由具有特定免疫显性表位的婴儿利什曼虫pfr1蛋白片段组成的嵌合分子可用于抗利什曼 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种独立核苷酸序列，它是编码婴儿利什曼虫PFR1蛋白或其片段的序列，其中的PFR1蛋白或其片段含有至少一种从以下组别中选取的免疫显性表位：SEQ?ID?No：1、SEQ?ID?No：2、SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5、SEQ?ID?No：6、SEQ?ID?No：7和SEQ?ID?No：8，其中的免疫显性表位可以诱导动物抗原特异性T细胞毒性免疫反应，该反应的对象为导致利什曼病的动质体。上述免疫显性表位激活的T细胞毒性淋巴细胞，并对I类A2型MHC分子具有高度结合亲和力。
【专利说明】由具有特定免疫显性表位的婴儿利什曼虫PFR1蛋白片段组成的嵌合分子可用于抗利什曼病的免疫疗法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学和药品行业，医学、分子生物学、免疫学、寄生虫学和兽医学领域，涉及用于控制利什曼病的免疫学工具。所述疾病是由利什曼虫属中不同种类的原虫所引起。
【背景技术】
[0002]利什曼虫属的物种(原生动物细胞内寄生虫)属于动质体目锥虫科，分布于全球的热带和亚热带地区，会引起名叫利什曼病的广泛临床症状。根据引发疾病的物种不同，利什曼病可以分为皮肤型、皮肤粘膜型和内脏型(根据其组织嗜性和临床引起的症状)。利什曼病近年的发病率大幅上升，成为遍及全大陆88个国家的地方病，据称有3.5亿人面临感染该疾病的风险。(WHO报告,http: "who, int/ctd/html/leisdis.html)。据估计，全球约有1200万人受利什曼病的影响。在每年200万的新发病例中，500，000例为内脏型利什曼虫病(VL)。该疾病是由婴儿利什曼虫和杜氏利什曼虫引起的，症状包括间歇热、贫血、脾肿大、肝肿大和淋巴结病。VL会使受影响病人的免疫力下降，引起合并感染，所以常导致死亡。近年，利什曼虫/HIV合并感染成为地中海地区国家的主要健康问题。在这些国家中，犬类是主要宿主，是人类该疾病的储主(Alvar等人.2004国际寄生虫学期刊57:1_88)。
[0003]接种疫苗是预防传染病因子引起疾病和死亡的最有效治疗方法。尽管如此，目前对抗病原体的高效疫苗非常少，其中一种疫苗能有效对抗传染病因子。近年，在不同的利什曼原虫中对多种抗原疫苗及其制品进行试验，并得出了迥然不同的结果(Kedzierski等人.2010.世界传染病杂志 2(2):177-85 ；Kedzierski 等人.2006.寄生虫学，133:87-112 ；Requena等人.2004.生物疗法专家评论4 (9): 1505-17)。但到目前为止，还没找到令人完全满意的疫苗。
[0004]对抗疾病的另一个选择是治疗药物，或在没有治疗药物时，采用化学免疫疗法。试验在含佐剂的巴氏消毒完整寄生虫(Convit等人.2003医学和卫生学97:469-72)以及寄生虫和抗原的混合物中进行(Badaro等人.2006感染性疾病杂志194:1151-9)，但和疫苗的情况相类似，试验没有取得最终的成功(El-OnJ.2009.以色列医学学会期刊11(10):623-8)。
[0005]如上文所述，犬类是该疾病的主要储主，所以也从对抗这种人畜共患病的免疫学角度出发，做出了一些尝试。事实上，利什曼病对犬类来说是严重的寄生虫病。最常见的临床症状是脱毛，特别是眼睛、耳朵和鼻子周围的毛。当疾病进一步恶化时，狗没有食欲且体重下降，且皮肤通常会出现伤口，特别是头部和腿部，并出现肾衰竭的相关症状。该疾病是西班牙大部分地区以及地中海地区绝大部分国家的地方病。
[0006]和在人类中的情况相似，人们为控制该疾病做出了多方面的尝试，但迄今为止还未得到完全令人满意的成功(Alvar等人.2004.国际寄生虫学期刊57:1_88 ;Reis等人.2010寄生虫学趋势26 (7): 341-9).[0007]无论是人类还是犬利什曼病，最具有潜力的控制方法之一都指向使用DNA疫苗。该疫苗携带多个编码特定利什曼虫抗原或含不同寄生虫抗原的嵌合重组蛋白的基因(De Oliveira 等人.2009 国际寄生物学 58(4):319-24 ；Palatnik-de-Sousa, 2008.疫苗26:1709-1724).[0008]PFR蛋白(副鞭毛杆蛋白)代表了一个tripanosomatids相关特定抗原的家族,位于这些寄生虫的副鞭毛区(Fouts等人.，1998生物化学杂志273 (34): 21846-21855 ；Clark等人.，2005.寄生虫学研究杂志96 (5):312-320)。该抗体家族某些成员(PFR1-3蛋白)的高免疫原性尤为突出(Michailowsky等人.，传染与免疫71 (6):3165-3171)。从克氏锥虫中纯化出带PFRl和PFR2的小鼠免疫，其所诱导的Thl免疫反应在实验性感染试验中，可以减少已接种疫苗并已感染克氏锥虫寄生虫小鼠的心脏组织中克氏锥虫的载量(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055)。这些结果显示，PFR蛋白可能适合作疫苗使用。根据这些结果，发现从接种PFR小鼠中分离到的淋巴细胞⑶4+可以激活寄生虫感染的巨噬细胞，通过释放 NO 使寄生虫死亡(Wrightsman 等人.2000 疫苗 18 (14): 1419-27，Miller 等人.1997免疫学杂志158(11):5330-7)，还可以在缺少B细胞，但不缺少功能性⑶4+和⑶8+淋巴细胞的情况下，减少血液中的寄生虫水平。从基因免疫的角度出发，对不同动质体的不同副鞭毛蛋白进行了研究。L.mexicana PFR2蛋白在作为DNA和重组蛋白接种后，显示出免疫原性和保护能力(Saravia等人.2005疫苗23:984-995)。