设计肽的pcv2疫苗的制作方法

专利名称：设计肽的pcv2疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于肽的抗2型猪圆环病毒(porcine circovirus type2 ;PCV2)疫苗以及制备所述疫苗的方法，所述疫苗用于保护仔猪甚至在短效但相对高滴度的母体来源的抗PCV2抗体的存在下抵抗PCV2感染。依据本发明的各个实施方案的疫苗制剂包含一种来源于开放阅读框架2(openreading frame2 ；0RF2)-编码的衣壳蛋白的肽，此肽任选地连接人工T辅助细胞表位(artificial T helper epitope)以增强其B细胞免疫原性,所述肽可以任选地补充包含PCV2T辅助细胞表位的簇的来源于PCV2 ORFl和0RF3的肽混合物，其在兽医学上可接受的递送系统中制备成疫苗制剂。
背景技术：
猪圆环病毒(porcine circovirus ；PCV)于1974年鉴定为猪肾组织培养细胞系(PK15)的微小核糖核酸病毒样污染物(I)。1998年，从猪组织中分离了抗原性和遗传性特异的PCV，并将其命名为2型猪圆环病毒(Porcine cirvovirus type 2 ;PCV2)。PCV2与猪中的临床疾病相关(2)。断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome ；PMWS)，作为一种猪中新出现的且具有经济重要性的疾病，其由PCV2引起。然而，证据显示PMWS体征的出现需要病原诸如猪细小病毒(Porcine parvovirus ；PPV)的共同感染或类似的免疫刺激物、胁迫或辅因子。这种综合征使7到15周龄的猪衰弱，伴随有衰竭(wasting)、呼吸窘迫、淋巴结肿大、腹泻、苍白及黄疸。并且，肉眼可见的(gross)及组织学损伤可以影响多器官系统并且与间质性肺炎(interstitial pneumonia)、淋巴结病(Iymphadenopathy)、月干炎(hepatitis)、肾炎(nephritis)、心肌炎(myocarditis)、肠炎(enteritis)、皮肤炎(dermatitis)及胰腺炎(pancreatitis)相关(1,3)。
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追溯起来，早在1973年即可在猪血清中检测到PCV2特异性抗体⑷。PMWS的诊断依赖于与被感染的组织中损伤相关的PCV2特异性核酸或抗原的检测。已经从心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、唾液腺、淋巴结、甲状腺、胸腺、胃肠道、粪便、胰脏、睪丸及脑中分离了所述病毒(1，5)。主要的传播途径不明，但是证据显示PCV2可以横向和垂直传播。其已在天然感染的猪的眼、鼻和粪便样品中检测到。由流产的猪胎儿组织中分离到PCV2表明可以垂直传播。由自然感染及实验感染的公猪精液中检测到PCV2核酸表明从公猪到未感染PCV2的母猪及其仔猪的传播(5)。2型猪圆环病毒(PCV2)是一种小型无包膜病毒，带有环状单链DNA (single-strand DNA ;ssDNA)基因组。基因组包含六个编码推定蛋白(putativeproteins)的开放阅读框(ORFs) (2)，其中四个ORFs与非致病性的I型猪圆环病毒(Porcine cirvovirus type I ；PCV1)类似的ORFs具有显著的相似性(6)。在PCV2感染的细胞中仅已经检测到由0RF1、0RF2及0RF3编码的蛋白。ORFl编码312个氨基酸的复制酶蛋白，另外也产生一个168个氨基酸的剪接变体，二者均是PCV2复制所必需的(7)。结构性衣壳蛋白(capsid)由0RF2编码⑶；0RF3编码非复制必需但是在PCV2诱导的细胞凋亡(apoptosis)及致病性中起重要作用的高度保守性蛋白(9)。只有暴露于表面的由PCV20RF2编码的衣壳蛋白能够引起宿主免疫系统B细胞的保护性抗体应答(10)。与该观察结果一致，PEPSCAN图谱研究将具有针对PCV2的特异性的B细胞优势免疫表位簇主要定位在PCV2衣壳蛋白上残基65-87、113-139、169-183及193-207的区域(11)。除了 B细胞表位之外，T细胞优势免疫表位，包括T辅助细胞表位，是另一种影响病毒抗原性的重要因子。