一种人工骨移植物及其制备方法

专利名称：一种人工骨移植物及其制备方法
专利说明一种人工骨移植物及其制备方法 本发明涉及生物医学工程组织移植相关产品的制备的技术领域，具体地说是一种人工骨移植物及其制备方法。目前，由于免疫排斥等因素，文献报道的临床运用组织工程修复骨组织缺损的病例全是利用宿主自身的细胞作为组织工程骨的种子细胞，从而极大的限制了组织产品的大规模生产，只能做一些个体化的治疗。2001年有文献报道以成骨细胞为种子细胞构建的同种异体工程化骨，在异体内末见明显的淋巴细胞浸润，并有新骨形成。(崔鹏程等，组织工程方法构建同种异体工程化骨修复缺损，现代康复2001VoL5 No.22P44-45)。但是，以上方法有如下缺点成骨细胞的获取困难，来源少，造成患者的不同程度新的损伤等，限制了进一步应用。脂肪干细胞是起源于中胚层的成体干细胞，具有包括向成骨细胞分化的多分化潜能。同时，脂肪组织在临床抽脂手术中作为废品丢弃，如利用同种异体脂肪干细胞作为组织工程骨的种子细胞则不但可以解决种子细胞来源问题，也可以不受个体化治疗的限制，适应大规模生产的要求。本发明的目的是在背景技术基础上，提供一种利用组织工程学的方法及原理，把同种异体的脂肪干细胞作为种子细胞，与脱钙骨生物材料支架复合，制备人工骨移植物及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下方法来实现一种人工骨移植物其特征在于所述的移植物含有药学上可以接受的可降解材料、脂肪干细胞。
所述的药学上可以接受的生物可降解材料选自天然珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、β-TCP、脱钙骨、藻酸盐、去蛋白骨、纤维蛋白凝胶、胶原凝胶、聚乳酸、聚醇酸及其共聚体、聚乳酸和聚羟基酸类、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等多糖类物质种的一种或几种。
脂肪干细胞为同种异体脂肪干细胞或自体脂肪干细胞或经基因修饰、改造的脂肪千细胞。所述的移植物内还可以含有未降解的脱钙骨材料。而所述的生物可降解材料复合物为脱钙骨。
一种人工骨移植物的制备方法，包括以下步骤(1)使用培养液DMEM对脂肪干细胞进行培养扩增，接种前使用成骨诱导液进行培养；(2)将脂肪干细胞接种于药学上可以接受的生物可降解材料；(3)在适合的生长条件下培养，从而形成脂肪干细胞-药学可接受的生物可降解材料复合物；其中该培养步骤包括两个阶段i.将步骤(2)获得的复合物，不加培养液静置2-6个小时；ii将(i)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO2，和饱和湿度条件下培养3-15天，从而使脂肪干细胞增殖，分泌基质，形成工程化的骨组织代替物。
更具体的来说，该人工骨移植物的包括以下步骤(1)脂肪组织的取样及给预处理从生物体内分离出脂肪组织并装入离心管，然后用无菌的PBS反复冲洗至抽吸物溶液变清，再加入等体积0.01-0.5％I型胶原酶，在恒温摇床消化20-100分钟，离心10分钟，获得同密度的细胞沉淀物，倾去上清液和漂浮的黄色组织，将细胞振荡混匀，加入DMEM及10％FBS培养液使细胞重悬；(2)接种吸取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏红细胞，血细胞计数仪常规计数有核细胞数，按1×105-1×106有核细胞/cm2细胞密度接种于培养皿内，加入适量的培养液；(3)培养与传代将接种好细胞的培养皿置于一定的条件下，培养24小时后首次换液并用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM及10％FBS培养液，每周换液2次，细胞融合至80％传代，传代前用少量PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA 2ml，再加入2ml含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1×103-1×104/cm2细胞密度接种于新的培养皿内，5-6天达到融合状态，继续传代培养；(4)成骨诱导培养第二代的脂肪干细胞用成骨诱导液进行成骨诱导培养，培养条件同前，等细胞长到90％左右融合时，消耗收集细胞待用；(5)脂肪干细胞复合物成骨的诱导将生物材料支架消毒灭菌，然后用培养液浸润，在培养箱内培养48小时，确定无菌后，吸干，再调整脂肪干细胞密度为5-30×106/ml，将细胞悬液均匀接种在2.5×2cm2的生物材料上，静置2-5小时后加成骨诱导培养液，体外培养5-7天，然后用PBS洗涤3-5次，即可得成品。
所述的成骨诱导液的成分为低糖DMEM、β-磷酸甘油钠10nM/L、地塞米松10nM/L、L-α-磷酸抗坏血酸50μM/L、L-谷氨酰300mg/L、125(OH)2VD310nM/L、10％胎牛血清。还可以根据具体的情况进行调整。
