专利名称：一种作为药物载体的金纳米颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于铂类药物载体技术领域，具体涉及负载有铂类药物的金纳米颗粒药物载体及其制备方法。
背景技术：
根据《生物医学工程杂志》(2004年二十一卷第三期，第495-497页)的文章所述，药物载体是指能够负载药物并能改变药物进入体内的方式和在体内的分布、控制药物的释放速率并将药物输送到靶向器官的体系，它能够有效降低药物对正常组织的毒副作用，提高药物的生物利用度。
2007年中华医学会公布的数据显示，恶性肿瘤已成为危害我国居民生命的各类疾病中的第一杀手，每年中国有200万人死于肿瘤。顺铂(Cisplatin，CDDP)是一个含铂的抗肿瘤药物，应用范围比较广泛，但它的副作用很多，包括肾脏毒性、恶心、呕吐，神经毒性、耳毒性、秃头症以及电解质紊乱，且使用时间较长时大部分病人都会对顺铂产生抗药性，《自然综述·癌症》(2005年第5期第161页到171页)的文章(Nature ReviewsCancer，2005，5161-171)认为这些症状主要是由于药物对肿瘤细胞的作用没有选择性，因此需要寻找新的办法以改进顺铂的治疗。
美国化学会的杂志《化学材料》(Chemistry Material，2003，151957)介绍了一种用十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)稳定的金纳米颗粒的方法，用CTAB作为软性模板剂，采用种子生长法制备的金纳米颗粒，所得到的金纳米颗粒是棒状的，并且颗粒的尺寸是可控的，但尚未见到将它作为铂类药物载体应用的报道。《化学与生物学》杂志(Chemistry&Biology，11557)报道了铂类药物的前体药物为顺铂的前体药物顺式，顺式，反式-二氨二氯二丁二酸合铂的结构及其生物学用途，但至今尚未见到将它们负载到金纳米颗粒上用于药物运输应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种作为铂类药物载体的金纳米颗粒及其制备方法。
本发明的作为铂类药物载体的金纳米颗粒，特征在于其中的透膜肽通过巯基以共价键结合在金纳米颗粒的表面，且该透膜肽还通过氨基以酰氨键结合在铂类药物的前体药物的羧基上； 所述透膜肽是序列中包含1个半胱氨酸和5到19个精氨酸的一段包含8个到20个氨基酸的肽； 所述铂类药物的前体药物为顺铂的前体药物或者为卡铂的前体药物或者为奥沙利铂的前体药物； 所述顺铂的前体药物选自如下所列的化合物1或化合物2或化合物3；所述卡铂的前体药物选自化合物4或化合物5或化合物6；所述奥沙利铂的前体药物选自化合物7或化合物8或化合物9； 所述化合物1到化合物9的结构式为
其中1≤n≤5。
本发明的作为铂类药物载体的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于采用如下步骤将金纳米颗粒通过金与透膜肽的巯基以共价键结合上透膜肽，再通过透膜肽的氨基与铂类药物的前体药物的羧基以共价键将铂类药物的前体药物结合到透膜肽上，包括 第一步，透膜肽结合的金纳米颗粒的制备 金纳米种子溶液的制备将0.25～1mL的0.005～0.01M氯金酸加入到5～10mL的0.1～0.2M CTAB溶液中混合均匀，至溶液为棕黄色；加入0.5～1mL的0.01～0.02M的NaBH4溶液，快速搅拌2～20min，至溶液呈棕色；于30～50℃水浴中静置2～20小时，备用； CTAB稳定的金纳米颗粒的制备先将5～10mL的0.1～0.2M CTAB和5～10mL的0.01～0.02M氯金酸在30～50℃水浴下用磁力搅拌器混合均匀；然后加入0.18～0.5mL的0.01～0.02M硝酸银和0.2～0.4mL 0.1～0.2M的抗坏血酸，用漩涡振荡器混合均匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.01～0.03mL上述制备的金纳米种子溶液，用漩涡振荡器混合10～50秒钟后静置于30～50℃水浴中2～24小时，得到金纳米颗粒溶液； 透膜肽结合的金纳米颗粒的制备向制备得到的金纳米颗粒溶液(700nm处紫外吸收值为1～100)中加入透膜肽1mg～1g/mL；反应8小时～3天后，将反应液在4000～20000转/分钟下离心3～60min，去除上清液中未反应的透膜肽；将被沉淀在离心管底部的与透膜肽结合的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液； 第二步，制备负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒 铂类药物的前体药物化合物1-化合物9的制备为 化合物1的制备将0.6mmol～6mmol顺铂和5～50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物10；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物10于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物1； 化合物2的制备将0.6mmol～6mmol顺铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物11；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物11于1～5mL DMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物2； 化合物3的制备将0.6mmol～6mmol顺铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL乙醇中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物12；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物12于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物3； 化合物4的制备将0.6mmol～6mmol奥沙利铂和5～50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物13；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物13于1～5mL DMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物4； 化合物5的制备将0.6mmol～6mmol奥沙利铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物14；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物14于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物5； 化合物6的制备将0.6mmol～6mmol奥沙利铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL乙醇中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物15；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物15于1～5mL DMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物6； 化合物7的制备将0.6mmol～6mmol卡铂和5～50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物16；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物16于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物7； 化合物8的制备将0.6mmol～6mmol卡铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白黄色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有米白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物17；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物17于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物8； 