T辅助细胞表位激发保护性T辅助细胞(Th)应答，其传导信号至B细胞以产生抗体。利用20mer肽进行的PCV2的T细胞表位图谱及淋巴细胞增殖测定显示，与B细胞表位在衣壳蛋白上的位置(11)相比，免疫优势Th应答更一致性地定位在ORFl及0RF3的非结构蛋白上的表位，然而0RF2编码的线性Th表位无一表现出免疫优势(12)。通过合成肽向免疫系统呈递Th决定簇是控制合成肽的免疫原性的关键因素。具有免疫优势且泛宿主性的Th表位高度且广泛地在不同类型的MHC群体中反应(13)。因此，衣壳蛋白上缺少免疫优势Th位点帮助解释关于PCV2的亚单位衣壳蛋白疫苗的有限的免疫原性。肽亚单 位免疫原的免疫原性可以通过将靶向的B细胞表位与所选的外源泛宿主性Th位点共价连接来加强，所述外源泛宿主性Th位点包括通过组合化学增强其遗传反应性的泛宿主性Th表位(14，15，16)。另外，疫苗在猪中的免疫功效及疫苗提供的保护猪免受病毒感染的可受到病毒的多个Th表位影响，且这些可以与来自不同蛋白的B细胞表位组合形成交叉保护性(17)。对于保护仔猪抵抗PCV2相关疾病(如PMWS)的低成本高特异性疫苗存在需求。用于猪的传统疫苗是基于灭活的完整PCV2病毒。然而，PCV2在细胞培养中无法复制以达到高滴度，使得传统疫苗成本高且功效低。替代的疫苗基于重组PCV2 0RF2抗原。PCV2 0RF2衣壳蛋白亚单位已经在多个表达系统中表达，包括在昆虫细胞中的杆状病毒(baculovirus)表达系统中表达(3，10)。在大部分应用中，将产生重组PCV2衣壳蛋白的昆虫细胞裂解并且配制成用于接种仔猪的疫苗。此种重组抗原通常含有宿主细胞及载体-编码的抗原，因此使得所述疫苗非特异性，且可能引起严重的不适当的免疫应答，包括过敏性反应。使用灭活的PCV2病毒疫苗及使用作为重组病毒裂解物或作为纯化的蛋白的亚单位衣壳蛋白疫苗的另一个问题是在正常的田间仔猪中使用时功效相对低。因为田间仔猪通常带有母体来源的抗体(maternally-derived antibodies ;MDA),因此这些疫苗通常在无特定病原(specific-pathogen-free ;SPF)的仔猪或剖宫产禁食初乳(cesarean-derivedcolostrums deprived ;⑶⑶)的仔猪中检测。这些母体抗体,尽管典型地滴度太低且持续时间太短而无法提供足够的保护，但仍然高得足以干扰接种。MDA的这种干扰可以通过施用高剂量的重组0RF2衣壳蛋白抗原部分克服(18)。在US2009/0022749A1中公开，通过杆状病毒表达系统将重组全长0RF2抗原分泌到培养基中(19)。该系统可部分减轻低产率及纯度的问题；但是，该系统及其他生物学表达系统存有全长PCV2抗原制剂的固有的有限的免疫原性，并且其具有根源在于不可再现性、低产率和复杂的质量控制流程的成本问题。因此，需要通过合理设计过程开发PCV2疫苗，通过该设计过程设计并且合成免疫原性肽。所述基于肽的疫苗可以设计成含有衣壳蛋白-特异性的B细胞表位、有效的外源Th表位及来源于其他PCV2蛋白的PCV2Th表位，并且作为疫苗制剂的主要成分组合使用，从而激发精准地抵抗仔猪中的PCV2感染的抗-衣壳蛋白抗体应答。用于病毒疫苗的免疫原性肽的合理设计起始于通过表位作图法鉴定免疫优势表位。表位作图法利用对应于靶向的病毒蛋白上的目的区域的重叠肽的位点来鉴定作为免疫原性决定簇参与同免疫系统的相互作用的位点。更通常地，表位作图法利用长度相对短的肽精准地检测线性决定簇。“PEPSCAN”已知为一种快速的表位作图法，其基于与固体支持物偶联的数百条重叠肽的同时合成。检测所述偶联的肽结合抗体的能力或刺激T细胞增殖的能力。这一方法有效地定位线性的B细胞及T细胞决定簇；然而，靶向的病毒或蛋白的对于疫苗开发重要的免疫优势B细胞表位通常是长的高亲和性的不连续表位，难以通过PEPSCAN方法确定(20)。对于可以通过可控制的且可重现的固相肽合成技术化学合成毫克至千克量级的带有长的不连续表位的免疫原性PCV2肽的鉴定存在需求。这种用于合成PCV2衣壳蛋白免疫原的可控制的商业级别的工艺，以及表征所述肽产品的直接方式，将提供关于PCV疫苗制剂的低成本商业级别制造及质量控制的架构(21)。参考文献:1.Allan GM, and Ellis JA.Porcine circoviruses:A review(猪圆环病毒:综述).J Vet Diagn Invest (兽医诊断研究杂志)2000 ; 12:3-14.