小鼠在接种含仅编码克氏锥虫PFR2蛋白基因或嵌合相同病原体的Hsp70蛋白基因的DNA载体后，诱导出高水平的IgG2a型抗PFR抗体。但是，只有接种嵌合疫苗的小鼠激发产生出IL-12和IFN- Y，并使产生IL-4的细胞减少，引发抗克氏锥虫的保护反应(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055).[0009]Hsp70蛋白属于热休克蛋白(HSP)家族，在多个不同物种中都具有广泛的保守性(真核生物和原核生物)。他们通过发挥伴护作用，成为维持细胞自动调节的基础(Smith, Whitesell等人.1998药理学评论50(4):493-513)。它们有趣的地方在于可以激活免疫系统，突出Hsp70的免疫多功能性。Hsp70蛋白是从肿瘤细胞或病毒感染细胞中获取，它在体内和体外都可以激活CD8+CTL反应，对抗纯化出免疫原蛋白细胞中的多种表达抗原(Srivastava.2002自然免疫学评论2:185-194 ;Wu等人.，2005.癌症研究65(11):4947-4954)。因此，细胞外的Hsp70可以和抗原肽形成复合物，同时激活APCs。这种相互作用激发一连串事件，包括肽交叉呈递到⑶8+(限制MHC I)和T⑶4+细胞(限制MHC II)、分泌促炎细胞因子、以及树突细胞(DCs)表型及功能的成熟(Asea等人.2000自然医学6:435-442 ；Basu等 人.2001免疫学14:303-313 ；Harmala等人.2002免疫学杂志169:5622-5629 ;Tobian 等人.2004 免疫学杂志 173:5130-5137)。
[0010]我们在实验室进行了体外试验，显示克氏锥虫Hsp70蛋白对首次接受试验小鼠的脾和神经节细胞产生特有的刺激效应(MaraPi ? η等欠2QQQ.国际免疫学12(12):1685-1693)，导致T细胞产生快速而强烈的刺激。此外，这种蛋白可以在体外和体内产生抗相关半抗原的混合免疫反应(IgGl和IgG2a)。有趣的是，这种反应独立于TLR2和TLR4受体(Qazi等人.2007疫苗25 (6):1096-1103)。小鼠接种了携带编码克氏锥虫HSP70蛋白和KMPlI蛋白序列的载体后，这种克氏锥虫HSP70蛋白可以引发抗KMPlI蛋白的特异反应。该反应是通过激活IgG2a型特异抗体的产生，以对抗KMPll (Thomas, Olivares等人.2000DNA和细胞生物学19(1):47-57 ；Thomas, Olivares等人.2000热带学报75⑵:203-210)。此外，小鼠接种了 KMP11-HSP70融合蛋白后，出现细胞毒性淋巴细胞反应，抗表达KMPlI蛋白的Jurkat-A2/Kb细胞，以及那些携带对A2分子具亲和力的KMPll衍生肽的细胞。接种分离KMPll蛋白的小鼠则不出现该反应。将Hsp70和杜氏利什曼虫的gp63金属蛋白酶用于利什曼虫属时，获得了相似的结果(Kaur等人.2011寄生虫免疫学33(2):95-103)。
[0011]近年，为对抗不同种类的利什曼虫，疫苗含有灭活的完整寄生虫和/或改良后的抗原及其片段。在对这些和重组体一样纯化的疫苗进行试验后，得出了不同的结果。因此，根据我们的数据，直到目前为止，之前的试验在人用或犬用疫苗上都没有取得完全的成功。尽管现时使用的化学疗法在许多病例中显示出一定的疗效，但它无法产生出足够完全控制和消除疾病的寄生虫清除率。
[0012]5年前，对PFRl蛋白的A*0201分子限制T细胞结合表位进行了识别，以及生成了由婴儿利什曼虫PFRl蛋白或其片段编码序列形成的嵌合分子(DNA疫苗)。其中PFRl蛋白作为载体分子，独立使用或与HSP70蛋白和/或其片段产物相关。此外，还在接种小鼠中研究相关嵌合分子引起的PFRl特异免疫反应。
[0013]在文献记载中，之前的试验并不建议使用从克氏锥虫PFR蛋白分离的肽诱发CTL反应。特别是Wrightsman R.A.等人于2002年发表的文章中，提到对多种从克氏锥虫PFR蛋白分离的肽进行试验，并评估这些肽在I类-MHC的环境中，和在该寄生虫人工感染的过程中是否能被有效处理和呈现，以及它们是否能被接种动物的细胞毒性T细胞(CTLs)识别(Wrightsman等人.2002寄生虫免疫学24(8):401-12)。在该研究中，确认了 PFRl表位可以结合鼠类的I类HLA分子(H-2Kb和H-2Db)，但作者认为小鼠接种PFRl或PFR3蛋白无法使CTLs杀伤这些蛋白或杀伤所识别的肽。
[0014]因此，就当前发展水平的资料看来，目前需要证实婴儿利什曼虫PFRl抗原蛋白编码序列所形成嵌合分子的有效性(DNA和/或重组疫苗)。PFRl蛋白含有特殊的表位，独立使用或和HSP70蛋白和/或其片段相关时，都能作为载体分子诱导CTL反应。同时，还必须测试其作为抗利什曼虫感染的预防和治疗疫苗，对人类和犬类的有效性和安全性。`
【发明内容】
[0015]本发明是对抗动物和人类利什曼病的有用工具。它是以含一系列肽的婴儿利什曼虫PFRl蛋白或其片段的编码核苷酸序列(单独使用或连同克氏锥虫的Hsp70蛋白)以及含有其基因编码序列的质粒为基础。这些肽存在于婴儿利什曼虫的PFRl蛋白中，通过作为免疫原性介质的PFRl蛋白的诱导，CD8+T淋巴球将其作为免疫显性表位识别后显示出细胞毒性。人类HLA-A*0201会优先表达被识别的表位。通过这些基因和蛋白分子，本发明为宿主对抗原虫性寄生虫提供细胞和体液免疫反应，可以有效控制或预防利什曼虫感染。本发明所涉及的分子作为预防医疗以及治疗药物，可以单独使用或结合抗病毒化学疗法，在对抗利什曼病的免疫疗法中发挥作用。在单独使用的情况下，且开发更多传统的治疗药物存在许多困难和不便时，这些分子的使用呈现出一种产业优势。尽管药物治疗在大多数病例中存在一定疗效，但主要缺点包括:在其他许多病例中(特别是犬类)无法彻底清除寄生虫、整个治疗非常昂贵、存在许多副作用、且耐药性病例的发生率正不断上升。
