专利名称：一种介孔钙硅凝胶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及ー种介孔钙硅凝胶材料及其制备方法和应用。
背景技术：
介孔材料具有均一可调的介孔孔径(2_50nm)、规则的纳米孔道以及巨大的比表面积/孔容，可用作生物吸附剂、生物催化剂及载体，并在分离提纯生物活性物质和新型生物组装材料等领域有着广阔的应用前景。介孔材料的特点使其非常适用于蛋白质、酶等活性分子的吸附固定。通过调节孔径大小，介孔材料可选择性地吸附生物活性分子。也可以将蛋白、生长因子及酶等固定在其表面，通过表面修饰构建新一代分子生物材料。介孔材料作为ー种新型的纳米结构材料，已成为国际上跨化学、物理、材料、生物等多学科研 究热点和前沿之一。介孔硅基干凝胶由于具有规整的孔道结构，巨大的比表面积，优异的生物活性和生物相容性，可用于快速止血和骨组织修复等生物材料领域(Li XS, Lin W,Xin FL, et al. Adv Mater Res. 2011 ；340 (222) :222-228 ;Heinemann S, Heinemann C，Bernhardt R, et al. Acta Biomater. 2009 ;5 (6) : 1979-1990.)。另外，介孔娃基干凝胶在药物控释等领域显示了其潜在的应用前景(Lee EJ, Jun SH, Kim HE, et al. Silicaxerogel-chitosan nano-hybrids for use as drug eluting bone replacement. ChemMater Sci. 2010 ；21 (1) :207-214.)。以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为结构导向剂，并引入钙离子，制备了具有2. 62nm孔径的钙掺杂介孔ニ氧化硅微球，提高了其生物活性(Li X，乙hang LX, Dong XP,et al. Preparation of mesoporous calcium doped silica sphereswith narrow size dispersion and their drug loading and degradation behavior.Micropor Mesopor Mat. 2007 ；102 (1-3) :151-158.) □吴晓辉等通过溶胶-凝胶法制备了高比表面积(466.5m2/g)的有序介孔(3.7mn)钙掺杂硅干凝胶，证实了其在体外具有优良的生物活性(Wu XH, Ye L，Liu K，et al. Antibacterial properties of mesoporouscopper-doped silica xerogels. Biomed Mater. 2009 ；4 (4) :1_6.)。戴程龙等对介孔 I丐掺杂硅干凝胶进行了系统的研究，证实了该材料可用于快速止血及骨组织修复(Dai CL，L CS，Wei J.et al. Biomaterials. 2010 ；31 (30) :7620-7630. Dai CL，Guo H，Lu JX, etal. Biomaterials. 2011 ；32 (33) :8506-8517. ) 0然而，现有的钙硅基干凝胶的介孔孔径较小，其上限大约为8nm，材料对生物大分子如蛋白质的负载主要依靠其表面的物理吸附作用，材料吸附大分子的量较少，而且吸附后的大分子不能在材料上缓慢释放，出现瀑释，从而使该材料在大分子的控制释放等方面的应用受到一定的限制(Aertsa CA，Verraedta E，Deplaa A. Int J Pharmaceut. 2010 ；397 (1-2) :84-91. Tourne-Peteilh C，Begu S，Lerner DA, et al. J Sol-Gel SciTechn. 2012 ；61 (3) :455-462.)。赵东元等在酸性条件下，利用非离子型嵌段共聚物为模板，制备了一系列具有高度有序孔结构的六方介孔硅分子筛(SBA)，其孔径分布在5-30mnZJl] (Zhao DY，Feng JL, Huo QS, et a_L Triblock copolymer syntheses of mesoporoussilica with periodic 50 to 300 angstrom pores. Science. 