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发明概述本公开内容涉及包含肽或肽组合物的2型猪圆环病毒(porcine circovirustype2 ；PCV2)疫苗，其中所述肽或肽组合物通过筛选重叠的短和长PCV2衣壳蛋白肽的血清学反应性而被最优化。此类经验性发现检测了 GenBank登记号AAN62766示例的PCV2衣壳蛋白内的免疫优势B细胞表位簇。具体地，发现该免疫优势B细胞表位簇存在于PCV2衣壳蛋白的154个氨基酸的长肽中(肽Capl，SEQ ID NO:1，也显示在表I中)。此肽作为主要的免疫原结合在基于肽的疫苗中，以引发抵抗PCV2感染的保护性抗体和细胞介导的免疫应答，并且通过另外的外源和PCV2-来源的T细胞表位而被增强。所述肽免疫原有效用于配制抗PCV2的疫苗。本发明的多个实施方案涉及用于制备作为引发能够保护仔猪抵抗PCV2感染的疫苗的所述肽、肽组合物和药物组合物的方法，以及用于制备用于检测PCV2感染的诊断试剂盒的方法。本发明的多个实施方案涉及疫苗制剂，所述疫苗制剂包含设计的来源于0RF2衣壳蛋白的PCV2 Capl肽(SEQ ID NO:1)、及其同源物和类似物。在这些制剂中的PCV2Capl肽优先地但任选地被连接到人工组合的T辅助细胞表位(SEQ ID NO:2，也显示在表I中)来增强其B细胞免疫原性。此PCV2Capl肽还可以任选地与含有PCV2 Th表位簇的PCV20RF1 (SEQ ID NOS:3及4)及0RF3(SEQ ID NOS:5)肽(也显示在表I中)的混合物混合。所述基于肽的PCV2疫苗制剂可以在仔猪中引发对抗PCV2感染的PCV2-特异性抗体应答，所述仔猪包括可能带有能够干扰接种的母体来源的抗体(MDA)的仔猪。所述设计的基于的肽的疫苗包含可工业应用的毫克至千克级别化学合成并易于进行质量控制的作为免疫原的肽组合物。本发明多个实施方案还提供佐剂和/或递送载体以及疫苗制剂中常规结合的其他成分。

附图简述

图1A是显示根据本发明的一个实施方案，通过免疫荧光检测结合到共转染的HTK细胞系细胞的核内的衣壳蛋白上的针对PCV2衣壳蛋白的抗体的机制的示例。该示例显示HTK细胞感染17聚合酶重组痘苗病毒(T7/vac) (22)并通过lipofectamine 技术(Invitrogen)共转染pCR_orf2质粒。重组衣壳蛋白在其翻译后转运到核中(23)。依据本发明的一个实施方案，抗-衣壳蛋白抗体结合到转染的HTK宿主细胞的核中，在此处可以通过标记的二级抗体的免疫荧光检测到它们。该方法能够通过在HTK细胞中由原核T7启动子介导的全长PCV2衣壳蛋白的瞬时真核表达而高特异性检测针对真正的PCV2衣壳蛋白的抗体。

图1B显示依据图1A描述的机制进行的免疫荧光测定(IFA)。检测到具有结合到核内的衣壳蛋白上的针对PCV2衣壳蛋白的抗体的共转染HTK细胞系细胞。图2是在常规农场饲养的带有地方性PCV2感染的仔猪经过八次基于Capl肽的PCV2疫苗制剂的免疫后的免疫原性的图，剂量如表5所述。免疫原性通过基于PCV2 Capl肽的ELISA法评估(滴度以Logltl表示)。图3A是未接种的猪感染PCV2后的肾脏照片。损伤被括了出来(*)。图3B是未被感染的接种的猪的肾脏照片，一为剖面图(左)，一为完整图(右)。闪光的光反射被括了出来(**)。发明详述肽抗原可以检测免疫应答，并且某些肽抗原还可以刺激免疫应答。多种肽抗原可以用来灵敏且特异性的检测免疫应答，但是最常见的是，其本身不作用为免疫原。肽免疫原是一类特殊的肽抗原，其可以用来刺激免疫应答以及检测它们。依据本发明的一个实施方案，所述PCV2疫苗中的肽抗原为具有B细胞和T辅助细胞(Th)表位的肽免疫原，两种表位共同作用以刺激产生保护性免疫应答，除此之外，所述肽免疫原还能够用来检测针对PCV2感染的免疫应答。一种鉴定B细胞表位的方法是依赖于一组多种长度(长度典型地为20到60个残基或更长)的巢式重叠肽。这些较长的肽是利用一系列费力的独立的固相合成技术合成的，而非利用快速且同步的PEPSCAN合成技术合成。然后，得到的各组巢式重叠肽可以用于抗体结合研究和实验上的免疫，以鉴定出最好存在免疫优势决定簇的长肽，其包括不连续的构象B细胞表位。这种方法已用于选择CD4上的非线性决定簇(CD4用在疫苗中以阻断HIV的gpl20糖蛋白的结合)(24)，并且用于由口蹄疫病毒的VPl蛋白G-H环结构域设计有效的肽抗原(25)。本发明的一个实施方案提供PCV2 0RF2-编码的衣壳蛋白肽，其包含具有用于最佳抗体识别的B细胞表位簇的154mer氨基酸序列(SEQ ID NO:1，也显示在表I中)。