[0016]本发明主张一种独立核苷酸序列的所有权。该核苷酸序列的特点是编码婴儿利什曼虫的PFRl蛋白或其片段。该PFRl蛋白或其片段含有至少一个以下基因组中的特定优势免疫表位:SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ IDNo:6, SEQ ID No:7和SEQ ID No:8，该优势免疫表位可以诱导动物T细胞的抗原特异性细胞毒性免疫反应，对抗动质体所引起的利什曼病。优势免疫表位是具细胞毒性的T淋巴细胞的活化因子，他们对A2型I类MHC分子具有高度的结合亲和力。
[0017]在本发明中，“优势免疫表位”是指可以被淋巴细胞受体识别，且可以产生表位特异性细胞免疫反应的肽片段。
[0018]在本发明的优选方案中，“动物”可以是人类或宠物，更多的时候是指犬类。
[0019]在本发明的优选方案中，“核苷酸序列”是指任何含有DNA的核算序列，特别是基因组DNA、人工合成DNA、RNA、体外转录RNA、信使RNA、正义或反义序列。因此，本发明不考虑这些序列的获得条件，发明包含从克隆、化学合成、或酶促过程得到的生物样本中所获取的序列。
[0020]在本发明的优选方案中，“编码蛋白或其片段的核苷酸序列”是指核苷酸序列在相关调控元件(启动子、增强子、转录位点等)对其表达具有充分控制的情况下，可以转录或转译所需蛋白或其片段的一个氨基酸序列。在本发明中，所需蛋白及其片段以它们的氨基酸序列为特征，也可以以它们的细胞、成熟过程以及表达时存在的环境条件为特征。
[0021]在本发明的优选方案中，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、蛋白或这三种物质片段的序列，可以是天然产生或人工合成。由于本发明涉及到核苷酸序列编码的序列，该术语不仅限于完整的氨基酸序列或与上述蛋白分子相关的天然氨基酸序列，还指带有这些天然氨基酸序列的变种。
[0022]在一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的核苷酸序列所有权。即编码由SEQID No:12决定的，婴儿利什曼虫PFRl蛋白的1-595氨基酸。该片段编码完整的蛋白。
[0023]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的核苷酸序列所有权。即编码由SEQ ID No:9决定的，婴儿利什曼虫PFRl蛋白的160-595氨基酸。
[0024]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的核苷酸序列所有权。即编码由SEQ ID No:10决定的，婴儿利什曼虫PFRl蛋白的160-548氨基酸。
[0025]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的核苷酸序列所有权。即编码由SEQ ID No:11决定的，婴儿利什曼虫PFRl蛋白的160-385氨基酸。
[0026]本发明还要求保护一种嵌合分子，成分如下:
[0027](a)最好融合到其中的上述定义的核苷酸序列
[0028](b)编码克氏锥虫Hsp70蛋白或其片段的核苷酸序列；
[0029]该嵌合分子可以诱导T细胞的抗原特异性细胞毒性免疫反应，对抗动质体引起的利什曼病。
[0030]在本发明的优选方案中，“嵌合分子”是指含有来自两个不同物种的核苷酸序列的DNA分子，特别是指来自婴儿利什曼虫和克氏锥虫的物种。
[0031]在一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的嵌合分子所有权。该分子携带由SEQ ID No:13所决定，编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列，或带载体活体的HSP70片段。
[0032] 在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的嵌合分子所有权。该分子合并在对应160到595氨基酸的PFRl蛋白基因编码片段的3’末端(以SEQ ID No:9为特征的)，以及编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13决定)或带载体活体的HSP70片段。
[0033]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的嵌合分子所有权。该分子合并在对应160到548氨基酸的PFRl蛋白基因编码片段的3’末端(以SEQ ID No:10为特征的)，以及编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13决定)或带载体活体的HSP70片段。
[0034]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义的嵌合分子所有权。该分子合并在对应160到365氨基酸的PFRl蛋白基因编码片段的3’末端(以SEQ ID No:11为特征的)，以及编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13决定)或带载体活体的HSP70片段。
[0035]在另一个具体实施方案中，本发明主张上述定义嵌合分子的所有权。并在基因编码片段的3’末端加上编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13决定)或带载体活体的HSP70片段。
[0036]本发明还主张一种重组体或表达载体的所有权，它包含:
[0037](a)上述定义的核苷酸序列，或
[0038](b)上述定义的嵌合分子。
