专利名称：一种纳米金-多肽生物探针及制备和应用方法
技术领域：
本发明涉及一种探针及制备和应用方法，特别是涉及一种纳米金-多肽生物探针及制备和应用方法，用于暗场显微镜下直接观察纳米生物探针与细胞的相互识别和作用，属于纳米材料的功能化及应用领域。
背景技术：
纳米金是研究很早的一种纳米材料，通常在水溶液中以胶体金的形态存在。目前最经典的制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法。胶体金的性质主要取决于金颗粒的直径及其表面特性。由于其直径在1-1OOnm之间，而大多数重要的生物分子如蛋白质、核酸等的尺 寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米金作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程。金纳米粒子由于良好的生物相容性和无毒副作用，被广泛应用生物分析化学，在生物分子标记和检测、纳米生物传感器和纳米生物芯片等技术的开发和应用方面取得了重要的进展纳米金探针在DNA检测中的应用，纳米金探针在免疫分析中的应用，纳米金探针在单细胞分析中的应用，纳米金探针在靶向药物中的应用等。在上述应用中，虽然纳米金颗粒呈红色至紫色变化，有利于肉眼观察，但直接将其用于光学检测灵敏度仍受到限制。需将其与传统的荧光染料标记法、银染放大技术、表面增强拉曼散射技术等结合使用，则不可避免地遭遇荧光分子光漂白现象、涉及大型仪器如激光共聚焦荧光显微镜以及激光共聚焦拉曼光谱仪等，大大增加研究成本。而暗视野显微镜可分辨达O. 004 m以上的微粒的存在和运动，这大大优于普通显微镜(最大分辨力为O. 2 m)。另外，普通显微镜只要聚光器可拆卸，支架的口径适于安装暗场聚光器，即可改装成暗场显微镜。对比共聚焦荧光显微镜等大型仪器，过程更为简单易于操作。现在的研究中，较少利用暗场显微镜观察纳米生物探针与细胞相互作用及成像的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种纳米金-多肽生物探针及制备方法，同时提供该纳米生物探针在细胞检测、成像及作为载药工具的应用。一种纳米金-多肽纳米生物探针，其特征在于，将多肽组装在纳米金颗粒表面，在暗场显微镜下可直接观察到该纳米生物探针，将制备的此探针与细胞共培养后，可利用暗场显微镜观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布、形态以及其他的相互关系和作用。所述纳米金为还原法制备的胶体金颗粒，其颗粒直径为15 70纳米。—种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)将原料溶液加入到烧瓶中，加热并冷凝回流至沸腾；
(2)沸腾溶液中快速加入还原剂溶液，持续搅拌，观察颜色变化，颜色稳定无变化时，停止加热，形成溶液液I ;(3)溶液I继续搅拌室温过夜后，过滤；
(4)由步骤(3)制备的纳米金溶液中加入碱性溶液A，调节pH值；
(5)向步骤(4)得到的溶液中加入多肽溶液，混合均匀，进行组装；
(6)同样条件下，向由步骤(3)制备的另一组纳米金溶液中加入封闭剂；
(7)溶液离心，去上清，用双蒸水重悬浮，洗涤过程重复三次；
(8)洗涤后的纳米金生物探针用细胞培养液重悬浮；
(9)将处理后的纳米金生物探针加入到细胞培养皿中，于37°C，5.0% 二氧化碳的细胞·培养箱中与细胞共培养；
(10)将细胞用缓冲液洗涤后，用暗场显微镜观察，可以选择如下方法中的一种
(a)将细胞用多聚甲醛或甲醛固定后，即可通过暗场显微镜直接观察到细胞形态以及表面或内部的纳米金-多肽生物探针；
(b)将细胞洗涤后，直接将活细胞通过暗场显微镜观察到活细胞形态以及其内部或表面连接的纳米金-多肽生物探针。所述的原料溶液为O. 01%的氯金酸水溶液10 500毫升。所述还原剂可为柠檬酸三钠、抗坏血酸、鞣酸、硼氢化钠中的一种，所述还原剂的浓度为1%，加入量为O. 05 10晕升。步骤(4)所述碱性溶液A为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾水溶液中的一种，浓度为O.1 2M ;所述调节后的溶液pH值为8 10。步骤(5)所述多肽为N端标记有一个半胱氨酸；所述多肽溶液的浓度为25 M，体积为20 100微升。步骤(6)所述封闭剂为O.1 2% PEG6000水溶液，或O.1 2%酪蛋白溶液。步骤(7)所述离心条件为12000 5000rpm/min,5分钟，4°C。所述纳米金生物探针表面组装的多肽可特异性识别细胞表面的受体；步骤(9)所述纳米金-多肽纳米生物探针与细胞共培养时间为30 120分钟。本专利利用制备的金-多肽纳米生物探针应用于细胞的暗场成像，不需要额外的荧光标记，操作简便，降低了研究成本。纳米金-多肽纳米生物探针与细胞结合明显，在暗场显微镜下能清晰地看到细胞表面附着彩色颗粒(纳米金在暗场显微镜下的衍射成像，不同的颜色对应不同纳米金粒径)，而作为对照组，空白细胞以及与纳米金-PEG共培养的对照组，细胞表面则无明显彩色颗粒存在。运用此方法，不必使用荧光分子进行特别标记，以及不受荧光分子的光漂白影响，能直观地观察到纳米生物探针与细胞的识别与相互作用，并且，由于纳米金良好生物相容性，将其作为药物载体进行癌细胞的针对治疗成为可能。
图1为细胞在暗场显微镜下成像.