这些抗原肽凭经验鉴定出来并且用来自PCV2-感染的仔猪的血清样品和ELISA免疫测定形式最优化。可以适用于包含肽抗原的抗体捕获相的任何免疫测定形式，例如，ELISA，都可以用来检测并且定量结合到来自PCV2-感染的猪的血液、血清、或血浆样品中的PCV2衣壳蛋白的特定片段上的抗体。在一个特定的实施方案中，约154个氨基酸的优化的PCV2抗原肽(SEQ ID NO:1)，其对应于全长PCV2蛋白的氨基酸残基47-202，具有PCV2衣壳蛋白上最有效用于通过接种产生保护性抗体和用于通过ELISA检测用于诊断的抗体的免疫原性和抗原性位点。这种高度抗原性和免疫原性的衣壳蛋白肽从多于50种长度为20至170个残基的重叠肽的集合中鉴定出来，设计、合成所述重叠肽并检测其与一组来自感染的仔猪的PCV2阳性血清的反应性。在所检测的多于50种候选肽抗原中，发现PCV2 Capl抗原肽(SEQ ID N0.1)具有免疫优势B细胞表位簇并且具有最显著的且一致性的针对PCV2阳性血清组的抗原性。当在包含该肽序列的疫苗试验中检测时，还证明Capl肽是高度免疫原性的。包含PCV2 Capl抗原性/免疫原性肽(例如，SEQ ID NO:1)的疫苗的制备和应用包含在本发明的多个示例性的实施方案的范围 内。PCV2 Capl免疫原性/抗原性肽发明的特定实施方案进一步定义为SEQ ID NO:1的免疫学功能同源物，其具有来自突变或变体PCV2毒株的相应的序列和构象元件。同源的PCV2 Capl抗原肽具有大致与起源变体PCV2毒株的衣壳蛋白位置47-202相关的氨基酸残基。通过序列比对程序，如ClustalW(由德国欧洲分子生物学实验室(European MolecularBiology Laboratory)的Julie D.Thompson,Toby Gibson和英国剑桥的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)的 Desmond Higgins 提出，算法)，容易证实所述同源物。表2显不选取的不同PCV2毒株的由GenBank登记号鉴别的11条Capl抗原序列的ClustalW比对。表2中比对的Capl同源物的起始PCV毒株包括基因型2a，2b，2d，l/2a的病毒，并且这些不同的毒株由中国台湾、中国大陆、美国、加拿大、巴西、西班牙、德国和丹麦的动物分离。表2还示例了作为共有Capl序列的同源物，其中分配到可变位置的氨基酸是最常用于这些位置的那些。在一个实施方案中，同源物具有PCV2衣壳蛋白的约位置47的氨基酸至约位置202的氨基酸的氨基酸序列。本发明的同源物进一步定义为与SEQ ID NO:1具有至少80%的同一性。在一个实施方案中，变体毒株同源物与SEQ ID NO:1具有至少85%的同一性。在另一个实施方案中，变体毒株同源物与SEQ ID NO:1具有至少90%的同一性。在另一个实施方案中，变体毒株同源物与SEQ ID NO:1具有至少95%的同一性。本发明的其他实施方案提供PCV2 Capl抗原肽的免疫学功能类似物。Capl肽的免疫学功能类似物包括SEQ ID NO:1的变体和保留与原始抗原肽基本上相同的抗原性和免疫原性的同源物。例如，作为SEQ ID NO:1的功能类似物或同源物的变体可以具有氨基酸位置的保守性置换；总电荷的改变；与另一个结构部分的共价连接；或小的添加、插入、缺失或保守性置换和/或它们的任意组合。因此，与PCV2Capl抗原肽(例如，SEQ ID NO: I)结合的抗体也以基本上相似的功效与所述PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物结合。在一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID NO:1或同源物具有至少50%的同一性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID NO:1或同源物具有至少80%的同一性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID NO:1或同源物具有至少85%的同一性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID NO:1或同源物具有至少90%的同一性。在一个实施方案中，PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物包括通过保守性置换、以及通过插入或缺失进行修饰的PCV2Capl抗原肽的形式。