[0039]本发明还主张含上述定义载体的一种重组质粒的所有权。
[0040]本发明的另一个实施方案主张一种成分，尤指药物或免疫原性成分的所有权。它包含:
[0041](a)上述定义的核苷酸序列，或
[0042](b)上述定义的嵌合分子。
[0043]本发明的另一个实施方案涉及上述药物或免疫原性成分用于治疗和/或预防导致利什曼病动质体感染。
[0044]本发明的另一个实施方案涉及一种用于治疗和/或预防动质体感染的预防或治疗疫苗的生产方法，该动质体会导致利什曼病。该生产方法使用上述药物或免疫原性成分。该使用或方案以包含如下阶段为特征:
[0045]a)确定所需编码序列，特别是对至少一个以上定义的核苷酸序列进行识别，
[0046]b)使用来自导致利什曼病的动质体的基因组DNA，通过PCR扩增至少一种a)中定义的核苷酸序列，以及含有限制性内切酶位点的寡核苷酸。后者的限制性内切酶位点被这些内切酶消解后，可以让扩增子直接克隆到原核和真核表达载体中，
[0047]c)克隆至少一种在b)中扩增的核苷酸序列，用于产生由该核苷酸序列编码的蛋白，
[0048]d)通过亲和层析法纯化至少一种在c)中获得的蛋白，即重组蛋白(嵌合体或非嵌合体)，和
[0049]e)产生至少一种无内毒素的DNA载体，用于一种预防或治疗疫苗的安全接种。该疫苗用于治疗和/或预防导致利什曼病的动质体感染。
[0050] 本发明的另一个实施方案涉及上述定义的核苷酸序列、嵌合分子、重组体载体、重组质粒、或药物或免疫原性成分的使用。[0051]较明确的说法是，本发明涉及使用上述定义的核苷酸序列、嵌合分子、重组体载体、重组质粒、或药物或免疫原性成分生成保护性免疫记忆，为未受导致利什曼病的动质体感染的动物对抗感染。
[0052]最为确切的说法是，本发明提供使用上述定义的核苷酸序列、嵌合分子、重组体载体、重组质粒、或药物或免疫原性成分，为未受导致利什曼病的动质体感染的动物部分或完全净化或清除动质体。
[0053]本发明在免疫疗法方面主要有两个明确的选择一作为预防疫苗以及将其用于免疫疗法对抗利什曼虫的感染。同样地，本发明所涉及的分子/产物可以重组蛋白形式使用，即作为DNA质粒(基因疫苗)，或以结合形式使用。
[0054]因此，所提供产品的第一个应用是通过这些分子生成保护性免疫记忆，以对抗上述原生动物寄生虫在人类或犬类中所引起的感染，使流行地区的疾病得到控制(疫苗)。另一个应用是将这些分子作为免疫治疗药物用于已受感染的个体，以加强宿主的免疫反应，以对抗并控制寄生虫。可以单独使用该治疗方法，也可以结合其它现有的化学疗法，提高寄生虫的整体清除率。如此一来,就能激活和调节宿主对抗寄生虫的免疫反应,特别是通过诱导T细胞毒性抗原特异性反应，免疫系统可以消灭大部分化学治疗药物无法根治的组织内寄生虫，如骨髓或脾脏内的寄生虫。
[0055]整个说明书和权利要求中的词语“包含”及其变格不排除其它技术特征、添加剂、成分或步骤。该领域的专家、其它对象、本发明表现出的优点和特点都是该说明的一部分，也是本发明实践的一部分。以下的图形和例子用于说明本发明，而非用于限制本发明的应用范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1.纯化的PFR-1重组蛋白是在10%的SDSPAGE胶中进行电泳，并通过马斯亮蓝染色法显色。丽.蛋白分子。`
[0057]分子量标志。
[0058]图2.测定巨噬细胞培养上清液中的一氧化氮(NO)浓度。该巨噬细胞培养物经脂多糖(LPS)刺激；脂多糖+多粘菌素B(LPS+PolB);纯化的PFR-1蛋白(PFR-1);纯化的PFR-1蛋白+多粘菌素B(PFRl+PolB) ;L_单甲基柠檬酸精氨酸(LNMMA);纯化的PFR-1蛋白+L-单甲基柠檬酸精氨酸(PFR1+LNMMA)。浓度单位为ymol/升。
[0059]图3.对经pCMV4空白载体(通道2)和pCMV4PFRl (通道3)转染的C0S-7细胞所表达的PFR-1和PFR1-Hsp70蛋白进行蛋白质印迹分析；pCMV4PFRl-Hsp70 (通道4)和pCMV4PFRl-Th70(通道5)的构建。没用使用转染细胞作为对照(通道I)。蛋白分子量标志(通道6)。抗LiPFRl的多克隆抗体(A组)、TcHsp70 (B和C组)。
[0060]图4.A组。来自于接种生理盐水，以及接种pCMV4PFR-l和pCMV4PFRlHsp70载体的小鼠，第四次接种后的第14天(灰色条)和第40天(黑色条)血清中抗PFR-1重组蛋白的IgG抗体水平。B组。在A组小鼠(第4次接种后的第14和40天)中检测到的PFR-1重组蛋白特异性IgGl (灰色条)和IgG2a(黑色条)抗体的水平。条形代表每组光密度的平均值。
[0061]图5.C57BL/6小鼠接种生理盐水(SS)、pCMV4质粒(pCMV4)或接种PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)重组载体，经婴儿利什曼虫感染性前鞭毛体激发14和21天后，血清中的抗利什曼虫可溶性抗原(SLA、A、B25和C组)和PFRl重组蛋白(D组)的抗体水平。
[0062]图6.接种生理盐水(SS)和pCMV4空白载体(pCMV4)以及接种pCMV4PFR_l (PFRl)、pCMV4接PFR-1-Hsp70 (70c)和pCMV4PFR_l截短型Hsp70 (70t)小鼠的淋巴增殖性反应。刺激指数的计算方法是[(cpm(刺激培养物)算术均数_cpm(对照培养物)算术均数)/cpm算术均数]。结果代表3个独立免疫实验的平均值和标准偏差。
[0063]图7.C57BL/6小鼠接种生理盐水(SS)和pCMV4空白载体(pCMV4)以及接种PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)，经婴儿利什曼虫激发后，应对脂多糖(LPS)、培养基(Medium)、利什曼虫可溶性抗原(SLA)和PFRl重组蛋白的腹膜巨噬细胞所产生的一氧化氮(NO)。
