专利名称：与甘氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现的制作方法
技术领域：
本发明大体涉及包含氨酰-tRNA合成酶和其他蛋白的新鉴定的蛋白片段的组合物，编码它们的多核苷酸及其互补物，相关剂，及其在诊断、药物发现、研究和治疗应用中的使用方法。
背景技术：
在过去的四十年，氨酰-tRNA合成酶(AARS)被认为是催化tRNA分子氨酰化所必需的管家蛋白，而tRNA分子氨酰化是蛋白翻译过程中遗传信息解码的一部分。AARS在这方面已经得到广泛研究，并且克隆了许多它们的全长序列以进行序列分析并提供生化实验的丰富来源。然而，一些AARS片段和其他蛋白具有意想不到的与氨酰化无关的活性，包括调节超出蛋白翻译的途径的细胞外信号传导活性。一般而言，在全长或亲本蛋白序列的情况下未发现这些意想不到的活性；反而在从其亲本序列去除或切除AARS蛋白片段之后，或者通过表达并充分纯化AARS片段序列，然后测试新的非合成酶相关的活性，发现了这些活性。虽然AARS的全长序列已经知道了一段时间，但是还没有进行系统的实验分析来阐释此类AARS蛋白片段或来自有关或相关蛋白的蛋白片段，或者评价全长AARS蛋白在氨基酸合成之外的新生物活性方面的潜在作用。在本说明书的多个部分，此类AARS蛋白片段、AARS结构域或AARS选择性剪接变体在本文被称为“切除蛋白(resectin) ”。在其最广的范围内，术语“切除蛋白”指已经从其天然的全长或亲本蛋白序列切离或限制(通过蛋白水解、选择性剪接、诱变或重组基因工程)的一部分蛋白，否则其常常掩盖其新的生物活性。同样，还没有进行系统的实验分析以考察此类切除蛋白在治疗各种医学病症中作为生物治疗剂、诊断剂或药物靶的用途，或者它们与人类疾病的潜在关联。作为具有对哺乳动物生命至关重要的已知功能的必需的管家基因，AARS既没有被考虑作为哺乳动物的药物靶，也没有通过标准的基因组测序、生物信息学或类似工作分析它们以鉴定具有非合成酶活性的切除蛋白。同样，标准的生化研究工作已经远离鉴定AARS切除蛋白的生物性质及其潜在的治疗和诊断相关性的方向，这主要归因于之前所理解的其相应的全长亲本AARS的作用。附图简述
图1显示与N端AARS多肽的相对位置和大小重叠的甘氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图1A代表通过质谱分析鉴定的片段，图1B代表通过转录组的深度测序鉴定的片段，以及图1C代表通过生物信息学分析鉴定的片段。图2显示与C端AARS多肽的相对位置和大小重叠的甘氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图2A代表通过质谱分析鉴定的片段，图2B代表通过转录组的深度测序鉴定的片段，以及图2C代表通过生物信息学分析鉴定的片段。图3显示与内部AARS多肽的相对位置和大小重叠的甘氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图3A代表通过质谱分析鉴定的片段，图3B代表通过生物信息学分析鉴定的片段。发明概述本发明的实施方案一般涉及氨酰-tRNA合成酶(AARS)的蛋白片段的发现，所述蛋白片段具有非规范的生物活性，例如细胞外信号传导活性，和/或治疗和诊断相关的其他特性。AARS是所有生物中存在的蛋白合成器的通用且必要元件，但是人类AARS及其相关蛋白具有天然存在的切除变体，具有强大的细胞信号传导活性，促进人类的正常功能。这些蛋白片段的活性不同于AARS公知的蛋白合成活性，并且本发明包括发现和开发这些切除蛋白作为新治疗剂、新发现研究试剂和定向生物制剂和诊断剂的新抗原/靶，可能用于治疗或诊断许多人类疾病，例如炎性、血液学、神经退行性、自身免疫性、血细胞生成、心血管和代谢疾病或疾患。因此，本发明的AARS蛋白片段可以被称为“切除蛋白”或者“appendacrine”。如上所述，术语“切除蛋白”源 自从其全长亲本AARS序列环境切割或切除给定的AARS蛋白片段的过程，而其全长亲本AARS序列通常掩盖其非规范活性。在某些情况下，本发明的AARS蛋白片段和多核苷酸通过该切除过程的发生被鉴定，而不论是天然存在的(例如，蛋白水解的、剪接变体)、人工诱导的还是预测的。术语“appendacrine”衍生自“附加”(来自拉丁语-appender)和“分离”或“分辨”(来自希腊语-crines)，并且也反映了 AARS蛋白片段的一个或多个附加结构域与其相应的全长或亲本AARS序列分离。尽管之前已经显示几种AARS片段具有非合成酶活性，但是有关生物治疗、发现或诊断功用的此类片段的表达、分离、纯化和表征是有限的，并且本领域技术人员不容易将此类活性与整个AARS家族的每个成员或替代片段相联系。在此，利用了系统的方法发现并证实了用于生物治疗发现和诊断功用的20个线粒体AARS和20个胞质AARS (和相关蛋白)的AARS蛋白片段。例如，使用主要鉴定蛋白水解片段的质谱(MS)从生物样品鉴定了本发明的AARS蛋白片段和编码它们的多核苷酸中的某些，并且通过主要鉴定剪接变体的深度测序技术鉴定了其他。使用计算机模拟预测氨基酸序列，例如通过计算机比较来自人类和低等生物的合成酶以及关键区别(例如蛋白酶位点)，鉴定了其他AARS蛋白片段；该方法利用了全长AARS的序列分析，基于分辨具有非规范生物活性的蛋白水解片段和功能结构域的具体标准。AARS的新的切除蛋白是意想不到的，并且它们的差异表达也是意想不到的。特定的切除通常见于不同的处理(例如，从在有或没有血清的培养基中生长的细胞)、不同的生长阶段(例如，成体脑相对于胎儿脑)和不同的组织类型(例如，胰腺相对于肝脏)。尽管在相同的细胞位置以相对比例的量需要所有氨酰tRNA合成酶的规范功能，但所有氨酰tRNA合成酶的表达模式是不同的。人们不会预期一种氨酰tRNA合成酶活性的水平在其他氨酰tRNA合成酶活性不增加的同时增加。质谱和深度测序数据指示氨酰tRNA合成酶切除蛋白确实具有不同的水平并且出现在不同的部位和不同的阶段。此外，AARS蛋白片段可以被表达和纯化至足够高的纯度以分辨其生物性质。之前，片段常常不具有足够的纯度、折叠和稳定性来实现非合成酶活性的适当的生物表征。例如，配合足够纯的、稳定的、可溶的且折叠的切除蛋白使用基于细胞的测定，以揭示其重要的生物治疗、发现或诊断活性。具体说，本发明涉及具有生物治疗、发现或诊断功用的甘氨酰tRNA合成酶的蛋白片段，相关剂和组合物及其使用方法。如本文所描述的，本发明的组合物用于许多诊断、药物发现和治疗应用。优选地，AARS蛋白和片段是纯化的并且保存在适合条件下，达到所述生物治疗、发现或诊断用途所需的程度。某些实施方案包括组合物，包含至少约100、90、80、70、60、50或40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，并且具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。一方面，所述组合物是治疗组合物。在具体实施方案中，组合物基本没有血清。在一些实施方案中，AARS蛋白片段包含非规范活性。在一些实施方案中，非规范生物活性选自:细胞外信号传导的调节、细胞增殖的调节、细胞分化的调节、基因转录的调节、细胞因子生成或活性的调节、细胞因子受体活性的调节、和炎症的调节。在一些实施方案中，对于基于细胞的非规范生物活性，AARS蛋白片段具有小于约 InMJ^] 5nM、约 IOnMj^J 50nM、约 IOOnM 或约 200nM 的 EC5(I。在某些实施方案中，AARS蛋白片段与异源多肽融合。在一些实施方案中，AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非规范活性。在一些实施方案中，AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非规范活性。在某些实施方案中，异源多肽与AARS蛋白片段的N端连接。在某些实施方案中，异源多肽与AARS蛋白片段的C端连接。一方面，在这些实施方案的任何一个中，异源多肽选自由以下组成的组:纯化标签、表位标签、祀向序列、信号肽、膜转位序列和PK调节剂。在某些实施方案中，组合物包含浓度最少约10mg/mL的AARS蛋白片段。在某些实施方案中，组合物包含至少90%单分散的AARS蛋白片段。在某些实施方案中，组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。在某些实施方案中，组合物在4°C下在PBS中以至少IOmg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。在某些实施方案中，组合物在室温下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。本文描述了用于测量切除蛋白的此类特征的各种测定，并可以用来限定本发明的各方面。在某些方面中，这些特征对于本文描述的AARS蛋白片段的生物治疗功用是优选的。某些实施方案包括组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段,该蛋白片段与表1-3或表 4-6或表7-9任一个中所列的氨基酸序列相差约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸的取代、缺失和 /
或添加，其中改变的蛋白片段基本上保持未改变蛋白的非规范活性或者具有与非规范活性相关的显性负表型，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。在具体实施方案中，组合物基本没有血清。其他实施方案包括组合物，包含与表1-3或表4-6或表7-9中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体对所述AARS蛋白片段的亲和力比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X。本发明的令人惊讶的一个方面包括具有抗体或其他定向生物制剂可及的“新”表面的某些切除蛋白，而全长AARS “隐藏”或用其他序列或相邻结构域覆盖这些表面。切除过程还能产生更大的水可及性，用于揭示之前未鉴定的生物性质。一些实施方案包括组合物，包含与表1-3或表4-6或表7-9所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体具有至少约IOnM的对所述AARS蛋白片段的亲和力，和至少约IOOnM的对相应全长AARS多肽的亲和力。在某些实施方案中，抗体结合位于表1-3或表4-6或表7_9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体拮抗AARS蛋白片段的非规范活性。此类拮抗剂可以任选地结合相应的亲本或全长AARS。其他方面涉及生物测定系统，包含至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和结合所述AARS蛋白片段的结合配体，所述蛋白片段包含表1_3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列。一方面，结合配体选自由以下组成的组:细胞表面受体蛋白、核酸、脂质膜、细胞调节蛋白、酶和转录因子。任选地，此类受体可以是细胞的部分，所述细胞优选是与所揭示的切除蛋白生物学相关的细胞。某些实施方案包括细胞组合物，包含:至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列；和工程化的细胞群，其中至少 一个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸。一方面，所述细胞能够在无血清培养基中生长。还包括检测系统，包含:至少50或100个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7_9中所列的氨基酸序列；包含与所述蛋白片段结合的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞；和调节所述AARS蛋白片段和细胞外受体的结合或相互作用的小于约2000道尔顿的分子或第二多肽。特定实施方案包括诊断系统，包含:至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7_9中所列的氨基酸序列；和包含与所述AARS蛋白片段结合的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞，其中所述系统或细胞包含指示分子，所述指示分子允许检测所述细胞表面受体或其细胞外部分的水平或活性的变化。