在这一实施方案中，可以通过保守性置换修饰SEQ ID NO:1或修饰SEQ ID NO:1的类似物而得到免疫学功能类似物。保守性置换是一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基置换。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性 中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸；和带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，免疫学功能类似物可以通过肽N端、C端的氨基酸添加和/或通过肽中间的插入而进行修饰。在本发明的不同实施方案中，添加是在肽的N端或C端。添加可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基。所述添加可以组成不存在于PCV2衣壳蛋白中并且不改变肽的PCV2衣壳蛋白部分的免疫原性的氨基酸序列。不存在于PCV2衣壳蛋白的添加包括，但不限于，小的带电荷序列(例如，赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸)，能够形成分支结构的氨基酸(例如，eN-赖氨酸)或能够形成环状结构的氨基酸(例如，半胱氨酸)。在本发明一个实施方案中，不存在于PCV2 Capl中的氨基酸序列的添加是5个氨基酸以下。氨基酸添加可以是典型的或非典型的氨基酸或其混合物。在另一个特定的实施方案中，免疫性功能性类似物可以通过肽的N端、C端和/或中间的缺失而进行修饰。在不同的实施方案中，在肽的N端或C端缺失。缺失可以是1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基。在一个特定的实施
方案中，氨基酸缺失为10个氨基酸以下。在另一个实施方案中，PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物包括已经通过电荷改变修饰的PCV2cap抗原肽。所述电荷改变可以是氨基酸置换、添加或缺失的结果，或是共价连接带电分子的结果。电荷改变可以具有这样的结果:与未修饰的肽相比，使得肽更为碱性、更为酸性或更为中性。在特定的实施方案中，通过在N端或C端添加1-5个赖氨酸残基而使肽更为碱性。在更具体的实施方案中，通过在N端添加3个赖氨酸残基而使肽更为碱性。
非限制性举例，本发明的肽的免疫学功能类似物可以具有向末端氨基酸添加I至约5个另外的氨基酸(典型的或非典型的)。例如，可以向该PCV2Capl肽的氨基端添加序列Lys-Lys-Lys而改变电荷。肽可以容易地使用标准技术合成,诸如Merrifield固相合成法以及对所述方法的许多可行的改进方案。肽也可以利用重组DNA技术制备。因此，本发明的多个示例性的实施方案包括编码PCV2Capl抗原肽和PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物的核酸分子及其互补物(compliments)。包含编码PCV2Capl抗原肽和免疫学功能类似物的核酸分子的载体，尤其是表达载体，也包括在本发明的多个示例性的实施方案中。本发明的多个示例性的实施方案还包括包含所述载体的宿主细胞。本发明的多个示例性的实施方案还包括制备PCV2Capl抗原肽和PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物的方法。例如，所述方法可以包括在表达PCV2Capl肽和/或PCV2Capl肽的免疫学功能类似物的条件下培育包含含有编码PCV2Capl抗原肽和/或PCV2Capl抗原肽的免疫学功能类似物的核酸的表达载体的宿主细胞。该实施方案可以使用来源于所述细胞的裂解物或分泌物的可控的且充分定义的免疫原。本发明的一个实施方案提供通过固相合成制备的肽组合物。通过该实施方案的化学方法制备的肽的质量可以被控制和定义，因此，可以保证抗原性、免疫原性和产率的再现性。此外，在肽抗原的制备过程中没有使用生物有害物质，这降低了风险并且消除了对昂贵的生物学防范的需求。由于位点特异性免疫原存在高摩尔浓度的所选表位，保证了利用PCV2CapI抗原肽组合物的疫苗的安全性和免疫功效。在一个实施方案中，本发明的肽被合成。使用定义的Capl合成肽使得在仔猪中用作抗原进行抗体检测和诊断时的假阳性结果最少。