[0064]图8.小鼠接种生理盐水(SS)和pCMV4空白载体(pCMV4)以及接种PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)，经婴儿利什曼虫感染性前鞭毛体激发14和21天后，脾脏、肝脏和骨髓的寄生虫负载量。
[0065]图9.HLA*02:01限制型PFRl衍生肽与TAP缺失型T2细胞的结合测定。配合物最大稳定性的计算是以HB-ENV334 - 342肽荧光指数为参照物。在每种肽的不同浓度下测定每种肽的集合。
[0066]图10.B6-A2/KL.小鼠接种生理盐水(SS)或接种pCMV4PFRl (PFRl)或CMV4PFR1-Hsp70 (PFR1-HSP70)重组载体后，通过脾细胞中ELISP0T分泌的GzB，评估8种选定PFRl肽的⑶8+T淋巴球特异性细胞毒活性。通过KS ELISP0T设备(Zeiss)可以看见斑点。只讲边界模糊的大斑点作为斑点形成细胞(SFC)进行评分。假如(i)在减去阴性对照(不含肽的脾细胞)后，检测到至少150SFC/106个脾细胞，以及(ii)反应至少为阴性对照的两倍，则认为反应是显著的。
[0067]图11.B6-A2/KL.小鼠`感染利什曼虫感染性前鞭毛体后，通过脾细胞中ELISP0T分泌的GzB，评估8种选定PFRl肽的⑶8+T淋巴球特异性细胞毒活性。通过KS ELI SPOT设备(Zeiss)可以看见斑点。只讲边界模糊的大斑点作为斑点形成细胞(SFC)进行评分。假如
(i)在减去阴性对照(不含肽的脾细胞)后，检测到至少250SFC/106个脾细胞，以及(ii)反应至少为阴性对照的两倍，则认为反应是显著的。
[0068]图12.B6-A2/KL.小鼠感染利什曼虫感染性前鞭毛体后，通过脾细胞中ELISP0T分泌的GzB，评估8种选定PFRl肽的CD8+T淋巴球特异性细胞毒活性。使用未接种动物作为对照。通过KS ELISP0T设备(Zeiss)可以看见斑点。只讲边界模糊的大斑点作为斑点形成细胞(SFC)进行评分。假如(i)在减去阴性对照(不含肽的脾细胞)后，检测到至少75SFC/106个脾细胞，以及(ii)反应至少为阴性对照的两倍，则认为反应是显著的。
[0069]图13.通过 3 种 HLA-A2-结合亲和性算法-SYPFEI TH I (http://www.syfpeith1.de)、RANKPEP(http://immunax.dfc1.harvard.edu/Tools/rankpep.html)和 BIMAS(理论
半离解期，www.bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)-对推导的 PFRl 基因氨基酸序
列进，以预测婴儿利什曼虫PFRl蛋白中的潜在HLA-A*02:01配体。
[0070]图14.A 组。小鼠第 4 次接种生理盐水、pCMV4436aaPFRl 和 pCMV4436aaPFRlHsp70载体后的第14天(黑色条)和第40天(灰色条)，血清中抗PFRl重组蛋白的IgG抗体水平。B组。在A组小鼠(第4次接种后的第14天和第40天)中所检测到的PFRl重组蛋白特异性IgGl (黑色条)和IgG2a(灰色条)抗体水平。条形代表每组光密度的平均值。
[0071]图15.接种生理盐水(SS)或接种 pCMV4436aaPFRl(436aaPFRl)和 pCMV4436aaPFR1-HSP70 (436aa PFR1HSP70)小鼠的淋巴增殖性反应。刺激指数的计算方法是[(cpm(刺激培养物)算术均数-cpm (对照培养物)算术均数)/cpm算术均数]。结果代表3个独立免疫实验的平均值和标准偏差。
[0072]图16.B6-A2/KL.小鼠接种生理盐水(SS)或接种 pCMV4436aaPFRl 或 pCMV4436aaPFR1-Hsp70重组载体后，通过脾细胞中ELISP0T分泌的GzB，评估8种选定PFRl肽的CD8+T淋巴球特异性细胞毒活性。通过KS ELISP0T设备(Zeiss)可以看见斑点。只讲边界模糊的大斑点作为斑点形成细胞(SFC)进行评分。假如(i)在减去阴性对照(不含肽的脾细胞)后，检测到至少150SFC/106个脾细胞，以及(ii)反应至少为阴性对照的两倍，则认为反应是显著的。
[0073]参考文献
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【具体实施方式】
[0107]本说明书提供以下具体实例用于说明本发明的性质。这些例子仅用于说明，不应被解读为对本发明的限制。因此，以下例子用于说明本发明，但不限制本发明在相同领域的应用。
[0108]实施例1
[0109]1.1.PFRl蛋白诱导一氧化氮(NO)的表达。
[0110]PFRl蛋白属于来自动质体副鞭毛杆蛋白的特异蛋白家族。在图1中，我们展示了婴儿利什曼虫PFRl重组蛋白在原核表达系统中的表达，以及通过亲和层析法进行的纯化。我们确定该蛋白具有激活一氧化氮(NO)生成的能力，这是巨噬细胞消除病原体的主要机制之一，可以消除首次受试小鼠肺泡巨噬细胞所吞噬的病原体，即无需治疗且以往未感染。一氧化氮产物的这种活化作用给予上述蛋白相关免疫特性，因为NO有助于清除宿主巨噬细胞中繁殖的利什曼虫的无鞭毛体。在图2中，使用LPS(对照)和PFRl蛋白刺激这些肺泡巨噬细胞，以获取其产生的NO数值。有趣的是，和PFRl蛋白不同，LPS诱导的活化作用被多粘菌素B(LPS诱导活化作用的抑制剂)抑制。多粘菌素B会去掉PFRl重组蛋白中任何来自LPS的污染。另一方面，加入L-单甲基柠檬酸精氨酸(LNMMA)后，PFRl蛋白诱导的NO活化作用会被抑制，表明了这种蛋白的作用机制。该结果和PFR1-HSP70融合蛋白的结果相似。其中，L-单甲基柠檬酸精氨酸(LNMMA)是一种一氧化氮合酶抑制剂。