某些实施方案包括细胞生长装置，包含:至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列；工程化的细胞群，其中至少一个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸；至少约10升的无血清生长培养基；和无菌容器。在具体实施方案中，英语本文描述的方法或组合物的任何一种的细胞能够在无血清培养基中生长，所述培养基任选含有抗生素和诱导物。一些实施方案涉及反义或RNA干扰(RNAi)剂，包含靶向对抗表1_3或表4_6或表7-9中所列的AARS剪接变体的独特剪接点的序列。还包括治疗组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段特异性结合结合配体并且具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度。在一些方面，所述组合物可以具有小于IOEU内毒素/mg蛋白。还包括组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，该蛋白片段与表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。在这些实施方案的任何一个中，组合物可以包含就其表观分子量而言是至少约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约95%单分散的AARS蛋白片段。在这些实施方案的任何一个的另一方面，组合物包含小于约10% (以蛋白基计)高分子量聚集蛋白，或小于约5%高分子量聚集蛋白，或小于约4%高分子量聚集蛋白，或小于约3%高分子量聚集蛋白，或小于2%高分子量聚集蛋白，或小于约1%高分子量聚集蛋白。在这些实施方案的任何一个的另一方面，组合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于10%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于5%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少lOmg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少lOmg/mL的浓度保存I周时表现出小于2%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于1%的聚集。某些实施方案包括组合物，包含至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和 至少一个与之共价或非共价连接的部分，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述部分时可检测的标记物。在某些实施方案中，所述部分是水溶性聚合物。在某些实施方案中，所述部分是PEG。在这些实施方案的任何一个的一个方面，所述部分与所述蛋白片段的N端连接。在这些实施方案的任何一个的一个方面，所述部分与所述蛋白片段的C端连接。具体实施方案包括组合物，包含与至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段或其生物活性片段或变体连接的固体基底，所述蛋白片段包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度。还包括组合物，包含与表1-3或表4-6或表7-9中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特异性结合的结合剂，其中所述结合剂具有至少约InM的对所述蛋白片段的亲和力。一方面，所述结合剂结合位于表1-3或表4-6或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合剂拮抗AARS多肽的非规范活性。某些实施方案包括分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含本文所述的AARS蛋白片段的氨基酸序列、由本文所述的AARS多核苷酸编码的氨基酸序列、或其变体或片段。某些AARS多肽包含与表1-3或表4-6或表7-9或表E2中公开的AARS参照序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的氨基酸序列。某些AARS多肽基本上由与表1_3或表4-6或表7-9或表E2中公开的AARS参照序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，所述多肽包含非规范生物活性。在具体实施方案中，非规范生物活性选自:细胞信号传导(例如细胞外信号传导)的调节、细胞增殖的调节、细胞迁移的调节、细胞分化的调节、凋亡或细胞死亡的调节、血管生成的调节、细胞结合的调节、细胞代谢的调节、细胞摄取的调节、基因转录的调节、或分泌的调节、细胞因子生成或活性的调节、细胞因子受体活性的调节、和炎症的调节。其他方面包括抗体和其他结合剂，其表现出本文描述的分离的AARS多肽、所述AARS多肽的结合配体或两者复合物的结合特异性。在某些实施方案中，抗体或结合剂对AARS多肽的亲和力比其对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X。在具体实施方案中，结合剂选自肽、肽模拟物、adnectin、适体和小分子。在某些实施方案中,抗体或结合剂拮抗AARS多肽的非规范活性。在其他实施方案中，抗体或结合剂激动AARS多肽的非规范活性。某些实施方案包括分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含本文所述的AARS多核苷酸的核苷酸序列、编码本文描述的AARS蛋白片段的核苷酸序列、或其变体、片段或互补物。某些AARS多核苷酸包含与表1-3或表4-6或表7-9或表E2中公开的AARS参照多核苷酸至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的核苷酸序列或其互补物。在某些实施方案中，核苷酸序列是为细菌表达而密码子优化的。一方面，核苷酸序列与表E2中公开的多核苷酸序列至少80%同一。具体的AARS多核苷酸由与表1-3或表4_6或表7-9或表E2中公开的AARS参照多核苷酸至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的核苷酸序列或其互补物组成。其他AARS多核苷酸包含与表1-3或表4-6或表7-9或表E2中公开的AARS参照多核苷酸特异性杂交的核苷酸序列，或者基本由与表1-3或表4-6或表7-9或表E2中公开的AARS参照多核苷酸特异性杂交的核苷酸序列组成。在某些实施方案中，多核苷酸选自引物、探针和反义寡核苷酸。在具体实施方案中 ，引物、探针或反义寡核苷酸靶向AARS多核苷酸内的特异性或独特的剪接点、和/或该剪接位点的3'序列。某些实施方案包括测定样品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性结合本文描述的AARS蛋白片段的一种或多种结合剂接触，检测所述结合剂的存在或不存在，并从而测定所述AARS蛋白片段的存在或水平。其他实施方案包括测定样品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括用能够特异性鉴定本文描述的蛋白片段的检测器分析所述样品，并从而测定所述AARS蛋白片段的存在或水平。在具体实施方案中，所述检测器是质谱仪(MS)、流式细胞仪、蛋白成像设备、酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白微阵列。某些实施方案包括将AARS蛋白片段的存在或水平与对照样品或预定值相比较。某些实施方案包括表征样品的状态以使之与所述对照相区分。在具体实施方案中，样品和对照包含细胞或组织，并且所述方法包括区分不同物种的细胞或组织、不同组织或器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞、不同生理状态的细胞、或健康细胞与患病细胞。例如，选择的切除蛋白可以在诸如应激或刺激条件下更丰
邑o某些实施方案包括用于鉴定特异性结合本文描述的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽或其细胞结合配体的一种或多种的化合物的发现方法和相关组合物，所述方法包括a)使所述AARS多肽或其细胞结合配体或两者与至少一种测试化合物在适合条件下混合，并b)检测所述AARS多肽或其细胞结合配体或两者与所述测试化合物的结合，从而鉴定特异性结合所述AARS多肽或其细胞结合配体或两者的化合物。在某些实施方案中，测试化合物是多肽或肽、抗体或其抗原结合片段、肽模拟物或小分子。在某些实施方案中，测试化合物激动所述AARS多肽或其细胞结合配体的非规范生物活性。在其他实施方案中，测试化合物拮抗所述AARS多肽或其细胞结合配体的非规范生物活性。某些实施方案包括通过上述方法鉴定的化合物，例如激动剂(例如，小分子、肽)。某些实施方案包括测定样品中AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性杂交本文所述的AARS多核苷酸的一种或多种寡核苷酸接触，检测所述样品中所述寡核苷酸的存在或不存在，并从而测定所述AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平。其他实施方案包括测定样品中AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性扩增本文所述的AARS多核苷酸的至少两种寡核苷酸接触，进行扩增反应，检测扩增产物的存在或不存在，并从而测定所述AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平。在具体实施方案中，所述寡核苷酸特异性杂交或特异性扩增所述AARS剪接变体独特的剪接点。某些实施方案包括将所述AARS蛋白片段或剪接变体的存在或水平与对照样品或预定值相比较。某些实施方案包括表征所述样品的状态以使之与所述对照相区分。在具体实施方案中，所述样品和对照包含细胞或组织，并且所述方法包括区分不同物种的细胞或组织、不同组织或器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞、或健康细胞与患病细胞。一些实施方案包括药物组合物，包含本文所述的AARS多核苷酸、本文所述的AARS多肽、本文所述的结合剂或通过上述方法鉴定的或本文描述的化合物，和药学上可接受的赋形剂或载体。某些实施方案包括调节细胞的细胞活性的方法,所述方法包括使所述细胞与本文描述的AARS多核苷酸、本文描述的AARS多肽、本文描述的结合剂、上述方法或本文描述的化合物或本文描述的药物组合物接触。在具体实施方案中，所述细胞活性选自细胞增殖、细胞迁移、细胞分化、凋亡或细胞死亡、细胞信号传导、血管生成、细胞结合、细胞摄取、细胞分泌、代谢、细胞因子生成或活性、细胞因子受体活性、基因转录和炎症。一方面，所述细胞选自由以下组成的组:前脂肪细胞、骨髓、嗜中性粒细胞、血细胞、肝细胞、星形细胞、充质干细胞和骨骼肌细胞。在某些实施方案中,所述细胞在受试者中。某些实施方案包括治疗受试者，其中所述受试者具有与肿瘤疾病相关的病症、免疫系统疾病或病症、感染性疾病、代谢疾病、炎性疾患、神经元/神经系统疾病、肌肉/心血管疾病、与异常血细胞生成相关的疾病、与异常血管生成相关的疾病或与异常细胞存活相关的疾病。还包括制备药物化合物的方法，包括:a)在包含表1-3或表4-6或表7-9中所列的氨基酸序列的至少40个氨基酸的AARS蛋白片段存在下进行一种或多种候选化合物的体外筛选，以鉴定特异性结合所述AARS蛋白片段的化合物；b)使用步骤a)中鉴定的化合物进行基于细胞的或生化或受体测定，以鉴定调节所述AARS蛋白片段的一种或多种非规范活性的化合物；c)任选地评估在步骤b)中鉴定的化合物的结构-活性关系(SAR)，以使其结构与所述非规范活性的调节相关联，并任选地衍生化所述化合物以改变其调节所述非规范活性的能力；和(1)产生对于人类使用而言足量的在步骤b)中鉴定的化合物或在步骤C)中衍生的化合物，从而制备所述药物化合物。