化合物9的制备将0.6mmol～6mmol卡铂和5～25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6～60mL水中，加热到40～80℃，搅拌反应1～10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5～5mL并降温至0～8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物18；将1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物18于1～5mLDMF中加热到60～90℃反应1～5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物9； 负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的制备向700nm处紫外吸收为1～20的透膜肽结合的金纳米颗粒溶液中加入1～30mmol/mL化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7或化合物8或化合物9，及1～40mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和1～40mmol/mL N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，在30～70℃反应8～48小时，将反应液在4000～20000转/分钟离心3～60min，去除上清液，将被沉淀在离心管底部的结合透膜肽的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液； 第三步，细胞毒性实验 细胞毒性实验选用对数生长期细胞接种在96孔板内，培养2～24小时后更换新鲜的培养基，设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同浓度梯度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物；继续培养72小时后采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性，计算出实验组的细胞存活率，从而得到药物的细胞毒性。
本发明的作为铂类药物的金纳米颗粒是利用配体交换和不同分子之间的氨基羧基缩合形成酰氨键进行组装的原理制备而得。采用本发明方法制备的作为铂类药物载体的金纳米颗粒，提高了金纳米颗粒的生物利用度并有效地提高了铂类药物对肿瘤的细胞毒性，负载了铂类药物的金纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用与单独使用铂类药物作用相比提高了大约10倍，这为金纳米颗粒在生物医学领域的应用开辟了一条新途径，同时本发明的制备方法简单，成本低廉，可以工业化生产。
图1为结合了透膜肽的金纳米颗粒的电镜图。
图2是经过修饰后的金纳米颗粒的紫外-可见光谱图。
具体实施例方式 实施例1 一、CTAB稳定的金纳颗粒的制备 透膜肽结合的金纳米颗粒的制备(可参考《化学材料》(Chemistry Material，2003，151957)的方法) 金纳米种子溶液的制备将0.25mL的0.005M氯金酸加入到5mL的0.1M CTAB溶液中混合均匀，溶液为棕黄色；加入0.5mL的0.01M的NaBH4溶液，快速搅拌2min，此时溶液呈淡棕色；于30℃水浴中静置2小时，备用； CTAB稳定的金纳米颗粒的制备先将5mL 0.1M CTAB和5mL的0.01M氯金酸在30℃水浴下用磁力搅拌器混合均匀；然后加入0.18mL的0.01M硝酸银和0.2mL 0.1M的抗坏血酸，用漩涡振荡器混合均匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.01mL上述金纳米种子溶液，用漩涡振荡器混合10秒钟后静置于30℃水浴中2小时。
图1为本实施例中所制备得到的结合了透膜肽的金纳米颗粒的电镜图。从图中可见金纳米颗粒的粒径在50nm，颗粒形状为棒状。
图2是经过修饰后的金纳米颗粒的紫外-可见光谱图，其中实线是CTAB稳定的金纳米颗粒的紫外-可见光谱图；虚线为结合了透膜肽的金纳米颗粒的紫外-可见光谱图。从图中可见，连接了透膜肽的金纳米颗粒仍然保持了金纳米颗粒原有的物理特性。
二、铂类药物的前体药物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制备(可参考《化学与生物学》(Chemistry&Biology，11557)上介绍的方法) 化合物1的制备将0.6mmol顺铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物10；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物10于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物1； 化合物2的制备将0.6mmol顺铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物11；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物11于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物2； 化合物3的制备将0.6mmolmmol顺铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL乙醇中，加热到40℃，搅拌反应1小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物12；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物12于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物3； 化合物4的制备将0.6mmol奥沙利铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物13；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物13于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物4； 化合物5的制备将0.6mmol奥沙利铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物14；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物14于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物5； 化合物6的制备将0.6mmol奥沙利铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL乙醇中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物15；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物15于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物6； 化合物7的制备将0.6mmol卡铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物16；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物16于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物7； 化合物8的制备将0.6mmol卡铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物17；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物17于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物8； 化合物9的制备将0.6mmol卡铂和5mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到6mL水中，加热到40℃，搅拌反应1小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至0.5mL并降温至0℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物18；将1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物18于1mL DMF中加热到60℃反应1小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1mL丙酮后，向该溶液中加入30mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物9。
