含有血红蛋白的脂质体及其制造方法
【专利摘要】本发明提供一种确保血红蛋白的高封入率并且物理稳定性及生物体内稳定性优异的、具有特定的膜组成的、含有血红蛋白的脂质体及其制造方法。所述含有血红蛋白的脂质体中，作为脂质体的内液，含有血红蛋白溶液，该脂质体的膜由磷脂、胆固醇及高级饱和脂肪酸的混合脂质构成，并且所述胆固醇/磷脂的摩尔比为0.7～1.0，所述混合脂质中的硬脂酸的含有率为25～30摩尔%。优选所述脂质体的膜还含有相对膜构成脂质的总量为0.8摩尔%以上的聚乙二醇结合磷脂，该聚乙二醇结合磷脂结合至所述膜的外表面。
【专利说明】含有血红蛋白的脂质体及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明特别涉及一种确保血红蛋白的高封入率并且物理稳定性及生物体内稳定性优异的、含有血红蛋白的脂质体及其制造方法。
【背景技术】
[0002]针对作为担负人工氧运送体的氧运送的物质使用来自红细胞的血红蛋白的方法，已经进行了研究，但已知血红蛋白单体欠缺在生物体内的稳定性，另外，由于其毒性作用故而成为多种组织损伤的原因，因此虽然一直在尝试使用对血红蛋白进行化学修饰以使其稳定化的分子，但尚未解决这些问题点。
[0003]另一方面，对于在脂质体内封入了血红蛋白的含有血红蛋白的脂质体而言，在血红蛋白被封入小胞体内的这一方面，模拟了红细胞的构造，认为其可能避免血红蛋白的毒性作用，已在进行将其作为人工氧运送体的研究。
[0004]关于含有血红蛋白的脂质体，迄今为止，虽然公开了用于将血红蛋白以高收率封入脂质体内的、膜成分的构成(参见专利文献I)、制造方法(参见专利文献2)，但是，针对将脂质体膜(该脂质体膜能够同时实现下述条件:在维持血红蛋白的高收率的同时，还确保脂质体在生物体内的稳定性，不使通过将血红蛋白封入小胞体内而获得的脂质体化的意义丧失)的构成成分的含量比例、与平均粒径、血红蛋白/脂质的比例这类物理化学性质组合、并进行适当设计的研究尚不充分。
[0005]制备含有血红蛋白的脂质体时，为了在防止作为蛋白质的血红蛋白变性的同时将其封入脂质体内，需要低温条件下的乳化处理。对于作为脂质体膜的构成材料通常使用的磷脂，与生物膜的相似性高、对生物体的亲和性高，特别是由饱和脂肪酸构成的磷脂可作为能安全使用的物质被应用于医药品，但为饱和磷脂的情况下，相转移温度高，难于在低温下形成脂质体。
[0006]另一方面，发现通过向饱和磷脂中配合胆固醇，相转移温度的分布发生变化，进而通过配合脂肪酸，即使在低温的乳化条件下也能将血红蛋白掺入脂质体内，但是也公开了如果脂肪酸的量增加过度则脂质体自身将不稳定(参见专利文献I)。
[0007]因此，要求以能够同时实现血红蛋白的收率及脂质体的稳定性两者的比例进行配合，但是，即使在作为脂质体的物理稳定性足够高的条件下，在生物体内，由于与生物体成分的相互作用，存在血红蛋白漏出(leak)的可能性。血液中游离的血红蛋白为少量时，其与血液中的结合珠蛋白(haptoglobin)结合，被运送至肝脏而被处理，因此对生物体造成不良影响的可能性较低，但是超过了其处理量的情况下，血液中将存在游离状态的血红蛋白。血液中珠结合蛋白的量的幅度相当大，难于对可处理的量进行严格规定，但是上述脂肪酸(硬脂酸)的配合量比例为35摩尔％以上时，就认为血浆中的血红蛋白浓度有可能超过该可处理的浓度范围。血红蛋白浓度超过该可处理的量的范围的情况下，血浆中将存在游离的血红蛋白，该血红蛋白比较容易 分解成2聚体，虽然分解的二聚体在肾小管中被过滤、排泄进尿中，但是已知在血红蛋白大量漏出的情况下其积蓄在肾小管中、造成毒性影响。进而还认为:血红蛋白从血管内皮细胞的间隙漏出到血管外，其容易结合并捕捉血管内皮细胞产生的调节血管平滑肌细胞的紧张、松弛状态的因子一氧化氮(NO)，使得血管平滑细胞收缩。对血红蛋白进行了化学修饰的类型的人工氧运送体中，作为副作用而成为问题的血管收缩以及对心肌的影响被认为与该现象相关，避免该现象的发生，对于将血红蛋白囊泡(capsule)化这样的构思而言是最重要的问题，血红蛋白从囊泡的漏出将有可能危及该构思本身。
[0008]另外，特别是在脂肪酸含量增加的情况下，脂肪酸的特性导致脂质体的表面电荷倾向于为阴性，结果导致产生下述问题:补体系统容易活化、生物体内脂质体不稳定性、生物体内寿命缩短。