其他实施方案包括制备药物化合物的方法，包括:a)在特异性结合表1-3或表4-6或表7-9的AARS蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分存在下进行一种或多种候选化合物的体外筛选，以鉴定特异性结合所述细胞表面受体或其细胞外部分的化合物山)使用步骤a)中鉴定的化合物进行基于细胞的或生化或受体测定，以鉴定调节所述AARS蛋白片段的一种或多种非规范活性的化合物；c)任选地评估在步骤b)中鉴定的化合物的结构-活性关系(SAR)，以使其结构与所述非规范活性的调节相关联，并任选地衍生化所述化合物以改变其调节所述非规范活性的能力；和d)产生对于人类使用而言足量的在步骤b)中鉴定的化合物或在步骤c)中衍生的化合物，从而制备所述药物化合物。一些实施方案包括细胞组合物，包含工程化的细胞群，其中至少一个细胞包含编码异源全长半胱氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白的多核苷酸，其中所述细胞能够在无血清培养基中生长。一方面，所述全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含异源纯化标签或表位标签以利于AARS蛋白片段的纯化。另一方面，所述全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含异源蛋白水解位点以使AARS蛋白片段能够在裂解时生成。一些实施方案包括在细胞内原位生成表1-3或表4-6或表7-9或表E2所列的AARS多肽的方法，所述方法包括:i)在所述细胞内表达异源全长半胱氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，其中所述细胞包含能够裂解所述异源全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白以生成所述AARS多肽的蛋白酶。 一些实施方案包括生成表1-3或表4-6或表7-9或表E2所列的AARS多肽的方法，所述方法包括使分离的全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白与能够裂解所述异源全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白并产生AARS多肽的蛋白酶接触。一些实施方案包括工程化的全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，包含能够实现表1-3或表4-6或表7-9或表E2任一个中所列的AARS蛋白片段的蛋白水解生成的异源蛋白水解位点。一些实施方案包括组合物，包含分离的全长氨酰-tRNA合成酶蛋白，其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清。一方面，所述全长氨酰-tRNA合成酶蛋白以至少10mg/mL的浓度存在,并且是至少90%单分散的。另些实施方案包括减轻或改善由甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的突变、或不合适的子细胞缔合、或过度表达、或子细胞分布介导的疾病的至少一种症状的方法，包括向受试者施用基本上由表1-3、或表4-6、或表7-9、或表E2任一个中所列的氨基酸序列构成的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段。在一些实施方案中，AARS蛋白片段具有至少40个氨基酸。在一些实施方案中，AARS蛋白片段具有非规范活性。在一些实施方案中，AARS蛋白片段融合异源融合配体。在不同实施方案中，所述疾病是腓骨肌萎缩症2D型(CMT2D)或远端型脊肌萎缩症5型(dSMA-V)。在特定实施方案中，所述疾病是CMT2D，并且所述至少一种症状是降低的神经传导速度。在某些实施方案中，所述受试者已经确定具有选自E71G，L129P，P234KY，G240R, I280F, H418R, D500N, G526R, S581L 和 G598A 的甘氨酰 tRNA 合成酶中的至少一种突变。在一些实施方案中，所述疾病是dSMA-V。在某些实施方案中，至少一种症状是肌肉无力。在这些和相关实施方案中，所述受试者已经确定具有选自E71G，L129P，G240R和G526R的甘氨酰tRNA合成酶中的至少一种突变。如上所述，还包括融合蛋白，包含表1-3、或表4-6、或表7-9、或表E2任一个中所列的AARS蛋白片段以及异源融合配体。在某些实施方案中，AARS融合蛋白基本上保留所述AARS蛋白片段的非规范活性。在一些实施方案中，AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非规范活性。在特定实施方案中，异源多肽连接所述AARS蛋白片段的N-端。在一些实施方案中，异源多肽连接所述AARS蛋白片段的C-端。在特定实施方案中，异源多肽选自由以下组成的组:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜转位序列和PK调节剂。还包括减轻或改善由甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的突变、或不合适的子细胞缔合、或过度表达、或子细 胞分布介导的疾病症状的方法，包括向受试者施用特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9、或表E2任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体或结合剂，其中所述抗体对所述AARS蛋白片段的亲和力比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X。在特定实施方案中，所述抗体或结合剂拮抗所述AARS多肽的非规范活性。发明详述目录1.概述16I1.定义17II1.纯化的AARS蛋白片段和变体30IV.AARS 多核苷酸100V.抗体113V1.抗体替代物和其他结合剂118VI1.生物测定和分析测定122VII1.表达和纯化系统125IX.诊断方法和组合物138X.反义剂和RNAi剂154A.反义剂155B.RNA 干扰剂163X1.药物发现171XI1.使用方法180XII1.药物制剂、施用和药盒187XIV.实施例1961.概述本发明至少部分涉及新的AARS多肽的发现，及其制备和使用方法，这代表天然野生型蛋白转化成与天然存在的全长甘氨酰tRNA合成酶基因相比表现出明显不同特性的新形式。此类AARS多肽的鉴定是基于广泛序列和在不同组织中表达的甘氨酰tRNA合成酶的质谱分析，随后系统生成并测试每个潜在AARS多肽以鉴定代表稳定且可溶的蛋白结构域的蛋白序列，其表现出新的生物活性和有利的治疗药物特性。基于该分析，已经鉴定了源自半胱氨酰tRNA合成酶的AARS多肽的至少六个新家族。一方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸55-450的多肽序列。第二方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸55-189的多肽序列。第三方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸91-561的多肽序列。第四方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸612至739的多肽序列。第五方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸57至121的多肽序列。第六方面，此类甘氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含甘氨酰tRNA合成酶的大约氨基酸316至739的多肽序列。这些新的AARS多肽家族代表了新的之前未知的蛋白产物，尤其表现出i)新的生物活性，ii)有利的蛋白稳定性和聚集特性，和iii)在原核表达系统中以高水平表达和生成的能力，这些是未在完整的野生型蛋白中发现的显著不同的特性。I1.定义除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。尽管在实施或检验本发明时可以使用与本文所述的相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。本文使用冠词“a (—个)”和“an (—个)”指一个或多于一个(即，指至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。“约”表示与参照的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度相比，改变多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的量、水平、值、数、频率、百分比、尺
度、尺寸、数额、重量或长度。“激动剂”是指增强或模拟活性的分子。例如，AARS或另一蛋白的非规范生物活性。激动剂可以包括蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或组合物，这些激动剂通过与AARS或其结合配体直接相互作用或通过对AARS参与的生物途径中的成分起作用来调节AARS的活性。包括部分激动剂和完全激动剂。 如本文所用的 ，术语“氨基酸”意图表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、P-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，其是本领域技术人员已知的。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这种修饰可以包括例如取代或替代氨基酸上的化学基团和部分，或者通过氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如表现出功能上类似性质的有机结构，所述性质例如参照氨基酸的电荷和电荷空间特性。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构具有位于类似分子空间并且具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同程度的移动性的正电荷部分。模拟物还包括约束结构以维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳空间和电荷相互作用。本领域技术人员知道或者可以确定什么结构构成功能上等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。在某些方面，非天然氨基酸的使用可用于修饰(例如增加)AARS蛋白片段的选定的非规范活性，或者改变蛋白的体内或体外半衰期。可以使用非天然氨基酸来促进AARS蛋白的(选择性)化学修饰(例如，聚乙二醇化)。例如，某些非天然氨基酸允许聚合物例如PEG与给定蛋白连接，从而改善其药代动力学性质。氨基酸类似物和模拟物的具体实例可以参见例如Roberts和Vellaccio, The Piptides: Analysis, Synthesis, Biology,编辑 Gross 和 Meinhofer,第 5 卷，p.341, AcademicPress, Inc., New York, N.Y.(1983),其全卷通过引用并入本文。其他实例包括全烧基化氨基酸，特别是全甲基化氨基酸。参见例如Combinatorial Chemistry,编辑 Wilson 和 Czarnik, Ch.11，p.235，John ffiley&Sons Inc., New York, N.Y.(1997),其全书通过引用并入本文。而其他实例包括其酰胺部分(和因此，得到的肽的酰胺骨架)已经被例如糖环、类固醇、苯并二氮杂环庚烷或碳环所替代的氨基酸。参见例如，Burger’ s Medicinal Chemistry and Drug Discovery,编辑 Manfred E.Wolff,Ch.15, pp.619-620, John ffiley&Sons Inc., New York, N.Y.(1995),其全书通过引用并入本文。用于合成肽、多肽、肽模拟物和蛋白的方法是本领域公知的(参见例如，美国专利号 5, 420, 109 ；M.Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (第 I 版 & 第 2 修订版)，Springer-Verlag, New York, N.Y.(1984&1993)，见第 7 章；Stewart 和 Young, SolidPhase Peptide Synthesis,(第 2 版)，Pierce Chemical C0., Rockford, 111.(1984),其各自通过引用并入本文)。因此，本发明的AARS多肽可以由天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物构成。术语“拮抗剂”指减小或减弱一种活性的分子。例如，AARS或另一蛋白的非规范活性生物活性。拮抗剂可以包括 诸如抗体的蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或组合物，这些拮抗剂通过与AARS或其结合配体直接相互作用或通过对AARS参与的生物途径中的组分起作用来调节AARS或其结合配体的活性。包括部分和完全拮抗剂。术语“氨酰-tRNA合成酶”(AARS) —般指以其天然或野生型形式能够催化特定氨基酸或其前体酯化成所有其相容的相关tRNA之一以形成氨酰-tRNA的酶。在这种“规范”活性中，氨酰-tRNA合成酶催化一个两步骤反应:首先，它们通过形成氨酰-腺苷酸而活化其各自的氨基酸，其中氨基酸的羧基通过替代焦磷酸而与ATP的a -磷酸连接，然后，当结合正确的tRNA时，氨酰-腺苷酸的氨酰基被转移至tRNA的2’或3’末端0H。I类氨酰-tRNA合成酶通常具有两个高度保守的序列基序。这些酶在腺苷核苷酸的2’ -OH处氨基酰化，并且通常是单体或二聚体。II类氨酰-tRNA合成酶通常具有三个高度保守的序列基序。这些酶在同一腺苷的3’ -OH处氨基酰化，并且通常是二聚体或四聚体。II类酶的活性位点主要由侧翼为a-螺旋的七链反平行￠-片层构成。尽管苯丙氨酸-tRNA合成酶是II类，但是它在2’ -OH处氨基酰化。AARS多肽包括酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(GlnRS)、甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)、组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)、丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)、苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)、丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、天冬酰胺酰-tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CysRS)、谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS)、脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)、精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)、亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)、赖氨酰-tRNA合成酶(LysRS)、苏氨酰-tRNA合成酶(ThrRS)、甲硫氨酰-tRNA合成酶(MetRS)或缬氨酰-tRNA合成酶(ValRS)的线粒体和胞质形式。这些AARS多肽的野生型或亲本序列是本领域已知的。“编码序列”表示负责编码基因的多肽产物的任何核酸序列。与之相反，术语“非编码序列”是指并非负责编码基因的多肽产物的任何核酸序列。整个说明书中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise) ”、“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”应理解为意指包括陈述的步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其他的步骤或元素或者步骤或元素的组。“由...组成”表示包括且限于跟随在短语“由...组成”后的任何内容。因此，短语“由...组成”表明所列出的元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其他元素。“基本上由...组成”表示包括列在该短语后所列的任何元素，并限于不妨碍或不促进在所列元素的公开内容中指明的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由...组成”表明所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是任选的，可以存在或可以不存在，这取决于它们是否实质影响所列元素的活性或作用。“不含内毒素”或“基本不含内毒素”的表述一般涉及含有至多痕量(例如，对受试者没有临床上不良的生理效应的量)内毒素并且优选不可检测的量的内毒素的组合物、溶剂和/或容器。内毒素是与某些细菌、通常是革兰氏阴性细菌有关的毒素，但是内毒素也可存在于革兰氏阳性细菌中，例如产单核细胞李斯特菌。最普遍的内毒素是存在于各种革兰氏阴性细菌外膜的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，并且其代表了这些细菌引起疾病的能力的主要致病特征。人类中的小量内毒素可以产生发热、血压降低和炎症和凝血的激活，以及其他不良的生理效应。因此，在AARS多肽的药物生产中，经常希望从药物产品和/或药物容器去除大部分或所有痕量的内毒素，因为即使小量也可能引起人类的不良反应。除热源的烘箱可用于该目的，因为超过300°C的温度通常是分解大多数内毒素所需要的。例如，基于主要的包装材料，例如注射器或管形瓶，250°C的玻璃温度与30分钟的维持时间的组合经常足以实现内毒素水平减少3个数量级。考虑去除内毒素的其他方法，包括例如色谱和过滤方法，如本文所述和本领域已知的。还包括在真核细胞例如哺乳动物细胞中产生AARS多肽并从中分离它们的方法，以减少(如果不是消除)本发明组合物中存在的内毒素的风险。在无血清细胞中产生AARS多肽并从 中分离它们的方法是优选的。这种包含AARS多肽的组合物代表了新制剂，表现出污染了血清或内毒素的AARS多肽组合物所没有的新颖的生物和治疗特性，血清或内毒素具有结合AARS多肽并改变AARS多肽的新颖生物性质的潜力。可以使用本领域的规范技术检测内毒素。例如,利用了鲎的血液的鲎变形细胞溶解物测定是用于测定内毒素存在的非常灵敏的测定，并且基于该测定检测内毒素的试剂、试剂盒和仪器可商业途径获自例如Lonza Group0在该测试中，非常低水平的LPS可以引起可检测的鲎溶解物的凝结，这归因于放大该反应的强大的酶促级联。还可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量内毒素。要成为基本上无内毒素的，内毒素水平可以小于约0.001、0.005、0.0U0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.08,0.09,0.U0.5、1.0U.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg蛋白。通常，Ing脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。在某些实施方案中，组合物中任何给定剂(例如，AARS蛋白片段)的“纯度”可以是具体限定的。例如，某些组合物可以包含至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%纯的剂，包括其间所有小数，例如但不限于通过高效液相色谱(HPLC)所测量的，高效液相色谱(HPLC)是生物化学和分析化学中用于分离、鉴定和定量化合物的常用公知形式的柱色谱。如本文所使用的，“功能”和“功能的”等术语是指生物学功能、酶血功能或治疗功倉泛。“基因”表示可以占据染色体上的特定基因座的遗传单元，并且由转录调节序列和/或翻译调节序列、和/或编码区、和/或非翻译序列(即，内含子、5'和3'非翻译序列)组成。“同源性”是指同一的或组成型保守取代的氨基酸的百分数。同源性可以利用诸如GAP (Deveraux 等人，1984，Nucleic acids Researchl2, 387-395)的序列比较程序来确定，其通过引用并入本文。通过这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文中所引用的序列相似或明显不同长度的序列，这种空位可以通过例如利用GAP的比较算法来确定。术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致(在形态学上或在总DNA互补物中)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。“分离的”表示基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的物质。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”包括已经从天然存在状态中位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如，从通常邻近DNA片段的序列中移出所述片段。可选地，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等包括从其天然的细胞环境中以及从与细胞的其他组分的结合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即，它明显不与体内物质结合。如本文所使用的，术语“mRNA”或有时称为“mRNA转录物”包括但不限于:前mRNA转录物、转录加工中间体、准备用于翻译的成熟mRNA以及一个或多个基因的转录物，或来源于mRNA转录物的核酸。转录物加工可以包括剪接、编辑和降解。如本文所使用的，来源于mRNA转录物的核酸是指所述mRNA转录物或其子序列被最终用作模板所合成的核酸。从mRNA逆转录的cDNA，从该cDNA转录的RNA，从该cDNA扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等都是来源于该mRNA的转录物，并且多这种来源的产物的检测能指示样品中原始转录物的存在和/或丰度。因此，mRNA来源的样品包括但不限于，一个或多个基因的mRNA转录物、从该mRNA逆转录的cDNA、从该cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA、从扩增的DNA转录的RNA 等。本文使用的“非规范的”活性通常是指i)本发明的AARS多肽所具有的新活性，而在任何显著程度上，完整的全长亲本蛋白不具有该活性，或ii)完整的天然全长亲本蛋白所具有的活性，其中AARS多肽与完整的天然全长亲本蛋白相比表现出显著更高(即，至少大20%)的比活性，或者表现出新环境中的活性；例如，与完整的天然全长亲本蛋白具有的其他活性相独立的活性。在AARS多肽的情况下，非规范活性的非限制性实例包括细胞外信号传导、RNA结合、氨基酸结合、细胞增殖的调节、细胞迁移的调节、细胞分化的调节(例如血细胞生成、神经发生、肌发生、骨发生和脂肪生成)、基因转录的调节、细胞凋亡或其它形式的细胞死亡的调节、细胞信号传导的调节、细胞摄取或分泌的调节、血管生成的调节、细胞结合的调节、细胞代谢的调节、细胞因子产生或活性的调节、细胞因子受体活性的调节、炎症的调节等。术语“半数有效浓度”或“EC5(I”指本文所述的AARS蛋白片段、抗体或其他剂在一段指定的暴露时间之后诱导介于基线和最大值中间的响应的浓度；因此，分级剂量响应曲线的EC5tl代表观察到其最大效应的50%时的化合物浓度。在某些实施方案中，本文提供的剂的EC5tl是与如上所述的“非规范”活性相关的。EC5tl还代表在体内获得最大效应的50%所需的血浆浓度。类似地，“EC9(I”指观察到其最大效应的90%时的剂或化合物的浓度。“EC9Q”可以从“EC5(I”和Hill斜率计算，或者可以使用本领域的规范知识从数据直接确定。