1998 ;279 (5350)548-552.)，这为我们制备适合负载生物大分子如蛋白质的介孔材料提供了重要依据。外源性rhBMP-2是ー种生物大分子，具有很强的骨诱导活性(Pohla LM,Boergermannc jH, bchwaerzerc GK, et al.buriace immobilization of bonemorphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces celldifferentiation. Acta Biomater. 2012 ;8 (2) :772-780.)。然而，rhBMP-2 的体内半衰期短，全身和局部应用很快被稀释代谢，达不到所期望的生物学效果。因此rhBMP-2要在骨缺损发挥作用，必须有一个合适的载体才能达到在体内缓释进而长效发挥促进骨骼细胞生长的作用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的介孔钙硅基凝胶材料(MCS，Mesoporous caclium silicate)介孔直径较小,对蛋白质等生物大分子或药物分子的吸附量有限；而且该材料负载的生物大分子是以突释或瀑释方式(材料负载的生物大分子在很短时间内就被完全释放)从材料上释放，无法起到长效缓释功能的缺陷，提供一种新的介孔钙硅凝胶材料、所述介孔钙硅凝胶的制备方法、所述介孔钙硅凝胶在制备生物材料中的用途和所述的介孔钙硅凝胶/生物大分子复合物。本发明人通过大量实验惊喜地发现本发明制备的大孔径介孔钙硅凝胶不仅可作为细胞载体，而且可作为生物大分子的高容量载体，通过调控该材料的纳米孔道结构能够实现其负载的生物大分子的可控释放，从而完成了本发明。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是ー种介孔钙硅凝胶，其中所述介孔I丐娃凝胶的比表面积为257. 8m2/g 485. 6m2/g,平均孔径为3. 97nm 35nm,孔容为
0.48cm3/g I. 43cm3/g。本发明所述介孔钙硅凝胶的比表面积较佳地为257.8m2/g，平均孔径较佳地为35nm，孔容较佳地为I. 43cm3/g。其中所述的介孔钙硅凝胶粉末X-射线衍射图谱上在横坐标2 0为0 2°之间没有衍射峰，而在2 0为10 40°有一个广泛的吸收峰。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是ー种如上所述介孔钙硅凝胶的制备方法，其中所述制备方法包括以下步骤(I)将结构导向剂溶解在水中，调节溶液pH值为I 3，加入扩孔剂搅拌溶解，再加入硅源、钙源和磷源，30 50°C下进行反应；(2)将步骤(I)所得反应液pH值调节为9 13，80 120°C静置12 48小时得到沉淀，将所得沉淀洗涤至PH7 7. 2，80 100°C干燥48 72小时后550°C 700°C焙烧2 8小时，得到最终产品。其中步骤⑴所述的结构导向剂为本领域常规的结构导向剂，所述结构导向剂较佳地包括非离子型表面活性剤、阳离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂中的一种或几种。其中所述非离子型表面活性剂较佳地为EO2ciPO7ciEO2tl(Pluixmic P123)和EO106PO70EO106(Pluronic F127)中的ー种或两种。本发明所述导向剂优选地为非离子型嵌段共聚物 EO2qPO7qEO2q (Pluronic P123)。其中所述扩孔剂为本领域常规的扩孔剂，其中所述扩孔剂较佳地包括1，3，5-均三甲苯(TMB)、癸烷(Decane)和聚こニ醇(PEG)中的ー种或几种。本发明所述扩孔剂优选地为1，3，5-均三甲苯(TMB)。其中所述硅源为本领域常规的硅源。其中所述硅源较佳地包括正硅酸こ酯(TEOS)和正硅酸甲酯(TMOS)中的ー种或两种。本发明所述硅源优选地为正硅酸こ酷。其中所述的磷源为本领域常规的磷源。