三、透膜肽修饰的金纳颗粒的制备 按1mg/mL向金纳米颗粒溶液(700nm处紫外吸收值为1)中加入透膜肽，然后搅拌反应3天，通过透膜肽与金纳米颗粒的吸附作用结合到金纳米颗粒表面；反应结束后，没有反应的肽通过离心的方法分离，将反应液于4000rpm下离心60min，金纳米颗粒颗粒被沉淀在离心管底部，去除上清液中未反应的透膜肽；然后在将纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。所得到的金纳米颗粒的电镜照片即前面所述的图1，紫外-可见图谱即前面所述的图2。
四、负载铂类药物的透膜肽修饰的金纳米颗粒的制备 向700nm处紫外吸收为1的透膜肽结合的金纳米颗粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量为1mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)1mmol/mL和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)1mmol/mL，在30℃反应8小时，将反应液在4000转/分钟离心60min，去除上清液，将被沉淀在离心管底部的结合透膜肽的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。负载到金纳米颗粒表面的铂浓度通过电感耦合等离子质谱或原子吸收光谱来定量。
实施例2 一、CTAB稳定的金纳颗粒的制备种子溶液的制备将0.75mL的0.075M氯金酸加入到6mL的0.15M CTAB溶液中混合均匀，溶液为棕黄色；加入0.75mL的0.15M的NaBH4溶液，快速搅拌10min，此时溶液呈淡棕色；于40℃水浴中静置10小时，备用； CTAB稳定的金纳米颗粒的制备先将6mL的0.15M CTAB和6mL的0.015M氯金酸在40℃水浴下用磁力搅拌器混合均匀；然后加入0.3mL的0.015M硝酸银和0.3mL 0.15M的抗坏血酸，用漩涡振荡器混合均匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.02mL上述金纳米种子溶液， 金纳米用漩涡振荡器混合30秒钟后静置于40℃水浴中12小时。
二、铂类药物的前体药物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制备 化合物1的制备将3mmol顺铂和10mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到20mL水中，加热到60℃，搅拌反应5小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至2mL并降温至4℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物10；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物10于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.2mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物1； 化合物2的制备将3mmol顺铂和15mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到10mL水中，加热到60℃，搅拌反应70小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至2mL并降温至4℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物11；将20mmol丁二酸酐和1mmol化合物11于2mL DMF中加热到80℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.2mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物2； 化合物3的制备将3mmol顺铂和10mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到30mL乙醇中，加热到50℃，搅拌反应60小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至2mL并降温至4℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物12；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物12于2mL DMF中加热到70℃反应3小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.2mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物3； 化合物4的制备将3mmol奥沙利铂和10mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到10mL水中，加热到50℃，搅拌反应5小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至02mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物13；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物13于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.2mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物4； 化合物5的制备将3mmol奥沙利铂和15mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到10mL水中，加热到50℃，搅拌反应40小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至1mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物14；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物14于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.3mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有淡白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物5； 化合物6的制备将2mmol奥沙利铂和15mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到10mL乙醇中，加热到60℃，搅拌反应5小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈淡无色；浓缩反应液至4mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物15；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物15于2mL DMF中加热到80℃反应4小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.2mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物6； 化合物7的制备将3mmol卡铂和10mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到40mL水中，加热到60℃，搅拌反应5小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至2mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物16；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物16于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物7； 