在一些实施方案中，AARS蛋白片段、抗体或其他剂的EC5tl小于约0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4、0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100nM。优选地，生物治疗组合物将具有约InM或更小的EC5tl值。术语“调节”包括与对照相比，通常以统计学上显著或生理上显著的量“增加”或“刺激”，以及“减少”或“降低”。因此，根据使用条件，“调节剂”可以是激动剂、拮抗剂或其任何混合物。“增加的”或“提高的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括没有组合物(缺乏试剂或化合物)或有对照组合物时所产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更大倍数(例如，500、1000倍)(包括其间大于I的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“减少的”或降低的量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括没有组合物(缺乏试剂或化合物)或有对照组合物时所产生的量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的降低，包括其间所有整数。作为一个非限制性实例，比较规范和非规范活性时的对照可能包括与其相应的全长AARS相比感兴趣的AARS蛋白片段，或者具有与其相应的全长AARS相当的规范活性的片段AARS。“统计学上显著的”量的其他实例在下文描述。“获自”表示诸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的样品分离自或源自受试者的特定来源。例如，提取物可以获自从受试者直接分离的组织或生物流体。“源自”或“获自”还可以指多肽或多核苷酸序列的来源。例如，本发明的AARS序列可以“源自”AARS蛋白水解片段或AARS剪接变体或其部分的序列信息，不管它们是天然存在的还是人工产生的，并因此可以包括该序列，基本上由该序列组成，或者由该序列组成。术语“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨 基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物。此类衍生物包括例如翻译后修饰和降解产物，包括AARS参照片段的焦谷氨酰、异天冬氨酰、蛋白水解的、磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。本文所用的表述“序列同一性”或者例如包含“与...50%同一的序列”指序列在比较窗内在逐个核苷酸基础或逐个氨基酸基础上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算:在比较窗中比较两个最优比对的序列，确定两条序列中出现的相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp> Lys> Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys 和 Met)的位置数量以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽间的序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参照序列”的长度为至少12个，但通常是15至18个，经常是至少25个单体单元(包括核苷酸和氨基酸残基)。因为两个多核苷酸各自可以包含(I)在两个多核苷酸间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)和(2)在两个多核苷酸间不同的序列，两个(或更多个)多核苷酸间的序列比较通常通过比较“比较窗”中的两个多核苷酸的序列来进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗”指至少6个连续位置、通常为约50至约100个、更通常约100至150个的连续位置的概念节段，其中在一序列与具有相同连续位置数的参照序列最优比对后，将该序列与参照序列比较。比较窗可以包含与参照序列(其不包含添加或缺失)相比约20%或更少的添加或缺失(即空位)用于两个序列的最优比对。用于比对比较窗的序列的最优比对可以通过算法的计算机运行(Wisconsin遗传学软件包发行版7.0 (GeneticsSoftware Package Release7.0)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics ComputerGroup, 575Science Drive Madison, WI, USA)或通过目视检查以及选择的各种方法的任一种产生的最佳比对(即，产生整个比较窗的最高同源性百分比)来实施。例如Altschul等人，1997，Nucl.Acids Res.25:3389公开的BLAST程序家族也可以作为参考。可以在 Ausubel 等人,“Current Protocols in Molecular Biology,，，John ffiley&SonsInc, 1994-1998，第15章的19.3单元中找到序列分析的详细讨论。两序列间的 序列相似性或序列同一性(术语在本文可互换使用)的计算如下实施。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最优比较的目的，将序列比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两者中引入空位以用于最优比对，出于比较目的，可以不管非同源性序列)。在某些实施方案中，出于比较目的比对的参照序列的长度是参照序列的长度的至少30%，优选至少40%，更优选至少50%、60%和甚至更优选至少70%、80%、90%、100%。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列的一个位置被与在第二序列的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是同一的。两序列间的同一性百分比是被所述序列共享的相同位置数的函数，将空位数和每一空位的长度考虑在内，其需要被引入用于两序列的最优比对。两序列间的序列比较和同一性百分比的确定可以利用数学算法来实现。在一个优选的实施方案中，两氨基酸序列间的同一性百分比利用已并入GCG软件包(可以在http://www.gcg.com 得到)的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch 算法(1970, J.Mo1.Biol.48:444-453)来确定，利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一优选的实施方案中，两核苷酸序列间的同一性百分比利用GCG软件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序来确定,利用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选组的参数(除非特别指明，应该利用的一组)是BloSSum62得分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，以及移码空位罚分为5。两氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可以利用E.Meyers和ff.Miller (1989, Cabios,4:11-17)的算法来确定，该算法并入ALIGN程序(2.0版)中，利用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。本文描述的核酸和蛋白序列可以用作“查询序列”以进行对公开数据库的检索，例如，以鉴定其他家族成员或相关序列。可以利用Altschul，等人，(1990，J.Mol.Biol, 215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行这类检索。可以利用NBLAST程序，得分=100，字长=12来进行BLAST核苷酸检索以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以利用XBLAST程序，得分=50，字长=3来进行BLAST蛋白检索以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位的比对，可以利用Altschul 等人，(1997，Nucleic acids Res, 25:3389-3402)中描述的带空位的 BLAST。当利用BLAST和带空位的BLAST程序时，可以利用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)中的缺省参数。术语“溶解度”指本文提供的剂在液体溶剂中溶解并形成均质溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，借助每单位体积溶剂的溶质质量(g溶质/kg溶剂、g/dL (IOOmL) >mg/ml等)、摩尔浓度、重量克分子浓度、摩尔分数或其他类似的浓度描述。在指定条件下，单位量的溶剂可以溶解的溶质的最大平衡量是该溶质在该溶剂中的溶解度，所述指定条件包括温度、压力、pH和溶剂性质。在某些实施方案中，在生理pH下测量溶解度。在某些实施方案中，在水或生理缓冲液例如PBS中 测量溶解度。在某些实施方案中，在诸如血液或血清的生物液体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施方案中，温度可以是约室温(例如，约20、21、22、23、24、25°C )或约体温(37°C )。在某些实施方案中，诸如AARS蛋白片段的剂在室温或37°C 下具有至少约 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25 或 30mg/ml 的溶解度。本文所使用的“剪接点”包括成熟mRNA转录物或所编码的多肽中第一个外显子的3’端与第二个外显子的5’端连接的区域。该区域的大小可以变化，并在一个外显子的3’端与另一个外显子的5’端连接处的确切残基的任一端可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或
更多个(包括其间所有整数)核苷酸或氨基酸残基。“外显子”指已经通过顺式剪接移除前体RNA的一部分(内含子)或已经通过反式剪接将两个或更多个前体RNA分子连接在一起后，在成熟形式的RNA分子中呈现的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或诸如rRNA或tRNA的非编码RNA的功能形式。取决于上下文，外显子可以指DNA或其RNA转录物中的序列。“内含子”指基因中不翻译成蛋白的非编码核酸区域。非编码的内含子节段被转录到前体mRNA (前mRNA)和某些其他RNA (例如长的非编码RNA)中，并随后在加工为成熟RNA的过程中通过剪接去除。“剪接变体”指通过选择性剪接产生的成熟mRNA或其编码的蛋白，所述选择性剪接是指在RNA剪接期间，RNA(初级基因转录物或前mRNA)的外显子以多种途径重新连接的过程。所得的不同mRNA可以翻译成不同的蛋白异构体，从而允许单一基因编码多种蛋白。本文所用的“受试者”包括呈现能够用本发明的AARS多核苷酸或多肽治疗或诊断的症状或处于呈现该症状风险中的任何动物。还包括为诊断或其他目的需要描绘本发明AARS多肽和/或多核苷酸水平的受试者。合适的受试者(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物、和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类动物和优选人类患者。如本文所用的治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”包括对能够被本文所述的AARS多核苷酸或多肽的非规范活性影响的疾病或病症的症状或病理产生的任何期望的效应，并且可以包括被治疗的疾病或病症的一个或多个可测量的标志物的甚至极小的变化或改善。还包括与非AARS疗法相关的治疗,其中本文所述的AARS序列提供治疗的临床标志物。