所述磷源较佳地包括磷酸三こ酯(TEP)和磷酸三甲酯(TMP)中的ー种或两种。本发明所述磷源优选地为磷酸三こ酷。其中所述钙源为本领域常规的钙源试剂，所述钙源试剂较佳地选自氯化钙、硝酸钙和醋酸钙中的ー种或几种。本发明所述钙源优选地为Ca(NO3)2 4H20。其中所述结构导向剂的添加量较佳地为2 4%，所述扩孔剂的添加量较佳地为2 4%,所述娃源的添加量较佳地为3 4%,所述磷源的添加量为0. 5 3%,所述I丐源 的添加量较佳地为I 3%，上述百分比均为质量百分比。步骤(I)所述调节溶液酸碱性方法为本领域常规方法，本发明优选用盐酸将溶液的PH值调节为I 3，所述搅拌时间较佳地为2 4小时，至溶液澄清后再加入硅源、钙源和磷源，30 50°C反应时间较佳地为12小时 36小时。其中所述步骤(2)调节溶液酸碱性方法为本领域常规方法，本发明优选使用氨水将溶液PH值调节为9 13，静置温度较佳地为80 120°C，静置时间较佳地为12 48小吋。将所得沉淀洗涤至中性，所述中性的PH值较佳地为7 7. 2，干燥温度较佳地为80 100°C，干燥时间较佳地为48 72小时，煅烧温度较佳地为550°C 700°C，焙烧时间较佳地为2 8小时，所述焙烧的升温速率较佳地为1°C /min 5°C /min。本发明所述介孔钙硅凝胶制备方法的优选实例为将3 Sg非离子型嵌段共聚物EO20PO70EO20(Pluronic P123, Sigma-AIdrich)作为结构导向剂(Mw = 5800)溶解在 200 300ml去离子水中，用磁力搅拌器強烈搅拌至溶液澄清；用37%浓盐酸调节溶液体系的pH值至pHl 3,加入4 8g扩孔剂1,3,5-均三甲苯,搅拌2 4h,至溶液成白色乳液,再将6 IOg正硅酸こ酷、5 8gCa (NO3)2 *4H20和I. 5g 4g磷酸三こ酯加入溶液反应体系中，将反应体系置于30°C 50°C水浴，继续反应12小吋 36小吋。用浓氨水将溶液反应体系PH值调节至pH9 13，溶液反应体系置于80°C 120°C烘箱，静置12小时 48小时后，得到白色沉淀。将白色沉淀用去离子水洗涤至PH7 7.2，并于80°C 100°C干燥箱内干燥48小时 72小时，用马弗炉将材料于550°C 700°C焙烧2小时 8小时，焙烧升温速率1°C /min 5°C /min,得到最终产品介孔I丐娃凝胶。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是本发明所述的介孔钙硅凝胶在制备生物材料中的用途。本发明所述介孔钙硅凝胶在制备生物材料中的用途为本领域常规的用途。其中所述用途较佳地包括所述介孔钙硅凝胶在制备生物材料支架的用途，在制备生物大分子和/或药物缓释载体的用途。本发明所述用途优选地为所述介孔钙硅凝胶在制备生物大分子和/或药物缓释载体中的用途。其中所述生物大分子是本领域常规使用的生物大分子。所述生物大分子较佳地包括蛋白质、酶、核酸和碳氢化合物中的ー种或几种。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是一种介孔钙硅凝胶复合物，所述的介孔钙硅凝胶复合物中包含如上所述的介孔钙硅凝胶以及该介孔钙硅凝胶负载的蛋白质分子和/或生物活性因子。
其中所述的生物活性因子是能改变细胞的行为或性质，通过与细胞特异的受体结合而起作用的ー类分子的统称。所述生物活性因子较佳地包括可溶性蛋白质分子、核酸分子、多糖分子或其他碳氢化合物类分子中的ー种或几种。其中所述蛋白质分子为本领域常规的蛋白质分子。所述蛋白质分子是指生物体中广泛存在的ー类生物大分子，由核酸编码的a氨基酸之间通过a氨基和a羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。本发明所述蛋白质分子优选地为rhBMP-2蛋白质分子(重组人骨形态发生蛋白-2)。所述rhBMP-2蛋白分子属于骨形态发生蛋白，该类蛋白具有诱导未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化的作用，在骨折和骨损伤的修复过程中发挥重要作用。所述rhBMP-2蛋白来源 较佳地包括天然提取、人工合成或体外重组表达等途径。