脂肪干细胞接种的量为1×106-1×108个细胞/g生物可降解材料复合物。
本发明同现有技术相比，利用组织工程学的方法及原理，把同种异体的脂肪干细胞作为种子细胞，解决了种子细胞来源问题，也可以不受个体化治疗的限制，适应大规模生产及利用的要求。

图1为成品组织学观察的人工骨移植物的结构示意2为电镜观察的人工骨移植物的结构示意3为三维CT显示缺损的部位的示意4为修复部位的新骨的结构示意5为修复部位的新骨的结构示意6为修复部位的新骨的结构示意图参见图1，图2，图3，图4，图5，图61为脂肪干细胞，2为脱钙骨，3为分泌的基质，4为颅骨完全修夏的部位，5为新生骨组织，6为未降解脱钙骨材料图1显示脱钙骨的周围较均匀的分布着脂肪干细胞。图2所示脱钙骨上细胞生长旺盛，并有基质的分泌。
图3显示修复一年后，三维CT显示缺损的部位完全修复，边缘与宿主骨整合良好。而如图4、5、6所示，修复部位的中心的新骨形成良好。以下结合具体实例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。这种制造技术对本专业的人员来说还是清楚地。
(1)脂肪组织的取样及给预处理从生物体内分离出脂肪组织。将分离出的脂肪组织在无菌的条件下装入50ml的离心管中，带回实验室，时间不超过2小时。然后用无菌的PBS反复冲洗至抽吸物溶液变清，以去除血细胞。加入等体积0.01-0.5％I型胶原酶，在37℃恒温摇床消化20-100分钟，1200rpm离心10分钟，获得高密度的细胞沉淀物，轻轻倾去上清液和漂浮的黄色组织，将细胞振荡混匀，加入DMEM及10％FBS培养液使细胞重悬。
(2)接种吸取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏红细胞，血细胞计数仪常规计数有核细胞数，按1×105-1×106有核细胞/cm2细胞密度接种于培养皿内，加入培养液8ml。
(3)培养与传代将接种好细胞的培养皿置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下，培养24小时后首次换液。倒置相差显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞，用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM及10％FBS培养液。每周换液2次，细胞融合至80％传代。传代前用少量PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA2ml，见大部分细胞胞质回缩、形态变圆，加入2ml含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1×103-1×104/cm2细胞密度接种子新的培养皿内，5-6天达到融合状态，继续传代培养。
(4)成骨诱导培养第二代的脂肪干细胞用成骨诱导液进行成骨诱导培养，诱导液的成分为低糖DMEM、β-磷酸甘油钠10nM/L、地塞米松10nM/L、L-α-磷酸抗坏血酸50μM/L、L-谷氨酰胺300mg/L、1.25(OH)2VD310nM/L、10％胎牛血清。培养条件同前，等细胞长到90％左右融合时，消耗收集细胞待用；(5)脂肪干细胞复合物成骨的诱导将生物材料支架消毒灭菌，然后用培养液浸润，在培养箱内培养48小时，确定无菌后，吸干。调整脂肪干细胞密度为5-30×106/ml，将细胞悬液均匀接种在2.5×2cm2的生物材料上，静置2-5小时后加成骨诱导培养液，体外培养5-7天，然后用PBS洗涤3-5次，即可得成品。
调整脂肪干细胞密度为5-30×106/ml，均匀接种在2.5×2cm2的生物材料上，静置2-5小时后加成骨诱导培养液，体外培养5-7天，然后用PBS洗涤3-5次，即可得成品。
成品组织学观察如图1所示，脱钙骨的周围较均匀的分布着脂肪干细胞，电镜观察如图B所示脱钙骨上细胞生长旺盛，并有基质的分泌。
(6)修复同种异体狗的颅骨缺损选择与取脂肪组织不同的另外一条狗，将其全身麻醉。逐层分离狗头颅的皮肤至颅骨，造成2.5×2cm2面积的颅骨缺损。将上述的组织工程化骨小心的嵌入造成的缺损部位，止血。逐层缝合头皮的各层皮肤组织。术后给予抗生素抗炎。
修复结果颅骨缺损即刻修复，组织工程化骨与宿主缺损对合整齐。修复一年后，三维CT显示缺损的部位完全修复，边缘与宿主骨整合良好。图3显示修复一年后，三维CT显示缺损的部位完全修复，边缘与宿主骨整合良好。而如图4、5、6所示，修复部位的中心的新骨形成良好。
权利要求