“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”并不必然表示疾病或病症或其相关症状的彻底根除或治愈。接受该治疗的受试者是有相应需要的任何受试者。临床改善的示例性标志物对本领域技术人员是明显的。除非文中有明确相反指示，本发明的实施可利用本技术领域内的规范分子生物学方法和重组DNA技术，为了说明的目的，其中很多方法和技术在下文进行了描述。这些技术在文献中有充分的讲解。参见，例如Sambrook,等人，Molecular Cloning:ALaboratoryManual (第 3 版，2000) ；DNACloning:APractical Approach,第 I&II 卷(D.Glover 编辑)；Oligonucleotide Synthesis (N.Gait 编辑，1984) ；01igonucleotide Synthesis:Methodsand Applications(P.Herdewijn 编辑,2004) ；NucleicacidHybridzation(B.Hames &S.Higgins 编辑,1985) ；Nucleic acid Hybridization:Modern Applications(Buzdinand Lukyanov 编辑,2009) !Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins编辑，1984) ；Animal Cell Culture (R.Freshney, ed., 1986) ；Freshney, R.1.(2005)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第 5 版.HobokenNJ,John Wiley & Sons ；B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(第 3版 2010) ；Farrell, R ., RNA Methodologies:ALaboratory Guide for Isolation andCharacterization (第 3 版 2005)，Methods of Enzymology:DNA Structure PartA:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, AcademicPress ；Using Antibodies: A Laboratory Manual:PortabIe Protocol N0.1,Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, ISBN0-87969-544-7) ；Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow (编辑)，DavidLane (编辑)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN0-87969-3, 4-2), 1855.Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B.Fernandes编辑(2001，New York, N.Y.,Marcel Dekker, ISBN0-8247-0562-9)；和 Lab Ref:A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at theBench,编辑 Jane Roskams 和 Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3)。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。II1.用于治疗剂和其他应用的纯化的AARS蛋白片段和变体
令人惊讶地，不同于仅知道其氨酰化活性的其全长亲本序列，已经发现AARS片段具有对于生物治疗、发现和诊断应用重要的生物活性。因此，本发明的实施方案包括氨酰-tRNA合成酶(AARS)的全长蛋白、成熟蛋白同种型和蛋白片段及其生物活性变体和片段。在某些实施方案中，蛋白和片段可以通过内源性蛋白水解、体外蛋白水解、剪接变化或计算机模拟预测以及其他机制产生。本文描述的AARS蛋白片段及其变体可以具有至少一种“非规范”生物活性。本发明的AARS蛋白片段在本文还称为“AARS多肽”或“AARS参照多肽”。在某些实施方案中，本文提供的AARS多肽包括以下或主要由以下组成:以下表1-3或表4-6或表7-9列出的AARS多肽“ 参照序列”的全部或一部分，其代表各种甘氨酰tRNA合成酶片段的氨基酸序列。小鼠和人AARS蛋白序列是高度相关的，通常在完整序列、特定结构域或特定蛋白片段内相差不超过几个氨基酸。N 端 AARS 多狀:(表 1、2&3)
权利要求
1.一种组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.20、SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
3.权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含非规范生物活性。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述非规范生物活性选自:细胞外信号传导的调节、嗜中性粒细胞活化的调节、细胞粘附或趋化的调节、转录的调节、细胞因子生成或活性的调节、炎症的调节、和细胞因子受体活性的调节。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述非规范生物活性是基因转录的调节。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段与异源多肽融合。
7.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非规范活性。
8.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非规范活性。
9.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的N端连接。`
10.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的C端连接。
11.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽选自:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜易位序列、和PK调节物。
12.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度为最少约10mg/mL的AARS蛋白片段。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%单分散的。
14.权利要求12或13所述的组合物，其中所述组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。
15.权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。
16.一种组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段与表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11个氨基酸的置换、缺失和/或添加，其中改变的蛋白片段基本上保持未改变的蛋白的非规范活性，其中所述蛋白片段具有至少约10mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清污染。
17.—种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体，其中所述抗体对所述AARS蛋白片段的亲和力比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X，并且其中所述抗体拮抗所述AARS蛋白片段的非规范活性。
18.—种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体，其中所述抗体具有至少约IOnM的对所述AARS蛋白片段的亲和力，和至少约IOOnM的对相应全长AARS多肽的亲和力。
19.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其中所述抗体结合位于表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。
20.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其中所述抗体结合包含选自以下的至少 5 个连续氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.27,SEQ.1D.N0.29,SEQ.1D.N0.3USEQ.1D.N0.84、和SEQ.1D.N0.87。
21.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其拮抗所述AARS多肽的非规范活性。
22.—种生物测定系统，包含至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和结合所述AARS蛋白片段的结合配偶体，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列。
23.权利要求22所述的生物测定系统，其中所述结合配偶体选自:细胞表面受体蛋白、核酸、脂质膜、细胞调节蛋白、酶和转录因子。
24.权利要求22所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.20、SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
25.—种细胞组合物，包含:至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；和工程化的细胞群，其中至少一个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸，其中所述细胞能够在无血清培养基中生长。
26.—种检测系统，包含:至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；包含结合所述蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞；和调节所述AARS蛋白片段和细胞外受体的结合或相互作用的小于约2000道尔顿的分子或第二多肽。
27.—种诊断系统，包含:至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；和包含特异性结合所述AARS蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞，其中所述细胞包含指示分子，所述指示分子允许检测所述细胞表面受体或其细胞外部分的水平或活性的变化。
28.—种细胞生长装置，包含:至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；工程化的细胞群，其中至少一个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸；至少约10升的无血清生长培养基；和无菌容器。
29.一种反义或RNA干扰(RNAi)剂，包含靶向对抗表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中所列的AARS剪接变体的独特剪接点的序列。
30.一种治疗组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段特异性结合结合配偶体以发挥生理效应并且具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。