图2为纳米金表面包裹了 PEG分子后，与细胞共培养后在暗场显微镜下成像。图3为纳米金-多肽纳米生物探针与细胞共培养后在暗场显微镜下的成像。
具体实施例方式实施例1 :取O. 01%氯金酸水溶液IOOmL,加热至沸腾，搅动下快速准确加入1%柠檬酸三钠水溶液lmL，淡黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为浅灰色，继续煮沸，溶液颜色依次变化为浅紫色、紫红色。继续煮沸15分钟，溶液不再发生变化时，停止加温，继续搅拌过夜后用O. 22 m滤膜过滤，4°C条件下保存。测试溶液紫外吸收，发现最高峰为525nm处，制备的纳米金粒径为40nm。取制备的40nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入25 M多肽溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。同时制备纳米金-PEG作为对照组取制备的40nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入2%PEG溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。两者于4°C环境下8000rpm/min离 心5min,去上清,用双蒸水重悬浮,重复离心洗涤3次后用200 L细胞培养液重悬浮。各取溶液100 L加入到含2mL培养液的神经胶质瘤细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中培养lh。结束后，PBS (磷酸盐缓冲液)冲洗3次，加入甲醛固定液2mL，固定IOmin后，双蒸水清洗3次，暗场显微镜下分别成像。实施例2:
取O. 01%氯金酸水溶液IOOmL,加热至沸腾，搅动下快速准确加入1%柠檬酸三钠水溶液lmL，淡黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为浅灰色，继续煮沸，溶液颜色依次变化为浅紫色、紫红色。继续煮沸15分钟，溶液不再发生变化时，停止加温，继续搅拌过夜后用O. 22 m滤膜过滤，4°C条件下保存。测试溶液紫外吸收，发现最高峰为525nm处，制备的纳米金粒径为40nm。取制备的40nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入25 M多肽溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。同时制备纳米金-PEG作为对照组取制备的40nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入2%酪蛋白溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。两者于4°C环境下8000rpm/min离心5min,去上清,用双蒸水重悬浮,重复离心洗涤3次后用200 L细胞培养液重悬浮。各取溶液100 L加入到含2mL培养液的神经胶质瘤细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中培养lh。结束后，PBS冲洗3次，力口入甲醛固定液2mL，固定IOmin后，双蒸水清洗3次，暗场显微镜下分别成像
实施例3:
取O. 01%氯金酸水溶液IOOmL，加热至沸腾，搅动下快速准确加入1%柠檬酸三钠水溶液2mL,淡黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为浅灰色，继续煮沸，溶液颜色依次变化为浅紫色、酒红色。继续煮沸15分钟，溶液不再发生变化时，停止加温，继续搅拌过夜后用O. 22 m滤膜过滤，4°C条件下保存。测试溶液紫外吸收，发现最高峰为518nm处，制备的纳米金粒径为 15nm。取制备的15nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入25 M多肽溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。同时制备纳米金-PEG作为对照组取制备的15nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入2%PEG溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。两者于4°C环境下12000rpm/min离心5min,去上清,用双蒸水重悬浮,重复离心洗涤3次后用200 L细胞培养液重悬浮。各取溶液100 L加入到含2mL培养液的神经胶质瘤细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中培养lh。结束后，PBS冲洗3次，力口入甲醛固定液2mL，固定IOmin后，双蒸水清洗3次，暗场显微镜下分别成像。实施例4 ；
取O. 01%氯金酸水溶液IOOmL,加热至沸腾，搅动下快速准确加入1%柠檬酸三钠水溶液1. 5mL，淡黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为浅灰色，继续煮沸，溶液颜色依次变化为浅紫色、深红色。继续煮沸15分钟，溶液不再发生变化时，停止加温，继续搅拌过夜后用O. 22 m滤膜过滤，4°C条件下保存。测试溶液紫外吸收，发现最高峰为522nm处，制备的纳米金粒径为25nm。取制备的25nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入25 M多肽溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。同时制备纳米金-PEG作为对照组取制备的25nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH 值为10。向该溶液中加入2%PEG溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。两者于4°C环境下10000rpm/min离心5min,去上清,用双蒸水重悬浮,重复离心洗涤3次后用200 L细胞培养液重悬浮。各取溶液100 L加入到含2mL培养液的神经胶质瘤细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中培养lh。结束后，PBS冲洗3次，力口入甲醛固定液2mL，固定IOmin后，双蒸水清洗3次，暗场显微镜下分别成像。实施例5