使用具有已知的B细胞和Th表位的定义的合成肽作为免疫原在用作疫苗的免疫原性成分时消除了由于存在来源于PCV2-感染的或重组病毒感染的宿主细胞的抗原性`物质或来源于可以共纯化PCV2病毒和/或重组蛋白的重组蛋白表达系统的抗原性物质而引起的不需要的非-PCV2-特异性免疫应答。例如，来自猪的血清可以具有针对宿主细胞的抗体，或针对重组大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母或杆状病毒(baculovirus)的抗体，然后其与基于生物学来源的抗原的诊断检测中使用的抗原性物质交叉反应，并且由具有这些外来免疫原作为成分的疫苗产生的此类免疫应答将是非保护性的。相反，接受本发明的PCV2Capl肽疫苗的猪将会产生专一的免疫应答，避免针对来源于宿主细胞或表达载体的蛋白的不需要的抗体和其他免疫应答，所述蛋白例如来源于重组大肠杆菌、酵母或杆状病毒的与生物学来源的PCV2抗原共同纯化的蛋白。合成肽的这一实施方案还使在制备过程中产生的杂质的干扰最小化。使用长的合成，尽管严格控制偶联效率，但是由于延伸循环过程中的事件，包括氨基酸插入、缺失、置换和提前终止，也会产生肽类似物，由此导致伴随着目标肽合成产生多种肽类似物。然而，此类肽类似物在作为固相抗原用于免疫学诊断目的或作为免疫原用于接种目的的免疫学应用中作为抗原性和免疫原性的贡献者在肽制剂中仍然是适用的。在合成肽免疫学应用的25年的经验中，我们发现，与允许通过小分子药物保留特定药物活性或在与生物来源的药物共同制备的大分子中存在的需要的活性和不需要的毒性的结构可变性范围相比，允许保留目的免疫学活性的结构可变性的范围适应性(accommodating)大得多。这就是为什么肽类似物(有意设计的或由于合成过程中的误差不可避免产生的作为具有与目的肽相似的色谱和免疫学特性的缺失序列副产物的混合物)通常与所需要的肽的纯化制剂一样有效。设计的类似物和意图之外的类似物混合物是有效的，只要开发出有判断力的QC方法来监测制备过程和产物评估过程，从而保证利用这些肽的最终广品的再现性和功效。在本发明的其他实施方案中，肽包含在疫苗组合物中。Th肽的存在可以提高PCV2Capl肽疫苗的免疫原性。PCV2Capl肽(包括上述同源物和类似物)可以与Th表位共价连接和/或混合。在一个实施方案中，具有来源于ORFl和0RF3且不与Capl免疫原连接的免疫优势PCV2Th表位簇，描述为SEQ ID NOS:3-5(也显示在表I中)的Th肽可以用于补充PCV2Capl肽疫苗的免疫原性。包括SEQ ID NOS:3-5的自由肽(不包含共价连接)可以提高疫苗制剂的免疫原性。在另一个实施方案中，PCV2Capl肽(包括上述同源物和类似物)可以通过或不通过间隔区与包含已知含有Th表位的序列的肽共价连接。该实施方案可以提供比不具有共价连接的Th表位的等价Capl免疫原提高的免疫原性。在一个特定实施方案中，包含Th表位的肽被共价连接到PCV2肽的N端和/或C端。在另一个特定的实施方案中，间隔区具有序列Lys-Lys-Lys-e NLys (SEQ ID NO:7),也显示在表I中。在一个实施方案中，包含Th表位的肽共价连接到PCV2Capl肽的氨基端。在一个特定实施方案中，包含Th表位的肽是通过Lys-Lys-Lys- e NLys间隔区连接到氨基端的人工组合的Th肽SEQ ID NO:2 (如在表I中所示)，并且表示为SEQ ID NO:6 (也显示在表I中)。本发明的多个实施方案涉及用于保护猪抵抗PCV2的疫苗组合物。在示例性的实施方案中，疫苗包含免疫原性肽抗原和可接受的递送载体或佐剂。在不同实施方案中，PCV2疫苗组合物包含肽抗原和兽医学上可接受的递送载体或佐剂，其中所述肽抗原包含选自由下列组成的组的氨基酸序列:a)PC V2衣壳蛋白的约第47个位置的氨基酸至约第202个位置的氨基酸；b) SEQ ID NO:1 ；c) (b)的同源物；d) (a)、(b)或(C)的抗原性和免疫学功能类似物；e)具有至少一个保守氨基酸置换、氨基酸添加和/或氨基酸缺失的(a)、(b)、(C)或(d);和f) (a)-(e)的任意组合。在PCV2疫苗的实施方案中，通过添加或缺失I至5个氨基酸而改变肽抗原的电荷。在PCV2疫苗的另一个实施方案中，抗原性和免疫学功能同源物或类似物与PCV2衣壳蛋白大约位置47-202的氨基酸序列的抗原具有至少80%的同一性。在一个特别的实施方案中，肽抗原具有选自由SEQ ID N0s9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19和20组成的组的