31.权利要求29所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少 90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12,SEQ.1D.N0.20,SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
32.权利要求29或30所述的治疗组合物，其中所述结合配偶体选自:细胞表面受体、核酸、脂质膜、调节蛋白、酶和转录因子。
33.权利要求29或30所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段与异源多肽融合。
34.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非规范活性。
35.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非规范活性。
36.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的N端连接。
37.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的C端连`接。
38.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽选自:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜易位序列、和PK调节物。
39.权利要求29-30中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物包含浓度为最少约10mg/mL的AARS蛋白片段。
40.权利要求29-30中任一项所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%单分散的。
41.权利要求39所述的治疗组合物，其中所述组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。
42.权利要求39所述的治疗组合物，其中所述组合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。
43.一种组合物，包含至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段与表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。
44.一种组合物，包含至少40个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和至少一个与之共价或非共价连接的部分，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列。
45.权利要求42所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.20、SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
46.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分是可检测的标记物。
47.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分是水溶性聚合物。
48.权利要求42或43所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
49.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分与所述蛋白片段的N端连接。
50.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分与所述蛋白片段的C端连接。
51.—种组合物，包含与至少40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段连接的固体基底，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度。
52.—种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的结合剂，其中所述结合剂具有至少约InM的对所述蛋白片段的亲和力。
53.权利要求52所述的组合物，其中所述结合剂结合位于表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内 的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。
54.权利要求52所述的组合物，其中所述结合剂结合包含选自以下的至少5个连续氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.27、SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.31、SEQ.1D.N0.84、和 SEQ.1D.N0.87。
55.权利要求52所述的组合物，其拮抗所述AARS多肽的非规范活性。
56.一种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中所列的AARS蛋白片段的氨基酸序列。
57.权利要求56所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽包含选自以下的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12, SEQ.1D.N0.20,SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39,SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
58.一种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含与表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列。
59.权利要求58所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽选自:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.20、SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
60.一种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，基本上由与表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列组成。
61.权利要求60所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽选自:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.20、SEQ.1D.N0.24、SEQ.1D.N0.39、SEQ.1D.N0.41、SEQ.1D.N0.43、SEQ.1D.N0.45、SEQ.1D.N0.77、SEQ.1D.N0.106、SEQ.1D.N0.79、SEQ.1D.N0.135、SEQ.1D.N0.137 和 SEQ.1D.N0.151。
62.权利要求61所述的多肽，其中所述多肽包含非规范生物活性。
63.权利要求62所述的多肽，其中所述非规范生物活性选自:细胞外信号传导的调节、嗜中性粒细胞活化的调节、细胞粘附或趋化的调节、转录的调节、细胞因子生成或活性的调节、炎症的调节、和细胞因子受体活性的调节。
64.权利要求63所述的多肽，其中所述非规范生物活性是转录的调节。
65.权利要求62所述的多肽，其中所述AARS蛋白片段与异源多肽融合。
66.权利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非规范活性。
67.权利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非规范活性。
68.权利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的N端连接。
69.权利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的C端连接。
70.权利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽选自:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜易位序列、和PK调节物。
71.权利要求62所述的组合物，其中所述组合物包含浓度为最少约10mg/mL的AARS蛋白片段。
72.权利要求62所述的组合物`，其中所述组合物包含至少90%单分散的AARS蛋白片段。
73.权利要求62所述的组合物，其中所述组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。
74.权利要求62所述的治疗组合物，其中所述组合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。
75.一种抗体，其表现出对权利要求60所述的分离的AARS多肽、所述AARS多肽的结合配偶体、或两者的结合特异性，其中所述抗体对所述AARS多肽的亲和力比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X。
76.权利要求75所述的抗体，其中所述抗体结合位于表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。
77.权利要求75或76中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合包含选自以下的至少5 个连续氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.27、SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.31、SEQ.1D.N0.84、和SEQ.1D.N0.87。
78.一种抗体，其与权利要求75至77中任一项所述的抗体竞争结合分离的AARS多肽。
79.—种结合剂，其表现出对权利要求62所述的分离的AARS多肽或所述AARS多肽的结合配偶体的结合特异性。
80.权利要求79所述的结合剂,选自肽、可溶性受体、adnectin、小分子、和适配体。
81.权利要求75-80中任一项所述的抗体或结合剂，其拮抗所述AARS多肽的非规范活性。
82.权利要求75-80中任一项所述的抗体或结合剂，其激动所述AARS多肽的非规范活性。
83.一种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含编码表1_3、或表4_6、或表7-9任一个中所列的AARS蛋白片段的核苷酸序列，其具有至少80%序列同一性的变体，其片段，或互补物。
84.权利要求83所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与选自以下的序列至少80%同一:SEQ.1D.N0.13、SEQ.1D.N0.21、SEQ.1D.N0.25、SEQ.1D.N0.40、SEQ.1D.N0.42、SEQ.1D.N0.44、SEQ.1D.N0.46、SEQ.1D.N0.78、SEQ.1D.N0.107、SEQ.1D.N0.80、SEQ.1D.N0.136、SEQ.1D.N0.138 和 SEQ.1D.N0.152。
85.权利要求83所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是为细菌表达而密码子优化的。