1.一种人工骨移植物其特征在于所述的移植物含有药学上可以接受的可降解材料、脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人工骨移植物其特征在于所述的药学上可以接受的生物可降解材料选自天然珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、β-TCP、脱钙骨、藻酸盐、去蛋白骨、纤维蛋白凝胶、胶原凝胶、聚乳酸、聚醇酸及其共聚体、聚乳酸和聚羟基酸类、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等多糖类物质种的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种人工骨移植物其特征在于所述的脂肪干细胞为同种异体脂肪干细胞或自体脂肪干细胞或经基因修饰、改造的脂肪干细胞以及中胚层间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种人工骨移植物其特征在于所述的移植物内还可以含有未降解的脱钙骨材料。
5.一种人工骨移植物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)使用培养液DMEM对脂肪干细胞进行培养扩增，接种前使用成骨诱导液进行培养；(2)将脂肪干细胞接种于药学上可以接受的生物可降解材料；(3)在适合的生长条件下培养，从而形成脂肪干细胞一药学可接受的生物可降解材料复合物；其中该培养步骤包括两个阶段i.将步骤(2)获得的复合物，不加培养液静置2-6个小时；ii.将(i)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO2，和饱和湿度条件下培养3-15天，从而使脂肪干细胞增殖，分泌基质，形成工程化的骨组织代替物。
6.根据权利要求5所述的一种人工骨移植物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)脂肪组织的取样及给预处理从生物体内分离出脂肪组织并装入离心管，然后用无菌的PBS反复冲洗至抽吸物溶液变清，再加入等体积0.01-0.5％I型胶原酶，在恒温摇床消化20-100分钟，离心10分钟，获得同密度的细胞沉淀物，倾去上清液和漂浮的黄色组织，将细胞振荡混匀，加入DMEM及10％FBS培养液使细胞重悬；(2)接种吸取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏红细胞，血细胞计数仪常规计数有核细胞数，按1×105-1×106有核细胞/cm2细胞密度接种于培养皿内，并加入培养液；(3)培养与传代将接种好细胞的培养皿置于一定的条件下，培养24小时后首次换液并用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM及10％FBS培养液，每周换液2次，细胞融合至80％传代，传代前用少量PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA 2ml，再加入2ml含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1×103-1×104/cm2细胞密度接种于新的培养皿内，5-6天达到融合状态，继续传代培养；(4)成骨诱导培养第二代的脂肪干细胞用成骨诱导液进行成骨诱导培养，培养条件同前，等细胞长到90％左右融合时，消耗收集细胞待用；(5)脂肪干细胞复合物成骨的诱导将生物材料支架消毒灭菌，然后用培养液浸润，在培养箱内培养48小时，确定无菌后，吸干，再调整脂肪干细胞密度为5-30×106/ml，将细胞悬液均匀接种在2.5×2cm2的生物材料上，静置2-5小时后加成骨诱导培养液，体外培养5-7天，然后用PBS洗涤3-5次，即可得成品。
7.根据权利要求5所述的一种人工骨移植物的制备方法，其特征在于所述的成骨诱导液的成分为低糖DMEM、β-磷酸甘油钠10nM/L、地塞米松10nM/L、L-α-磷酸抗坏血酸50μM/L、L-谷氨酰300mg/L、1.25(OH)2VD310nM/L、10％胎牛血清。
8.根据权利要求5所述的一种人工骨移植物的制备方法，其特征在于脂肪干细胞接种的量为1×106-1×108个细胞/g生物可降解材料复合物。
9.根据权利要求5所述的一种同种异体脂肪干细胞构建组织工程化骨的制备方法，其特征在于所述的生物可降解材料复合物为脱钙骨。
全文摘要
本发明涉及生物医学工程组织移植相关产品的制备的技术领域，具体地说是一种人工骨移植物及其制备方法。一种人工骨移植物其特征在于所述的移植物含有药学上可以接受的可降解材料、脂肪干细胞。一种人工骨移植物的制备方法，包括以下步骤(1)使用培养液DMEM对脂肪干细胞进行培养扩增，接种前使用成骨诱导液进行培养；(2)将脂肪干细胞接种于药学上可以接受的生物可降解材料；(3)在适合的生长条件下培养，从而形成脂肪干细胞－药学可接受的生物可降解材料复合物；本发明同现有技术相比，利用组织工程学的方法及原理，把同种异体的脂肪干细胞作为种子细胞，解决了种子细胞来源问题，也可以不受个体化治疗的限制，适应大规模生产及利用的要求。
文档编号A61L27/36GK1709522SQ20051002755
公开日2005年12月21日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者丁勃元 申请人:上海赐人合元企业发展有限公司