[0111]1.2.PFRl蛋白在真核细胞中的表达。
[0112]通过分析携带编码PFRl蛋白和克隆到pCMV4质粒的HSP70-PFR1和PFR1-H70T嵌合融合蛋白基因的C0S-7转染细胞，在真核细胞中测定这些蛋白的正确表达。通过对上述各种质粒转染和诱导PFRl蛋白多克隆抗体的细胞提取物进行蛋白印迹分析。因此，在图3中可以分别看到代表70kDa (对应pCMV4PFRl细胞通道中的PFRl蛋白)、pCMV4PFRl_Hsp70质粒转染C0S-7cells细胞通道中的140kDa、以及pCMV4PFRl_Hsp70T质粒细胞通道中的96kDa识别带。不检测含有空白PCMV4质粒的细胞。
[0113]1.3受试分子诱导的抗原特异性体液反应。
[0114] 如例子所示，使用100 μ g的不同研究质粒和阴性对照(空白质粒和生理盐水)，对12只C57BL/6AS系小鼠分组进行肌内注射接种，然后获取结果。每只小鼠接种4次，每两周一次。第4次接种六周后，对每组的6只小鼠静脉注射JPCM5 (MCAN/s/98/LLM-724)系婴儿利什曼虫105感染性前鞭毛体进行激发。
[0115]为分析不同组别小鼠所产生的液体反应，每次接种2周后都会采集血样并测定特异性抗体。所获得的结果显示，单独接种PFRl基因的小鼠在第2次接种15天后会出现抗-PFRlIgG抗体，而接种HSP70-PFR1或PFR1-HSP70T融合基因的小鼠则在第3次接种2周后出现。图4展示了每种分子在第四次接种后第14天和第40天的结果。小鼠接种融合HSP70基因的PFRl基因后血清中的IgG水平高于接种独立PFRl基因的小鼠，峰值在第4次接种后的2周内。该同型分析显示产生的抗体在对IgG2a同型(Thl型免疫反应)的反应上出现明显的两极分化。在PPFR1-H70T分子中获得相似的结果。
[0116]图5给出了 PFRl蛋白体液反应试验的结果，以及小鼠接种所研究分子并经婴儿利什曼虫激发后的利什曼虫(SLA)总抗原数。对这些结果的分析显示利什曼虫感染不会导致抗PFRl的IgG水平出现显著变化，且在感染前观察到对于IgG2a同型存在相同的两极化结果O
[0117]1.4研究分子诱导的抗原特异性细胞反应。
[0118]在第四次接种的3周后，进行了淋巴细胞增殖试验。在无菌条件下提取脾细胞，并在浓度渐增的PFRl重组蛋白中(0.4、2和10 μ g/ml)，对所获得的脾细胞进行体外培养。此外，在该试验中，分别将一种有丝分裂原(ConA)和未受刺激的脾细胞作为阳性和阴性对照。如图6所示，在所获得的结果中，当重组PFRl存在时可以观察到显著的细胞增殖率。此外，在接种重组试验蛋白小鼠的脾细胞中，该刺激是剂量依赖性的。有趣的是，接种HSP70和HSP70T融合PFRl基因组别的该指数显著较高。接种这些融合分子的小鼠的脾细胞增殖率(IE)约为25，而小鼠接种仅含PFRl基因的质粒后，脾细胞的测量指数约为20。两个例子的数值都高于对照；接种空白质粒小鼠的IE = 13，而接种生理盐水小鼠的IE = 4。在第4次接种的8周后，接种受试分子小鼠的脾细胞增殖率维持相似的数值。此外，激发后的刺激能力保持不变，提示该数值是小鼠接种独立PFRl基因并经2 μ g/ml PFRl重组蛋白刺激后的最大增殖率(细胞反应)。
[0119]1.5小鼠接种和感染婴儿利什曼虫后，一氧化氮(NO)的表达。
[0120]如图7所示，与接种对照物的小鼠相比，无论是否经过刺激，接种受试分子，特别是融合蛋白(PFR1-HSP70或PFR1-HSP70T)小鼠的腹膜巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的能力较高。此外，经重组PFRl蛋白刺激后，上述接种组别小鼠的NO分泌能力显著增加。另一方面，与未经激发的小鼠相比，受感染小鼠会产生更多的NO。
[0121]1.6测定诱导抗婴儿利什曼虫感染的保护能力。
[0122]图8给出了感染14天和28天后，通过有限稀释分析肝脏、脾脏和骨髓(寄生虫目标组织)的寄生虫载量(Buffet等人，1995，抗菌物和化学疗法39 (9): 2167-2168)的结果总结。感染14天后，所有组别小鼠的肝脏都有寄生虫，但对照组(ss和pCMV4)的寄生虫载量明显高于接种了不同受试分子的组别，显示数值至少高一个量级。此外，和对照组不同，接种受试分子的小鼠肝脏寄生虫载量在感染28天后没有增加。事实上，接种完整HSP70基因(pPFRl-HSP70)融合PFRl基因的小鼠显示出较大的肝脏寄生虫清除率。分析脾脏寄生虫载量后，得出相似的结果。感染14天后，与接种小鼠相比，在对照小鼠(ss和pCMV4)脾脏组织观察到的寄生虫载量显著较高(至少高一个量级)。事实上，感染2周后，接种了 HSP70T基因(pPFRl-H70T)融合PFRl基因的小鼠脾脏没有寄生虫存在。至于骨髓方面，进对照组(ss和PCMV4)存在寄生虫，检测是在感染28天后进行。有趣的是，经过接种的小鼠该组织内都没有寄生虫。总之，在感染期间，所有分析组别在被分析组织中的寄生虫载量都显著低于对照组别(减少值在2到4个量级之间)，显示静脉注射这些分子能提供高水平的抗婴儿利什曼虫保护。
[0123]对接种小鼠和对照组别脾细胞的细胞因子表达模式进行对比(使用小鼠Thl/Th2细胞因子CBA - BD生物科学试剂盒，测量细胞培养上清液中的血细胞计数)，显示与对照组相比，接种PFR1-HSP70和PFR1-H70T嵌合物的小鼠，经rPFRl和/或SLA刺激后或未经刺激时，存在具统计学显著性的较高水平TNF- α和IFN- y (Ρ〈0.01)。但是，在IL-2或IL-4水平方面，各个组别之间不存在具统计学显著性的差异。同样地，在利什曼虫激发后，通过测量⑶80、⑶86和⑶40表面分子的表达模式，对所有小鼠组别(试验组和对照组)的脾脏巨噬细胞活化水平进行分析。结果显示，感染21天后，与对照组相比，接种PFR1-HSP70和PFR1-H70T嵌合物组别的⑶86和⑶40的表达明显较高(P〈0.01)。