86.权利要求85所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与选自以下的序列至少80%同一:SEQ.1D.N0.38、SEQ.1D.N0.182、SEQ.1D.N0.183、SEQ.1D.N0.128、SEQ.1D.N0.129、SEQ.1D.N0.130、SEQ.1D.N0.131、SEQ.1D.N0.133、SEQ.1D.N0.132、SEQ.1D.N0.134、SEQ.1D.N0.175、SEQ.1D.N0.176 和 SEQ.1D.N0.177。
87.权利要求83所述的多核苷酸，包含与之至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的核苷酸序列，或其互补物。
88.权利要求83所述的多核苷酸，基本上由与之至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的核苷酸序列或其互补物组成。
89.—种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含与权利要求83所述的多核苷酸特异性杂交的核苷酸序列。
90.权利要求89所述的多核苷酸，选自引物、探针、和反义寡核苷酸。
91.权利要求90所述的多核苷酸，其与所述AARS多核苷酸的独特剪接点特异性杂交。
92.一种测定样品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS蛋白片段的一种或多种结合剂接触，检测所述结合剂的存在或不存在，并从而测定所述AARS蛋白片段的存在或水平。
93.一种测定样品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括用能够特异性鉴定表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的蛋白片段的检测器分析所述样品，并从而测定所述AARS蛋白片段的存在或水平。
94.权利要求93所述的方法，其中所述检测器是质谱仪(MS)、流式细胞仪、蛋白成像设备、酶联免疫吸附测定(ELISA)、或蛋白微阵列。
95.一种测定样品中AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性杂交权利要求83所述的AARS多核苷酸的一种或多种寡核苷酸接触，检测所述样品中所述寡核苷酸的存在或不存在，并从而测定所述AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平。
96.一种测定样品中AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述样品与特异性扩增权利要求83所述的AARS多核苷酸的至少两种寡核苷酸接触，进行扩增反应，检测扩增产物的存在或不存在，并从而测定所述AARS剪接变体的多核苷酸序列的存在或水平。
97.权利要求95或96所述的方法，其中所述寡核苷酸特异性杂交或特异性扩增所述AARS剪接变体独特的剪接点。
98.权利要求95-97中任一项所述的方法，还包括将所述AARS蛋白片段或剪接变体的存在或水平与对照样品或预定值相比较。
99.权利要求98所述的方法，还包括表征所述样品的状态以使之与所述对照相区分。
100.权利要求98所述的方法，其中所述样品和对照包括细胞或组织，并且所述方法包括区分不同物种的细胞或组织、不同组织或器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞、或健康细胞与患病细胞。
101.一种鉴定特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽或其细胞结合配偶体的一种或多种的化合物的方法，所述方法包括:a)使所述AARS多肽或其细胞结合配偶体或两者与至少一种测试化合物在适合条件下混合，并b)检测所述AARS多肽或其细胞结合配偶体或两者与所述测试化合物的结合，从而鉴定特异性结合所述AARS多肽或其细胞结合配偶体或两者的化合物。
102.权利要求101所述的方法，其中所述测试化合物是多肽或肽、抗体或其抗原结合片段、肽模拟物、或小分子。
103.权利要求101所述的方法，其中所述测试化合物完全或部分激动所述AARS多肽或其细胞结合配偶体的非规范生物活性。
104.权利要求101所述的方法，其中所述测试化合物完全或部分拮抗所述AARS多肽或其细胞结合配偶体的非规范生物活性。
105.—种由权利要求101-104中任一项所述的方法鉴定的化合物。
106.—种药物组合物，包含权利要求56-74中任一项所述的AARS多肽、权利要求75-82中任一项所述的抗体或结合剂、权利要求83-91中任一项所述的AARS多核苷酸、或权利要求105所述的化合物，和药学上可接受的载体。
107.权利要求106所述的药物组合物，其不刺激受试者的免疫应答。
108.权利要求106所述的药物组合物，包含刺激受试者的免疫应答的至少一种佐剂。
109.一种调节细胞或蛋白的细胞活性的方法，所述方法包括使所述细胞或蛋白与权利要求56-74中任一项所述的AARS多肽、权利要求75-82中任一项所述的抗体或结合剂、权利要求83-91中任一项所述的AARS多核苷酸、权利要求105所述的化合物、或权利要求108所述的药物组合物接触。
110.权利要求109所述的方法，其中所述细胞活性选自细胞增殖、细胞分化、细胞信号传导、基因转录、血管生成、细胞结合、代谢、细胞因子生成或活性、细胞因子受体活性、和炎症。
111.权利要求110所述的方法，其中所述细胞类型选自:前脂肪细胞、骨髓、嗜中性粒细胞、血细胞、肝细胞、星形细胞、充质干细胞、和骨骼肌细胞。
112.权利要求111所述的方法，其中所述细胞在受试者中。
113.权利要求112所述的方法，包括治疗受试者，其中所述受试者具有与肿瘤疾病相关的病症、免疫系统疾病或病症、炎性障碍、感染性疾病、代谢疾病、神经元/神经疾病、肌肉/心血管疾病、与异常血细胞生成相关的疾病、与异常血管生成相关的疾病、或与异常细胞存活相关的疾病。
114.一种用于制备药物化合物的方法，所述方法包括: a)在包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列的至少40个氨基酸的AARS蛋白片段存在下进行一种或多种候选化合物的体外筛选，以鉴定特异性结合所述AARS蛋白片段的化合物； b)使用在步骤a)中鉴定的化合物进行基于细胞的测定，以鉴定调节所述AARS蛋白片段的一种或多种非规范活性的化合物； c)任选地评估在步骤b)中鉴定的化合物的结构-活性关系(SAR)，以使其结构与所述非规范活性的调节相关联，并任选地衍生化所述化合物以改变其调节所述非规范活性的能力；和 d)产生对于人类使用而言足量的在步骤b)中鉴定的化合物或在步骤c)中衍生的化合物，从而制备所述药物化合物。
115.一种用于制备药物化合物的方法，所述方法包括: a)在特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个的AARS蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分存在下进行一种或多种候选化合物的体外筛选，以鉴定特异性结合所述细胞表面受体或其细胞外部分的化合物； b)使用在步骤a)中鉴定的化合物进行基于细胞的测定，以鉴定调节所述AARS蛋白片段的一种或多种非规范活性的化合物； c)任选地评估在步骤b)中鉴定的化合物的结构-活性关系(SAR)，以使其结构与所述非规范活性的调节相关联，并任选地衍生化所述化合物以改变其调节所述非规范活性的能力；和 d)产生对于人类使用而言足量的在步骤b)中鉴定的化合物或在步骤c)中衍生的化合物，从而制备所述药物化合物。
116.一种细胞组合物，包含`工程化的细胞群，其中至少一个细胞包含编码异源全长甘氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白的多核苷酸，其中所述细胞能够在无血清培养基中生长。
117.权利要求116所述的细胞组合物，其中所述全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含异源纯化或表位标签以利于AARS蛋白片段的纯化。
118.权利要求116或117所述的细胞组合物，其中所述全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含异源蛋白水解位点以使AARS蛋白片段能够在切割时生成。
119.一种用于在细胞内原位生成权利要求56-74中任一项所述的AARS多肽的方法,所述方法包括:i)在所述细胞内表达异源全长甘氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，其中所述细胞包含能够切割所述异源全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白以生成所述AARS多肽的蛋白酶。
120.—种用于生成权利要求56-74中任一项所述的AARS多肽的方法,所述方法包括使分离的全长甘氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白与能够切割所述全长氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白并产生AARS多肽的蛋白酶接触。
121.—种工程化的全长甘氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，包含使表1_3、或表4_6、或表7-9任一个中所列的AARS蛋白片段能够蛋白水解生成的异源蛋白水解位点。
122.—种组合物，包含分离的全长甘氨酰-tRNA合成酶蛋白，其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清。
123.权利要求122所述的组合物，其中所述全长甘氨酰-tRNA合成酶蛋白以至少10mg/mL的浓度存在，并且是至少90%单分散的。
124.—种减轻或改善由甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的突变、或不合适的亚细胞缔合、过度表达、或亚细胞分布介导的疾病的至少一种症状的方法，所述方法包括向受试者施用基本上由表1-3、或表4-6、或表7-9、或表E2任一个中所列的氨基酸序列组成的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段。
125.权利要求124所述的方法，其中所述疾病是腓骨肌萎缩症2D型(CMT2D)或远端型脊肌萎缩症5型(dSMA-V)。
126.权利要求125所述的方法，其中所述疾病是CMT2D。
127.权利要求126所述的方法，其中所述至少一种症状是降低的神经传导速度。
128.权利要求127所述的方法，其中所述受试者已经确定具有选自E71G、L129P、P234KY、G240R、I280F、H418R、D500N、G526R、S581L、和 G598A 的甘氨酰 tRNA 合成酶中的至少一种突变。
129.权利要求128所述的方法，其中所述疾病是dSMA-V。
130.权利要求129所述的方法，其中所述至少一种症状是肌肉无力。
131.一种减轻或改善由甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的突变、不合适的亚细胞缔合、过度表达、或亚细胞分布介导的疾病症状的方法，所述方法包括向受试者施用特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9、或表E2任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体或结合剂，其中所述抗体对所述AARS蛋白片段的亲和力比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和力强约10X。
132.权利要求131所述的方法，其中所述抗体或结合剂拮抗所述AARS多肽的非规范活性。`
全文摘要
本文提供了包含氨酰-tRNA合成酶的新鉴定的蛋白片段的组合物、编码所述蛋白片段的多核苷酸及其互补物、相关剂、及其在诊断、药物发现、研究和治疗应用中的使用方法。
文档编号A61P35/00GK103118695SQ201180032101
公开日2013年5月22日 申请日期2011年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者莱斯利·安·格林尼, 凯尔·P·基昂格, 洪非, 阿兰·P·瓦瑟洛特, 罗咏诗, 杰弗里·D·沃特金斯, 谢丽尔·L·奎恩, 约翰·D·门德莱恩 申请人:Atyr 医药公司, 盘古生物制药有限公司