取O. 01%氯金酸水溶液IOOmL,加热至沸腾，搅动下快速准确加入1%柠檬酸三钠水溶液O. 7mL，淡黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为浅灰色，继续煮沸，溶液颜色依次变化为浅紫色、深红色。继续煮沸15分钟，溶液不再发生变化时，停止加温，继续搅拌过夜后用O. 22 m滤膜过滤，4°C条件下保存。测试溶液紫外吸收，发现最高峰为536nm处，制备的纳米金粒径为70nm。取制备的70nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入25 M多肽溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。同时制备纳米金-PEG作为对照组取制备的70nm金200 L，加入O.1M NaOH溶液20 L，所得溶液pH值为10。向该溶液中加入2%PEG溶液20 L，充分混匀，室温下组装30min。两者于4°C环境下5000rpm/min离心5min,去上清,用双蒸水重悬浮,重复离心洗涤3次后用200 L细胞培养液重悬浮。各取溶液100 L加入到含2mL培养液的神经胶质瘤细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中培养lh。结束后，PBS冲洗3次，力口入甲醛固定液2mL，固定IOmin后，双蒸水清洗3次，暗场显微镜下分别成像。
权利要求
1.一种纳米金-多肽纳米生物探针，其特征在于，将多肽组装在纳米金颗粒表面，在暗场显微镜下可直接观察到该纳米生物探针，将制备的此探针与细胞共培养后，可利用暗场显微镜观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布、形态以及其他的相互关系和作用。
2.根据权利要求1所述一种纳米金-多肽纳米生物探针，其特征在于，所述纳米金为还原法制备的胶体金颗粒，其颗粒直径为15 70纳米。
3.根据权利要求1所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，包括以下步骤将原料溶液加入到烧瓶中，加热并冷凝回流至沸腾；沸腾溶液中快速加入还原剂溶液，持续搅拌，观察颜色变化，颜色稳定无变化时，停止加热，形成溶液液I ;溶液I继续搅拌室温过夜后,过滤；由步骤(3)制备的纳米金溶液中加入碱性溶液A，调节pH值；向步骤(4)得到的溶液中加入多肽溶液，混合均匀，进行组装；同样条件下，向由步骤(3)制备的另一组纳米金溶液中加入封闭剂；溶液离心，去上清，用双蒸水重悬浮，洗涤过程重复三次；洗涤后的纳米金生物探针用细胞培养液重悬浮；将处理后的纳米金生物探针加入到细胞培养皿中，于37°C，5. 0% 二氧化碳的细胞培养箱中与细胞共培养；将细胞用缓冲液洗涤后，用暗场显微镜观察，可以选择如下方法中的一种将细胞用多聚甲醛或甲醛固定后，即可通过暗场显微镜直接观察到细胞形态以及表面或内部的纳米金-多肽生物探针；将细胞洗涤后，直接将活细胞通过暗场显微镜观察到活细胞形态以及其内部或表面连接的纳米金-多肽生物探针。
4.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，所述的原料溶液为O. 01%的氯金酸水溶液10 500毫升。
5.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，所述还原剂可为柠檬酸三钠、抗坏血酸、鞣酸、硼氢化钠中的一种，所述还原剂的浓度为 1%，加入量为O. 05 10晕升。
6.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，步骤(4)所述碱性溶液A为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾水溶液中的一种，浓度为O.1 2M ;所述调节后的溶液pH值为8 10。
7.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，步骤(5)所述多肽为N端标记有一个半胱氨酸；所述多肽溶液的浓度为25 M，体积为 20 100微升。
8.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，步骤(6)所述封闭剂为O.1 2% PEG6000水溶液，或O.1 2%酪蛋白溶液。
9.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，步骤(7)所述离心条件为:12000 5000rpm/min, 5分钟,4°C。
10.根据权利要求3所述一种纳米金-多肽纳米生物探针的制备及应用方法，其特征在于，所述纳米金生物探针表面组装的多肽可特异性识别细胞表面的受体；步骤(9)所述纳米金-多肽纳米生物探针与细胞共培养时间为30 120分钟。
全文摘要
本发明涉及一种纳米金-多肽纳米生物探针及制备和应用方法。一种纳米金-多肽纳米生物探针，其特征在于，将多肽组装在纳米金颗粒表面，在暗场显微镜下可直接观察到该纳米生物探针，将制备的此探针与细胞共培养后，可利用暗场显微镜观察细胞内部及表面的纳米金生物探针的数量、分布、形态以及其他的相互关系和作用。运用此方法，不必使用荧光分子进行特别标记，以及不受荧光分子的光漂白影响，能直观地观察到纳米生物探针与细胞的识别与相互作用，并且，由于纳米金良好生物相容性，将其作为药物载体进行癌细胞的针对治疗成为可能。
文档编号A61K47/02GK103014117SQ20121053869
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者颜娟, 宋世平, 樊春海, 何丹农 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司