[0009]另外，对于尽量高效地将物质内封进脂质体而言，增大平均粒径、相对地使脂质体膜变薄，即，尽量减少相对于血红蛋白的脂质的含量比例是有效的，但另一方面，增大粒径促进向生物体内的网状内皮系统的掺入，导致血液中的寿命缩短(参见非专利文献I~2)。另外，通过增大粒径，相对而言，相对于掺入到内部水相中的物质而言，膜脂质成分的含量相对变小，内部水相中存在的有效成分(即，在含有血红蛋白的脂质体中，该有效成分为血红蛋白)被给予生物体内的情况下，从能减少给予生物体的脂质体膜脂质的负荷量这点来说，具有安全性方面的优点。而另一方面，在包含具有能在低温下乳化的温度特性的脂质膜成分的脂质体中，增大粒径、使得膜相对变薄的话，仅此就使得脂质体自身物理性脆弱、不稳定，特别是在生物体内，还有血红蛋白容易发生漏出的问题。
[0010]另外，对于脂质体，已知通过向脂质体膜表面导入聚乙二醇(PEG)结合磷脂这样的亲水性高分子构造，能使得生物体内的稳定性提高(参见专利文献3)，对于含有血红蛋白的脂质体，作为避免血浆中脂质体凝集、避免因给予脂质体而导致的生物体反应的手段，也同样公开了通过聚乙二醇结合磷脂来修饰脂质体膜表面的方法，但是尚未有考虑了前述为兼具高收率和生物体内稳定 性的要件而进行的研究。
[0011]作为防止利用上述脂质体的补体系统活化、防止向网状内皮系统的掺入促进的有效手段，已知通过聚乙二醇这样的亲水性高分子修饰脂质体的膜的方法，虽然公开了通过聚乙二醇结合磷脂仅修饰脂质体膜表面的方法，但是，在前述为了达成高收率使得脂肪酸的配合量增加的含有血红蛋白的脂质体中，为了使其膜表面的阴性电荷成为中性状态(此时补体系统难于发生活化)(参见非专利文献3)而必要的条件尚属未知。
[0012]另外，关于聚乙二醇结合磷脂的向脂质体膜表面的导入量，依赖于添加量，向膜的导入量也有所增加，但是并非单纯地添加量越多越好，过量添加导致游离状态的、聚乙二醇结合磷脂的比例增加。有报道指出，聚乙二醇结合磷脂自身是通过两亲性媒介的性状保持界面活性效果的物质，其以高浓度以游离状态存在时，导致脂质体等内封物质漏出(参见非专利文献4)，另外还有报道指出聚乙二醇结合磷脂向脂质体膜的导入量有可能影响内封物质的漏出(参见非专利文献5)，进而，如果使聚乙二醇结合磷脂添加量增加的话，则在制造工艺中对聚乙二醇结合磷脂进行导入处理时，还存在脂质体膜容易不稳定化的问题。
[0013]专利文献1:国际公开第03/015753号公报
[0014]专利文献2:日本特开2005-2055号公报
[0015]专利文献3:日本特开平2-148515号公报
[0016]非专利文献 1:1shida O 等，Size-dependent exravasation and interstitiallocalization of polyethyleneglycoI liposomes in solid tumor-bearing mice.1nt JPharmacol1999;190:49-56
【权利要求】
1.一种含有血红蛋白的脂质体，所述脂质体含有血红蛋白溶液作为脂质体的内液，所述脂质体的膜由磷脂、胆固醇、高级饱和脂肪酸及聚乙二醇结合磷脂的混合脂质构成，并且所述胆固醇/磷脂的摩尔比为0.7~1.0，所述混合脂质中的硬脂酸的含有比例为25~30摩尔％，相对于膜构成脂质总量，聚乙二醇结合磷脂的量为0.8~1.1摩尔％。
2.根据权利要求1所述的含有血红蛋白的脂质体，其中，所述脂质体的膜中，所述聚乙二醇结合磷脂结合至所述膜的外表面。
3.根据权利要求1或2所述的含有血红蛋白的脂质体，其中，所述含有血红蛋白的脂质体的平均粒径为200~250nm。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的含有血红蛋白的脂质体，其中，血红蛋白/所述混合脂质(质量比)为1.1~1.6。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的含有血红蛋白的脂质体，其中，Zeta电位为OmV以上。
6.一种制造权利要求1~ 5中任一项所述的含有血红蛋白的脂质体的方法。
【文档编号】A61K47/24GK103796668SQ201280045275
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2011年9月28日
【发明者】金田伸一, 后藤博, 上田努, 石塚隆伸, 本山慎二 申请人:泰尔茂株式会社