天然提取是指从自然界的生物体中提取天然存在的rhBMP-2蛋白。人工合成是指通过化学方法在体外合成具有生物活性的rhBMP-2蛋白。体外重组表达是指在体外构建表达该蛋白的载体，选择合适的表达系统如原核表达系统或真核表达系统在体外表达、纯化获得具有生物活性的重组rhBMP-2蛋白。本发明所述介孔钙硅凝胶复合物中介孔钙硅凝胶成分的含量较佳地为0. 1% 99. 9%，优选的含量为0. 5% 90%,所述百分比为质量百分比。其中所述介孔钙硅凝胶复合物的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括以下步骤将蛋白质分子和/或生物活性因子溶于溶剂中，配制成蛋白质分子和/或生物活性因子溶液，加入介孔钙硅凝胶粉末，震荡反应、离心、烘干得到负载蛋白质分子和/或生物活性因子的介孔钙硅凝胶。其中所述蛋白质分子和/或生物活性因子较佳地为rhBMP-2分子(重组人骨形态发生蛋白-2)，所述溶剂较佳地为0. 02 0. 05M稀醋酸溶液，所述蛋白质分子溶液浓度较佳地为0. 5 lmg/mL。震荡反应温度较佳地为35 37°C，震荡频率较佳地为80 IOOr/min,反应时间较佳地为2 48小时，烘干温度较佳地为37 42°C。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本研究制备的大孔径介孔钙硅凝胶材料对生物活性因子具有容量高，缓慢释放的特性，不仅可作为细胞载体，还可作为生物活性因子的高容量载体，并通过调控其纳米孔道结构实现其可控释放功能。因此，该介孔钙硅凝胶材料具有调控组织再生和缓释生物活性因子的双重功能。同时本发明所述大孔径介孔钙硅凝胶材料，能有效地保持生物大分子的生物活性，是生物活性因子如rhBMP-2的控制释放的优良载体，所述介孔钙硅凝胶/rhBMP-2复合材料，对细胞増殖具有长效的促进作用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I是介孔钙硅凝胶材料及其复合材料制备流程示意图。(a)是制备MCS的流程示意图。(b)是制备MCS/rhBMP-2复合材料的制备流程示意图。图2是介孔钙硅凝胶材料小角X射线衍射图谱。a MCS-4 ；b MCS-35。图3是介孔钙硅凝胶材料广角X射线衍射图谱。a MCS-4 ；b MCS-35。图4是介孔钙硅凝胶材料傅里叶红外光谱。a MCS-4 ；b MCS-35。
图5是介孔钙硅凝胶材料低温氮气吸附-脱附等温线。a MCS-4 ；b MCS-35。图6是介孔钙硅凝胶材料孔径分布示意图。a MCS-4 ；b MCS-35。图7是介孔钙硅凝胶材料的TEM照片。a，b MCS-4 ；c, d MCS-35。图8是介孔钙硅凝胶材料的SEM照片。a，b MCS-4 ；c, d MCS-35。图9是介孔钙硅凝胶材料的激光粒度分布图。图10是介孔钙硅凝胶材料的EDS分析图。a MCS-4 ；b MCS-35。图11是介孔I丐娃凝胶材料对rhBMP-2的吸附曲线图和释放曲线图b。其中a是吸附曲线图，b是释放曲线图。图12是介孔钙硅凝胶材料在不同时间对细胞增殖的影响效果图。
具体实施例方式下面用实施例来进ー步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例I.介孔钙硅凝胶的制备采用模板诱导和自组装方法合成介孔I丐娃凝胶(MCS, Mesoporous cacliumsilicate)材料。将4. 8g非离子型嵌段共聚物E02(lP07(lE02(l (Pluronic P123, Sigma-Aldrich)作为结构导向剂(Mw = 5800)溶解在240ml去离子水中，用磁力搅拌器強烈搅拌至溶液澄清；用2ml 37% (v/v)浓盐酸调节溶液体系的pH值至pH = I,加入6g I,3,5-均三甲苯(扩孔剂)(TMB，国药集团化学试剂有限公司，AR)，搅拌2h，至溶液成白色乳液，再将8ml正硅酸こ酯(TE0S，上海凌峰化学试剂有限公司，AR)、3. 75g Ca(NO3)2 4H20和2. 5g磷酸三こ酷(TEP，国药集团化学试剂有限公司，AR)加入溶液反应体系中，将反应体系置于45°C水浴，再反应24h。用浓度为13M的氨水将溶液反应体系pH值调节至pH = 10，溶液反应体系置于100°C烘箱，静置48h后，得到白色沉淀。将白色沉淀用去离子水洗涤至pH值为7，并于80°C干燥箱内干燥12小时，用马弗炉将材料于550°C焙烧6h，升温速率1°C /min，得到最终产品。介孔钙硅凝胶制备流程如图1(a)所示。采用同样的方法，但不加入扩孔剂TMB，制备介孔钙硅凝胶材料作为对照组；所制备的两种介孔钙硅凝胶材料的配方如表I所示。表I MCS的组成成分