氨基酸序列。在PCV2疫苗的另一个实施方案中，所述肽抗原还包含共价连接到所述肽抗原的N端或C端的T辅助细胞表位。在一个特定的实施方案中，T辅助细胞表位共价连接到所述肽抗原的氨基端。在另一个特定的实施方案中，T辅助细胞表位通过具有至少一个氨基酸的间隔区共价连接到肽抗原上。在一个特别的实施方案中，所述T辅助细胞表位为SEQ IDN0:2。在另一个特别的实施方案中，间隔区为SEQ ID N0:7。在一个特定的实施方案中，肽抗原为 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:6。在多个示例性实施方案中，可以使用任意量的免疫原性肽抗原来在动物中引发免疫应答。在一个特别的实施方案中，肽抗原的量为约0.1 yg至约lOOmg。在另一个特别的实施方案中，肽抗原的量为约Iu g至约10mg。在另一实施方案中，肽抗原的量为约IOii g至约lmg。在PCV2疫苗组合物的不同实施方案中，所述组合物还包含三种PCV2T辅助细胞表位肽SEQ ID NOS:3，4和5的等摩尔混合物。在一个特定的实施方案中，SEQ ID NOS:3,4和5的等摩尔混合物的量为约0.1 ii g至约lmg。在一个更具体的实施方案中，SEQ ID NOS:3，4和5的等摩尔混合物的量为约I U g至约100 u g0在多个示例性的实施方案中，可以使用任意类型或任意量的递送载体或佐剂。在一个特定的实施方案中，递送载体或佐剂是Montanide ISA50V2 (—种由矿物油及二缩甘露醇油酸酯(mannide oleate)构成的油性疫苗佐剂,用于制备油包水形式的乳液)、Tween 80 (亦被称为:聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或它们的任意组合。在一个特定的实施方案中，PCV2疫苗组合物包含SEQ ID NO:6的肽抗原和兽医学上可接受的递送载体或佐剂，其中肽抗原的量为约IOy g至约lmg。本发明的 另一个实施方案涉及用于保护具有PCV2MDA或不具有PCV2MDA的仔猪抵抗PCV2感染的方法,所述方法包括施用上述任意示例性实施方案所包括的疫苗。按照本公开内容制备的PCV2Capl肽还可以用于通过在免疫测定的捕获相中(例如，在ELISA检测试剂盒的固相免疫吸附中)使用抗原有效量的肽来检测PCV2抗体。按照本发明的实施方案，任何相容的免疫测定形式都可以与所述肽一起使用。所述形式是普通技术人员公知的，并且已经记述在许多标准的免疫学手册及文章中，例如，参见Harlow等，1988(26)。这些公知的免疫测定形式特别包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫斑点分析、凝集测定、抗体-肽-抗体夹心测定、肽-抗体-肽夹心测定。在一个实施方案中，免疫测定时使用包被有PCV2Capl肽组合物的固相的ELISA。按照本发明的一个实施方案，所述肽能够通过筛查ELISA检测来自于母猪(sow)和育肥小母猪(gilt)、公猪和阉公猪以及仔猪的血清的PCV2感染，用于评估来自于接种前的仔猪的血清的母体来源的抗-PCV2抗体的水平和用于确定接种的仔猪中针对使用PCV2Capl抗原肽、全长衣壳蛋白或灭活的PCV2病毒体的疫苗的免疫应答水平。在一特定实施方案中，可以利用ELISA免疫测定来检测猪血液、血清或血浆样品中抗-PCV2抗体的存在，包括以下步骤:1.将PCV2Capl肽连接到固体支持物上，ii将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品；和ii1.检测与连接到所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。在所述ELISA试剂盒的示例性的应用中，将待检测的猪血清样品稀释在样品稀释剂中，然后在任意抗体(如果存在的话)与肽-致敏的固相结合的条件下与上述一种或多种PCV2Capl肽接触一段时间。去除未结合的物质后(例如，通过用磷酸缓冲的盐水洗涤)，二级复合物与标记的针对猪特异性IgG的抗体或标记的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G接触。这些抗体或蛋白A、G或A/G与二级复合物结合形成三级复合物，并且由于第二抗体或蛋白A或G或A/G用报道分子标记，当进行检测方式时，检测到所述三级复合物。报道分子可以是酶、放射性同位素、荧光团、生物发光分子、化学发光分子、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等。对于ELISA，报道分子优选是酶。下述实施例作用 于举例说明本发明，并且不是用来限制本发明的范围。
