(II)的前体的溶液包含至少所述钙盐和至 少所述磷酸盐。最终材料中矿物相的比例通过引入溶液的离子的量来调节。在该实施方案 中，胶原在使其与矿物相接触前要求其纤维结构。在所述方法的第二实施方案中，使有机相(I)的前体的酸性溶液与(II)的前体的 酸性溶液接触。然后升高混合物的PH，这导致胶原与磷灰石的共沉淀。在该实施方案中，特 别重要的是保持胶原的初始浓度恒定。避免稀释的第一种方法是在模具中含有有机相(I) 的前体的浓酸性溶液，该模具的形状适合于期望的用途，并且封入渗析膜中。第二种方法是 将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包膜(erweloppe)中。然后将模具或所述包膜浸入 矿物相(II)的前体的溶液中。当本发明的材料的矿物相II由纯羟基磷灰石的晶体组成时，所述方法优选在密 闭室中进行，该密闭室中放置了 -至少一个第一容器，其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液，其是矿物 相II的前体，其中将至少一个渗析袋浸入该溶液中，所述渗析袋含有作为有机相(I)的前 体的胶原的初始酸性水溶液，-至少一个第二容器，其含有氨水溶液或(NH4)2CO3粉末；应当理解_(矿物相I前体溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为约2X 10_3，-包含于第一容器中的矿物相I前体溶液的高度为约3cm至5cm，所述容器的直径 为约2 cm至5 cm ；_(氨水溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为8X10_3，或者((NH4)20)3粉末的体 积)/(密闭室内部体积)比为约6X10_3。
当具备这些条件时，获得了其中矿物相II由纯磷灰石组成、不含任何其他类型磷 酸钙相的材料。
权利要求
1.一种包含有机相(I)和矿物相(II)的合成材料，其特征在于-所述有机相(I)包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，以及它们未有序化的各 向同性结构域，其中所述条纹的周期为67nm，所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域 和胆留型结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的；-所述矿物相(II)包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包含至 少钙离子和至少磷酸根离子；-所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列；-所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。
2.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。
3.如权利要求1或2所述的材料，其特征在于所述矿物相由化学计量的下式(I)的羟 基磷灰石晶体组成Ca10(PO4)6(OH)2 (I)。
4.如权利要求3所述的材料，其特征在于式(I)的羟基磷灰石晶体的Ca/P原子比为 1. 67。
5.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体，所述晶体还包 含至少氢氧根离子，其中磷酸根离子和/或氢氧根离子部分地由碳酸根离子代替。
6.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体，所述晶体包含 Ca2+离子、PO43-离子和0H—离子，其中Ca2+、P043_或0H—离子的至少一种部分地由其他离子代 替，应当理解能够部分地代替 Ca2+ 离子的离子选自 Mg2+、CU2+、Sr2+、Ba2+、ai2+、Cd2+、Pb2+、Na+、K+ 和 Eu3+ 离子；能够部分地代替P043_离子的离子选自C032_、SiO43"俄、As043_、Μπ043_、V043_、CrO43"和 HPO42-离子；以及能够部分地代替0H—离子的离子选自C032—、F—、Cl—、Br—、Γ、S2—和02_离子。
7.如前述权利要求中任一项所述的材料，其特征在于其还含有少于2%的量的蛋白聚 糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子。
8.一种制备如权利要求1所述的材料的方法，所述方法在于制备作为所述有机相(I) 的前体的胶原的初始酸性水溶液，以及至少一种所述矿物相(II)的前体的水溶液；并且通 过将PH升高到至少7来沉淀所述胶原，其特征在于-胶原在所述酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定，-所述矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐，-所述矿物相(II)的沉淀通过使所述矿物相前体溶液与所述有机相(I)接触来进行， 所述接触在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于将所述有机相(I)的胶原在使其与所述矿物 相(II)的前体的中性溶液接触前沉淀，所述中性溶液含有至少所述钙盐和至少所述磷酸盐。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于使所述有机相(I)的前体的酸性溶液与所述 矿物相(II)的前体的酸性溶液接触，并升高所得混合物的PH，这导致所述胶原与所述磷灰 石的共沉淀。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于在封入渗析膜中的模具中含有所述有机相 (I)的前体的浓酸性溶液，然后将整体浸入所述矿物相(II)的前体的溶液中。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包 膜中，然后将所述包膜浸入所述矿物相(II)的前体的溶液中。
13.如权利要求8所述的方法，其用于制备其中所述矿物相II由纯羟基磷灰石晶体组 成并且如权利要求2所定义的材料，其特征在于所述方法在密闭室中进行，所述密闭室中 放置了 -至少一个第一容器，其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液，其是所述矿物 相II的前体，将至少一个渗析袋浸入其中，所述渗析袋含有作为所述有机相(I)的前体的 胶原的初始酸性水溶液，-至少一个第二容器，其含有氨水溶液或(NH4)2CO3粉末； 应当理解_(矿物相I前体溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为2X10_3， -包含于所述第一容器中的矿物相I前体溶液的高度为3cm至5cm，所述容器的直径为 约 2 cm 至 5 cm ；_(氨水溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为8X10_3，或者((NH4)2CO3粉末的体积)/ (密闭室内部体积)比为6X10_3。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述胶原的初始酸性水溶液具有下列特征 -其胶原浓度为75mg/mL至1000mg/mL ；-在酸的存在下，其PH小于4。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述矿物相(II)的前体的溶液具有下列特征-钙前体的浓度小于溶度极限；-磷酸盐前体的浓度小于溶度极限；-前体的量是这样的Ca/P摩尔比为1. 5至1. 8。
16.如权利要求8所述的方法，其用于制备如权利要求6所述的材料，其特征在于所述 矿物相的前体的溶液还含有一种或多种盐，所述盐的阳离子用于至少部分地代替Ca2+ ；和/ 或含有一种或多种盐，所述盐的阴离子用于至少部分地代替PO43-和/或0H—。
17.如权利要求8所述的方法，其用于制备如权利要求7所述的材料，其特征在于所述 矿物相(II)的前体的溶液还含有蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子。
18.如权利要求8所述的方法，其特征在于pH的升高借助于碱性气氛进行。
全文摘要
本发明涉及可以用作骨替代物的材料及其制备方法。所述材料包含有机相(I)，其包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，以及它们未有序化的各向同性结构域，所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的；以及矿物相(II)，其包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包含至少钙离子和磷酸根离子；所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列；并且所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。制备所述材料的方法包括制备所述有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，以及至少一种所述矿物相(II)的前体的水溶液；并且通过将pH升高到至少7来沉淀所述胶原。根据该方法胶原在所述酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定；所述矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐；所述矿物相(II)的沉淀通过使所述矿物相前体溶液与所述有机相(I)接触来进行；所述接触在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。
文档编号A61L27/12GK102105179SQ200980125269
公开日2011年6月22日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月30日
发明者F·戈博, G·莫瑟, M·M·吉罗吉耶, N·纳西夫 申请人:国立科学研究中心, 皮埃尔-玛丽-居里大学(巴黎第六大学), 高等研究实践学院