权利要求
1.一种介孔钙硅凝胶，其特征在于，所述介孔钙硅凝胶的比表面积为257. 8m2/g 485. 6m2/g，平均孔径为 3. 97nm 35nm，孔容为 O. 48cm3/g I. 43cm3/g。
2.如权利要求I所述的介孔钙硅凝胶，其特征在于，所述介孔钙硅凝胶粉末X-射线衍射图谱在横坐标2 Θ为10 40°有一个广泛的吸收峰。
3.—种如权利要求I所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤 (1)将结构导向剂溶解在水中，调节溶液PH值为I 3，加入扩孔剂搅拌溶解，再加入硅源、钙源和磷源，30 50°C下进行反应； (2)将步骤⑴所得反应液pH值调节为9 13，80 120°C静置12 48小时得到沉淀，将所得沉淀洗涤至PH7 7. 2，80 100°C干燥48 72小时后550°C 700°C焙烧2 8小时，得到最终产品。
4.如权利要求3所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述结构导向剂包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，其中所述的非离子型表面活性剂包括EO20PO70EO20和EO106PO70EO106中的一种或两种。
6.如权利要求3所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述所述扩孔剂包括1，3，5-均三甲苯、癸烷和聚乙二醇中的一种或几种，所述硅源包括正硅酸乙酯和正硅酸甲酯中的一种或两种，所述钙源包括Ca(NO3)2 · 4H20、氯化钙和醋酸钙中的一种或几种，所述磷源包括磷酸三乙酯和磷酸三甲酯中的一种或两种。
7.如权利要求3所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述所述导向剂的添加量为2 4%,所述扩孔剂的添加量为2 4%,所述I丐源的添加量为I 3%,所述硅源的添加量为3 4%，所述磷源的添加量为O. 5 3 %，上述百分比均为质量百分比。
8.如权利要求3所述的介孔钙硅凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述加入扩孔剂搅拌时间为2 4小时，30 50°C进行反应的时间为12 36小时；步骤⑵所述焙烧升温速率是I 5°C /min。
9.权利要求I所述的介孔钙硅凝胶在制备生物材料中的用途。
10.一种介孔钙硅凝胶复合物，其特征在于，所述介孔钙硅凝胶复合物中包含如权利要求I所述的介孔钙硅凝胶以及该介孔钙硅凝胶负载的蛋白质分子和/或生物活性因子。
全文摘要
本发明公开了一种大孔径介孔钙硅凝胶，该材料的比表面积257.8m2/g～485.6m2/g，平均孔径3.97nm～35nm，孔容0.48cm3/g～1.43cm3/g。该材料的制备方法包括将结构导向剂、扩孔剂溶于水中，pH1～3下水浴加热搅拌，加入钙源、硅源和磷源，将所得反应液pH值调节为9～13，80～120℃静置12～48小时得到沉淀，将所得沉淀洗涤至pH7～7.2，80～100℃干燥48～72小时后550℃～700℃焙烧2～8小时，得到最终产品。还公开了一种介孔钙硅凝胶复合物，该材料能很好地吸附并缓释生物活性因子，具有很好的细胞相容性并且能够有效促进细胞增殖。
文档编号A61L31/06GK102755650SQ20121026431
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者关曼, 刘昌胜, 吴钊英, 宋文华, 李享德, 王永丽, 邓玉虎, 魏杰 申请人:华东理工大学