权利要求
1.一种2型猪圆环病毒(PCV2)疫苗组合物，其包含肽抗原和兽医学上可接受的递送载体或佐剂， 其中所述肽抗原包含选自由下列组成的组的氨基酸序列: a)PCV2衣壳蛋白的约第47个位置的氨基酸至约第202个位置的氨基酸；b)SEQID NO:1 ； c)(b)的同源物；和 d)(a)至(C)的任意组合。
2.根据权利要求1所述的PCV2疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的PCV2疫苗，其中所述同源物包含选自由SEQID NOs:9-19和20组成的组的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的PCV2疫苗，其中所述肽抗原的电荷通过添加或缺失1-5个氨基酸而改变。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的PCV2疫苗，其还包含共价连接到所述肽抗原的氨基端的T辅助细胞表位。
6.根据权利要求5所述的PCV2疫苗，其中所述T辅助细胞表位通过具有至少一个氨基酸的间隔区共价连接到所述肽抗原的氨基端。
7.根据权利要求5-6任一项所述的PCV2疫苗，其中所述T辅助细胞表位为SEQID NO:2。
8.根据权利要求6或7任一项所述的PCV2疫苗，其中所述间隔区为SEQID NO:7。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的PCV2疫苗，其还包含SEQID NOs:3、4和5的三种PCV2T辅助细胞表位肽的等摩尔混合物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的PCV2疫苗，其中所述肽抗原的总量为约IOyg至约Img。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的PCV2疫苗，其中所述SEQID NOs:3、4和5的等摩尔混合物的总量为约I U g至约100 u go
12.根据权利要求1-11中任一项所述的PCV2疫苗，其中所述递送载体和佐剂选自由下列组成的组:Montanide ISA 50V2、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯和CpG寡核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的PCV2疫苗，其中所述肽抗原为SEQID N0:1或SEQ ID NO:6。
14.一种PCV2疫苗组合物，其包含SEQ ID NO:6的肽抗原及兽医学上可接受的递送载体或佐剂，其中所述肽抗原的量为约10 yg至约lmg。
15.一种保护仔猪抵抗PCV2感染的方法，所述方法包括施用权利要求1-14中任一项所述的疫苗，所述仔猪具有或不具有PCV2母体来源的抗体。
16.一种诊断PCV2感染的方法，所述方法包括下列步骤， a)将肽抗原连接到固体支持物上，其中所述肽抗原包含选自由下列组成的组的氨基酸序列: i)PCV2衣壳蛋白的约第47个位置的氨基酸至约第202个位置的氨基酸；ii)SEQID NO:1 ；iii)(ii)的同源物；和 iv)(i)至(iii)的任意组合； b)将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品，以及 c)检测与连接到所述 固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
全文摘要
本发明记述了包含来源自PCV2衣壳蛋白的肽抗原的猪圆环病毒(PCV2)疫苗组合物。在多个实施方案中，此肽抗原包含衣壳蛋白从约第47位氨基酸至约第202位氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，此肽抗原任选地与人工T辅助细胞表位连接和/或与源自PCV2的ORF1与ORF2蛋白的T辅助细胞表位混合。本发明还记述了使用PCV2疫苗组合物的方法。在多个实施方案中，疫苗组合物在动物中用于预防PCV2感染。在其他实施方案中，PCV2疫苗组合物用作抗原用以诊断PCV2感染。
文档编号A61K39/12GK103108653SQ201080068977
公开日2013年5月15日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者王长怡, 彭文君 申请人:美国联合生物医学公司