[0124]1.7确定婴儿利什曼虫PFRl蛋白中的T⑶8+表位。
[0125]可以通过⑶8+T细胞的识别作用，确定婴儿利什曼虫PFRl蛋白序列的表位。作为宿主细胞毒性抗原特异性反应激活的结果，希望通过T CD8+表位的确认，找到可以结合HLA-A*0201的表位(在半数人类种群中有表达)。所使用的三个程序是:SYFPEITH1、RANKPEP和BIMAS。将所推导出的婴儿利什曼虫PFRl蛋白序列(基因号:AY702344)导入到每个程序中，然后选择与HLA-A*0201结合的算法。头两个程序按照每种肽与HLA分子的理论亲和力，分别对其进行评分。另一方面，BIMAS关注的是理论结合时间，对肽与HLA分子的结合稳定性进行评分。综合这些结果，选取了 8种在理论上与I类HLA分子有高度结合亲和力的表位，并合成相对应的肽=SEQ ID No: 1-1864(FMDIIGVKKV),SEQ ID No:2-1865 (QLDATQLAQV)、SEQ ID No:3-1866 (KLLELTVYNC)、SEQ ID No:4-1868 (KMMEDIMNA), SEQ ID No:5-1869 (AMHDGETQV)、SEQ ID No:6-1871 (QLQERLIEL) SEQID No:7-1872 (MLYLTLGSL)和 SEQ ID No:8-1873 (KMVEYKSHL)。图 13、表 I 和表 2 给出了不同肽在上述软件中的分数。
[0126]为测定与HLA_A*0201分子的结合能力，对表达能力较低的抗原转运分子T2进行了结合试验。结果如图9所示，显示所有受试肽对HLA-A*0201分子都有较好或非常好的结合亲和力，在某些试验中，表现出比对`照物HB-ENV334_242肽更好的亲和力。HB-ENV334_242肽的预期结合百分比是100%。
[0127]在肌内注射接种pPFRl和pPFRl-HSP70分子的C57BL/6_A2/Kb转基因小鼠中(对它们的嵌合基因HLA-A2.1/Kb产物的表达进行了修改，其α I和α 2域与人HLA_A*0201分子相同，而α 3域的穿膜穿质机制都与鼠H_2Kb分子相对应)，在试验性免疫的环境下，对这些表位的有效表达能力进行分析。用注射生理盐水(Sigma)的小鼠做阴性对照。第4次免疫的6周后，在ELISP0T试验环境中，以抗颗粒酶B抗体做探针，使用受试肽对不同组别的小鼠进行刺激。所获得的结果(图10)显示，在接种嵌合分子PPFR1-HSP70的小鼠中，有5种肽对颗粒酶B (CTLs特异性抗原的活化作用)呈阳性反应，而在接种仅含PFRl基因的分子的小鼠中，有I种肽对呈阳性反应。这些结果表明，以上分子在I类-MHC环境中可以有效加工和表达。此外，这些结果还表明，这些获得阳性反应的肽可以被接种小鼠的细胞毒性T淋巴球(CTLs)识别。
[0128]通过静脉注射IO6婴儿利什曼虫(JPCM5系)感染性前鞭毛体，对C57BL/6_A2/Kb转基因小鼠进行试验性感染后，评估在该过程中小鼠产生细胞毒性反应的能力。感染170天后，杀死受感染小鼠，取出它们的脾细胞或非实质性的肝细胞，在ELISP0T试验环境下暴露于受试肽，并使用颗粒酶B做探测抗体。结果显示(图11和12)，4种受试肽在脾细胞中对颗粒酶B呈阳性反应，3种受试肽在非实质性的肝细胞中也呈阳性反应。因此，在寄生虫的试验性感染过程中，这些肽出现在CTLs中。有趣的是，这四种肽中只有一种在接种小鼠中也呈阳性反应，显示抗原表达在质粒免疫接种和试验性感染过程中存在不同。
[0129]结论
[0130]例I结论:结果显示小鼠在接种受试分子并激发后，骨髓中没有出现寄生虫。而接种PCMV4空白质粒或生理盐水(对照)的组别在感染28天后，同一组织出现高寄生虫载量。此外，接种小鼠脾脏和肝脏的寄生虫载量比对照组别(空白PCMV4质粒或生理盐水)低2到4个量级。小鼠接种PPFR1-H70T分子并被利什曼虫感染14天后，脾脏没有出现寄生虫。
[0131]实施例2
[0132]2.1抗原特异性体液反应。
[0133]如例所示，结果来自于肌内注射接种100 μ g不同受试质粒以及阴性对照(注射生理盐水的小鼠)的C57BL/6系小鼠(12只)。在该例子中，受试质粒含有与婴儿利什曼虫PFRl蛋白片段(氨基酸长度436)相对应的序列。该片段由PFRl蛋白160到595的氨基酸组成。每只小鼠接种4次，每两周一次。
[0134]为分析不同组别小鼠生成的体液反应，接种两周后采集了小鼠的血液，并测量了动物血清中的抗体水平。结果显示，接种仅含436aaPFRl基因的小鼠在第四次接种的15天后，出现抗PFRlIgG抗体；而接种携带融合436aaPFRl-HSP70基因的小鼠，在第三次接种的2周后出现该抗体。图14(A)展示了每种受试分子在第14天和第40天的结果。与接种436aaPFRl基因融合HSP70基因的小鼠相比，接种仅含436aaPFRl基因的小鼠IgG水平较低。抗体的最大值出现在第4次接种后的2周内。在所有案例中，抗PFRl抗体水平在第四次注射的6周后显著下降。同型分析`(B)显示，抗体中的IgG2a同型(Thl型免疫反应)反应呈现两极分化。
[0135]2.2抗原特异性细胞反应
[0136]在第四次接种3周后，进行了淋巴细胞增殖试验。在无菌条件下对脾脏进行提取，并将获得的脾细胞在浓度渐增(0.4、2和10 μ g/ml)的rPFRl蛋白中进行体外培养。此外，分别将一种有丝分裂原(ConA)和未经刺激的脾细胞作为试验的阳性和阴性对照。图15给出了所获得的结果，当重组PFRl (rPFRl)存在时，可以观察到显著的细胞增殖率，此外，在接种重组试验分子的小鼠脾细胞中，该刺激是剂量依赖型的。有趣的是，该指数在接种HSP70和HSP70T融合PFRl基因的组别中明显较高。接种融合分子小鼠的脾细胞增殖率(IE)约为22，而对于接种仅含PFRl基因小鼠，所测得的脾细胞增殖率约为18。在两个案例中，都高于对照；生理盐水，IE = 4。在第四次接种8周后，接种受试分子小鼠的脾细胞增殖率维持在相似水平。
