专利名称：一种新型抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米药物载体技术领域，特别涉及一种新型抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用。
背景技术：
癌症是人类生命健康的最大杀手，化学治疗是癌症治疗最重要的手段，然而多数化学治疗药物缺少特定到达肿瘤组织的能力，对肿瘤细胞缺乏选择杀伤作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也伤及正常细胞，特别是癌细胞因为给药处理产生耐药性，为了克服癌细胞的耐药性需要给予更高的抗癌药剂量，从而对正常细胞造成较大的副作用，甚至中断治疗；另一方面，多数抗肿瘤药物的功效由于其自身性质，如水溶性差、治疗窗口窄等也限制了肿瘤治疗的效果。从上世纪70年代开始，纳米载体作为化疗药物传递系统用于癌症治疗引起了人们的极大关注。用于药物传递系统的纳米粒子其粒径在10 lOOOnm，可以有多种材料构成，包括聚合物、脂质、病毒和有机金属复合物等。近年来，聚合物纳米制剂因为具有较好的理化性能而备受关注。聚合物胶束由双亲性的聚合物材料在水环境中自组装形成，是具有均一纳米级粒径及球形的核壳结构载体。其亲水性外壳可以增强胶束在水性生物介质的分散性和稳定性，并与生物介质相容，内核可包埋难溶性药物。特别是壳聚糖，由于其优良的细胞相容性、生物可降解性、生物粘附性、无毒性、无免疫原性、抗菌活性等优点，已被大量用于药物载体，传递蛋白、基因、药物等生物活性分子。因此，以壳聚糖为基础材料，对其进行疏水修饰，使其在水溶液中自组装形成胶束的药物载体被各国学者所研究。简单疏水修饰的壳聚糖形成的胶束虽然具有可降解，无毒，载药量高等优点，但是作为抗肿瘤药物载体，经静脉注射后，这样的纳米粒也很容易被体内的吞噬细胞当作外来异物识别而被吞噬，在人体内循环的时间不是足够的长，降低了生物利用率。另外，简单疏水修饰的壳聚糖胶束也不具有很强的靶向性，不能够与肿瘤细胞特异的结合，从而不能够有效降低抗癌药物对正常细胞的毒副作用。在本研究之前，虽然有研究者分别制备了具有靶向性和体内长循环性的疏水壳聚糖胶束，但同时满足以上要求的传递载体系却很少。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法。本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的新型抗肿瘤纳米药物载体。本发明的再一目的在于提供 所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤:(I)壳聚糖疏水改性:
将壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)按摩尔比1:40 1:162于25 40°C反应48 72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸(CS-DA)；(2)聚乙二醇(MPEG)修饰壳聚糖-脱氧胆酸:将步骤(I)制备的壳聚糖-脱氧胆酸和聚乙二醇溶于30 50ml 1%(ν/ν)醋酸溶液中，室温搅拌15 30min后加入甲醛，室温反应I 6h，纯化后得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇(CS-DA-MPEG)聚合物；其中聚乙二醇与壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为12:1 20:1，甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:2 1:4;(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰:将叶酸(FA)和步骤(2)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇按质量比1:1 2:1于35 40°C水浴中避光反应16 24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸(CS-DA-MPEG-FA)；(4)新型抗肿瘤纳米药物载体的制备:将步骤(3)制备的接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸I 2mg ；将混合液置于透析袋中透析后，将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到新型抗肿瘤纳米药物载体；步骤(I)中:所述的壳聚糖的分子量优选为50000 ；所述反应的条件优选25°C磁力搅拌48 72h ；
所述的反应优选在催化剂1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中进行；所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与脱氧胆酸的摩尔比优选为2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为3:1 ；所述的纯化优选采用以下方法进行:待反应结束时，向反应瓶中加入氨水，离心，弃去上清液，甲醇洗涤沉淀3 5次后透析7天，冷冻干燥，得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸；所述的冷冻干燥的条件为在-10°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h ；优选的，所述的壳聚糖疏水改性采用以下方法进行:将壳聚糖溶于1%(ν/ν)醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；将DA、EDC、NHS加入甲醇中活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，25°C磁力搅拌48 72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸；壳聚糖和脱氧胆酸的摩尔比为1:40 1:162 ;步骤(2)中:所述的聚乙二醇优选为甲氧基聚乙二醇；所述的甲氧基聚乙二醇的分子量优选为5000 ；所述的室温反应优选在二甲基亚砜(DMSO)中进行；所述的纯化优选采用以下方法进行:向反应瓶中加入50ml丙酮使反应物沉淀下来，弃去上清液将沉淀透析7天，冷冻干燥，得到聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇；所述的冷冻干燥的条件为在-10°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h ；步骤(3)中:
所述的避光反应优选在催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)中进行；所述的叶酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的质量比优选为1:1 ;所述的纯化优选采用以下方法进行:用氢氧化钠溶液将反应液的pH调至9后离心，弃去上清液将沉淀透析，冷冻干燥，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物；所述的透析的条件为在pH为7.4的PBS溶液中透析7天后在双蒸水中透析7天；所述的冷冻干燥的条件为在-10°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h ；优选的，所述的接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰采用以下方法进行:将壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇溶于1%(ν/ν)醋酸溶液中，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液；将叶酸溶解于DMSO中，加入0.3g EDC后避光搅拌lh，得到混合液，将混合液在30分钟内滴加到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液中，于35 40°C水浴中避光搅拌反应16 24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸；叶酸和壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的质量比为1:1 2:1 ;步骤(4)中:所述的醋酸溶液优选为1%(ν/ν)醋酸水溶液；优选的，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸Img ；所述的透析优选为去离子水透析；所述的透析袋截留分子量为10000 ；所述的透析优选按照以下方法进行:先用生理盐水透析24h，然后用双蒸水透析24h，其中前3h每Ih换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水；所述的冷冻干燥按照以下方法进行:在-10 -20°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干12 24h，优选在-10°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h ；—种新型抗肿瘤纳米药物载体，由上述制备方法得到；所述的新型抗肿瘤纳米药物载体可应用于输送多种治疗肿瘤的化疗药物，如阿霉素、紫杉醇、喜树碱等。本发明的发明机理如图5所示。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明通过壳聚糖和脱氧胆酸进行酰胺化反应形成共聚物壳聚糖-脱氧胆酸，壳聚糖-脱氧胆酸和甲醛形成希夫碱中间体后与聚乙二醇反应，得到的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇与叶酸发生酰胺化反应而制备新型抗肿瘤纳米药物载体。制备得到的新型抗肿瘤纳米药物载体对药物的包载为非化学键结合，通过脱氧胆酸的疏水作用形成疏水微区，壳聚糖亲水骨架盘绕在疏水微区的外面形成亲水性外壳，使其在水溶液中具有最低的表面能，此外，在紧密的壳聚糖骨架间存在分子间和分子内氢键，进一步促进胶束的形成，这种独特的超分子结构很适合捕获疏水药物，从而增加小分子疏水药物的溶解，而连接到壳聚糖外壳上的聚乙二醇和叶酸分别起到了隐形和主动靶向的作用。亲水性强的聚乙二醇能够在纳米粒表面形成一层或者 多层保护性的亲水衣膜，可阻碍调理作用，聚乙二醇自身的高分子链可以自由摆动，具有较高的柔韧性，对普通纳米粒能够起到更强的立体保护作用，避免被吞噬细胞快速吞噬，从而使该纳米粒子具备更长的血浆半衰期；叶酸体积小，被认为无免疫原性，并且稳定性高。利用肿瘤细胞表面叶酸受体高表达而正常组织很少有叶酸受体过分表达的特点，接有叶酸分子的新型抗肿瘤纳米药物载体与肿瘤细胞有更强的亲和力，使得新型抗肿瘤纳米药物载体同时又具备了主动靶向的特性，克服了普通纳米粒功能比较单一的缺点。该新型抗肿瘤纳米药物载体能够很好的避开吞噬细胞的吞噬，有利于在体内长期循环而不被清除，主动靶向修饰能够更好的与肿瘤细胞特异性结合，减少了药物对人体正常细胞的损害。
图1是实施例1中不同接枝聚合物的红外谱图，其中:a为CS-DA-MPEG-FA的红外谱图，b为CS-DA-MPEG红外谱图，c为CS-DA红外谱图，d为CS红外谱图。图2是实施例1中不同接枝聚合物的核磁氢谱图，其中:a为CS_DA_MPEG_FA的核磁氢谱图，b为CS-DA-MPEG的核磁氢谱图，c为CS-DA的核磁氢谱图，d为CS的核磁氢谱图，e为MPEG的核磁氢普图，f为FA的核磁氢普图。图3是实施例1的壳聚糖-脱氧胆酸-乙二醇-叶酸纳米粒的透射电镜扫描图。图4是效果实施例的壳聚糖-脱氧胆酸-乙二醇-叶酸纳米粒载阿霉素的体外累积释放曲线图，其中:a为载阿霉素纳米粒子在pH5.7的醋酸钠缓冲溶液中的体外累积释放曲线；b为载阿霉素纳米粒子在pH7.4的PBS缓冲溶液中的体外累积释放曲线。图5是本发明的反应机理图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(I)壳聚糖疏水改性:称取1.0g壳聚糖于反应瓶中，加入IOOml的1%(ν/ν)醋酸水溶液将其溶解，得到壳聚糖醋酸溶液；将0.3180g DA (壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)摩尔比为l:40)、0.6211gEDC、0.1243g NHS加入到另一烧杯中，加入200ml甲醇活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌，25°C反应48h，待反应结束时，向反应瓶中加入60ml氨水,将反应物转移至离心管中离心10分钟(转速5000r/min),弃去上清液,40ml甲醇洗涤沉淀3次，然后将沉淀转移到透析袋(透析袋截留分子量为10000，下同。)中透析7天，冷冻干燥(在-10°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸，其反应方程式为:
权利要求
1.一种新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)壳聚糖疏水改性:将壳聚糖和脱氧胆酸按摩尔比1:40 1:162于25 40°C反应48 72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸； (2)聚乙二醇修饰壳聚糖-脱氧胆酸:将步骤(I)制备的壳聚糖-脱氧胆酸和聚乙二醇溶于30 50ml 1%醋酸溶液中，室温搅拌15 30min后加入甲醛，室温反应I 6h，纯化后得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物；聚乙二醇与壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为12:1 20:1，甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:2 1:4 ; (3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰:将叶酸和步骤(2)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇按质量比1:1 2:1于35 40°C水浴中避光反应16 24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸； (4)新型抗肿瘤纳米药物载体的制备:将步骤(3)制备的接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸I 2mg ;将混合液置于透析袋中透析后，将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到新型抗肿瘤纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述反应的条件为25°C磁力搅拌48 72h。
3.根据权利要求1所述的 新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的壳聚糖的分子量为50000。
4.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的反应在催化剂1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中进行；所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与脱氧胆酸的摩尔比为2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为3:1。
5.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇；所述的室温反应在二甲基亚砜中进行。
6.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的避光反应在催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺中进行；所述的叶酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的质量比为1:1。
7.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(4)中所述的透析按照以下方法进行:先用生理盐水透析24h，然后用双蒸水透析24h，其中前3h每Ih换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水。
8.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于:步骤(4)中所述的冷冻干燥按照以下方法进行:在-10 _20°C冷冻过夜后置于冻干机中冻干12 24h。
9.一种新型抗肿瘤纳米药物载体，由权利要求1 8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的新型抗肿瘤纳米药物载体应用于输送治疗肿瘤的化疗药物。
全文摘要
本发明公开了一种新型抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用。本发明通过壳聚糖和脱氧胆酸进行酰胺化反应形成共聚物壳聚糖-脱氧胆酸，壳聚糖-脱氧胆酸和甲醛形成希夫碱中间体后与聚乙二醇反应，得到的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇与叶酸发生酰胺化反应而制备新型抗肿瘤纳米药物载体，利用肿瘤细胞表面叶酸受体高表达而正常组织很少有叶酸受体过分表达的特点，接有叶酸分子的新型抗肿瘤纳米药物载体与肿瘤细胞有更强的亲和力，克服了普通纳米粒功能较单一的缺点。制备的新型抗肿瘤纳米药物载体能够很好的避开吞噬细胞的吞噬，有利于在体内长期循环而不被清除，主动靶向修饰能够更好的与肿瘤细胞特异性结合，减少了药物对人体正常细胞的损害。
文档编号A61P35/00GK103083673SQ20131001366
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者郭瑞, 张渊明, 师忠根, 唐渝 申请人:暨南大学