[0137]在肌内注射接种436aaPFRl 和 436aaPFRl_HSP70 分子的 C57BL/6_A2/Kb 转基因小鼠中(对它们的嵌合基因HLA-A2.Ι/Kb产物的表达进行了修改，其α?和α 2域与人HLA-A*0201分子相同，而α 3域的穿膜穿质机制都与鼠H_2Kb分子相对应)，在试验性免疫的环境下，对这些表位的有效表达能力进行分析。用注射生理盐水(Sigma)的小鼠做阴性对照。第4次免疫的6周后，在ELISP0T试验环境中，以抗颗粒酶B抗体做探针，使用受试肽对不同组别的小鼠进行刺激。所获得的结果(图16)显示，在接种嵌合分子436aaPFRl-HSP70的小鼠中，有5种肽对颗粒酶B(CTLs特异性抗原的活化作用)呈阳性反应，而在接种仅含436aaPFRl基因的分子的小鼠中，有I种肽对呈阳性反应。这些结果表明，以上分子在I类-MHC环境中可以有效加工和表达。此外，这些结果还表明，这些获得阳性反应的肽可以被接种小鼠的细胞毒性T淋巴球(CTLs)识别。
[0138]总结例2:结果显示PFRl蛋白的436氨基酸片段与完整的蛋白非常相似，拥有相似的免疫反应模式(体液、细胞和细胞毒性)。因此，由于这些参数涉及到抗寄生虫的保护作用，我们认为该片段在各个方面`都可以作为完整蛋白进行研究。
【权利要求】
1.一种用于编码婴儿利什曼虫及其片段PFRl蛋白的核苷酸序列，含有以下任一组中至少一个免疫显性表位:SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8，该免疫显性表位可以诱导动物T细胞的抗原特异性细胞毒性免疫反应，对抗引起利什曼病的动质体。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，编码婴儿利什曼虫PFRl蛋白1-595氨基酸是由SEQ ID No:12 决定。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，编码婴儿利什曼虫PFRl蛋白160-595氨基酸是由 SEQ ID No:9 决定。
4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，编码婴儿利什曼虫PFRl蛋白160-548氨基酸是由 SEQ ID No:10 决定。
5.根据权利要求1所述的核苷酸序列，编码婴儿利什曼虫PFRl蛋白160-385氨基酸是由 SEQ ID No:11 决定。
6.一种嵌合分子，包含: (a)权利要求1-5所述的核苷酸序列，融合到: (b)编码克氏锥虫Hsp70蛋白及其片段的核苷酸序列； 该嵌合分子可以诱导动物T细胞的抗原特异性细胞毒性免疫反应，对抗引起利什曼病的动质体。
7.根据权利要求6所述的嵌合分子，含有由SEQID No:13决定的编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序列或其片段。
8.—种重组载体，包含:` (a)权利要求1-5所述的核苷酸序列，或 (b)权利要求6-7所述的嵌合分子。
9.一种包含权利要求8所述的载体的重组质粒。
10.一种药物组合物，包含: (a)权利要求1-5所述的核苷酸序列，或 (b)权利要求6-7所述的嵌合分子。
11.根据权利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于治疗和/或预防导致动物换利什曼病的动质体感染。
12.根据权利要求11所述的权利要求1-5的核苷酸序列的用途，其中，所述动物是指人或犬。
13.根据权利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于生产治疗或预防疫苗。
14.根据权利要求13所述的生产治疗或预防疫苗的方法，包含以下步骤: (a)确定至少一种权利要求1-5所述的核苷酸序列， (b)使用来自导致利什曼病的动质体的基因组DNA，通过PCR扩增至少一种a)中定义的核苷酸序列，以及含有限制性内切酶位点的寡核苷酸。后者的限制性内切酶位点被这些内切酶消解后，可以让扩增子直接克隆到原核和真核表达载体中， (c)克隆至少一种在b)中扩增的核苷酸序列，用于产生由该核苷酸序列编码的蛋白， (d)通过亲和层析法纯化至少一种在c)中获得的蛋白，和 (e)产生至少一种无内毒素的DNA载体，用于预防或治疗疫苗的安全接种。
15.根据权利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于对照方法中，以测量引起动物利什曼病的动质体感染程度。
16.根据权利要求15所述的核苷酸序列的用途，其中，所述动物是指人或犬。
17.权利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用以生成抗导致未感染动物换利什曼病动质体感染的保护性免疫记忆。
18.根据权利要求17所述的核苷酸序列的用途，所述动物是指人或犬。
19.权利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于阐明或清除感染动物组织中的部分或全部会导致利什曼病的动质体。
20.根据 权利要求19所述的核苷酸序列的用途，所述动物是指人或犬。
【文档编号】A61K39/008GK103890004SQ201280045285
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年7月17日 优先权日:2011年7月21日
【发明者】玛丽亚·戴尔·卡门·托马斯·卡佐拉, 曼纽尔·卡洛斯·洛佩兹·洛佩兹, 达里安·莱德斯马·阿罗约 申请人:西班牙国家研究委员会