化合物8的制备将3mmol卡铂和15mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到10mL水中，加热到50℃，搅拌反应7小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至1mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物17；将10mmol丁二酸酐和2mmol化合物17于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.3mL丙酮后，向该溶液中加入40mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物8； 化合物9的制备将3mmol卡铂和15mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到50mL水中，加热到70℃，搅拌反应2小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至2mL并降温至4℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物18；将10mmol丁二酸酐和1mmol化合物18于2mL DMF中加热到70℃反应2小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈白色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.3mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物9； 三、透膜肽修饰的金纳颗粒的制备为 按250mg/mL向金纳米颗粒溶液中(向700nm处紫外吸收值为10)加入透膜肽，然后搅拌反应24hrs；反应结束后，没有反应的肽通过离心的方法分离，将反应液于10000rpm下离心10min，金纳米颗粒颗粒被沉淀在离心管底部，去除上清液中未反应的透膜肽；然后在将纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。
四、负载铂类药物的透膜肽修饰的金纳米颗粒的制备为 向700nm处紫外吸收为10的透膜肽结合的金纳米颗粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量为10mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)10mmol/mL和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)10mmol/mL，在50℃反应28小时，将反应液在10000转/分钟离心10min，去除上清液，将被沉淀在离心管底部的结合透膜肽的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。负载到金纳米颗粒表面的铂浓度通过电感耦合等离子质谱或原子吸收光谱来定量。
实施例3 一、CTAB稳定的金纳颗粒的制备 金纳米种子溶液的制备将1mL的0.01M氯金酸加入到10mL的0.2M CTAB溶液中混合均匀，溶液为棕黄色；加入1mL的0.02M的NaBH4溶液，快速搅拌20min，此时溶液呈淡棕色；于50℃水浴中静置20小时，备用； CTAB稳定的金纳米颗粒的制备先将10mL的0.2M CTAB和10mL的0.02M氯金酸在50℃水浴下用磁力搅拌器混合均匀；然后加入0.5mL的0.02M硝酸银和0.4mL的0.2M的抗坏血酸，用漩涡振荡器混合均匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.03mL上述金纳米种子溶液，用漩涡振荡器混合50秒钟后静置于50℃水浴中24小时。
二、铂类药物的前体药物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制备 化合物1的制备将6mmol顺铂和50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物10；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物10于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物1； 化合物2的制备将6mmol顺铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物11；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物11于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物2； 化合物3的制备将6mmol顺铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL乙醇中，加热到80℃，搅拌反应10小时，黄色固体慢慢溶解，溶液呈淡黄色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有米黄色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到亮黄色固体产物化合物12；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物12于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈黄色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有淡黄色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到淡黄色的目的产物化合物3； 化合物4的制备将6mmol奥沙利铂和50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物13；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物13于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物4； 化合物5的制备将6mmol奥沙利铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物14；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物14于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物5； 化合物6的制备将6mmol奥沙利铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL乙醇中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物15；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物15于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物6； 化合物7的制备将6mmol卡铂和5～50mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物16；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物16于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物7； 化合物8的制备将6mmol卡铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物17；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物17于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物8； 化合物9的制备将6mmol卡铂和25mL体积浓度为30％的过氧化氢水溶液加入到60mL水中，加热到80℃，搅拌反应10小时，白色固体慢慢溶解，溶液呈无色；浓缩反应液至5mL并降温至8℃，有白色的固体晶体固体析出，再在沸水中重结晶，得到白色固体产物化合物18；将30mmol丁二酸酐和3mmol化合物18于5mL DMF中加热到90℃反应5小时，固体原料慢慢溶解，至反应液呈无色，用真空泵抽干DMF，剩余的油状物溶于0.5mL丙酮后，向该溶液中加入50mL乙醚有白色产物沉淀出来，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的产物化合物9； 三、透膜肽修饰的金纳颗粒的制备 按1g/mL向金纳米颗粒溶液中(向700nm处紫外吸收值为100)加入透膜肽，然后搅拌反应8hrs；反应结束后，没有反应的肽通过离心的方法分离，将反应液于20000rpm下离心3min，金纳米颗粒颗粒被沉淀在离心管底部，去除上清液中未反应的透膜肽；然后在将纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。
四、负载铂类药物的透膜肽修饰的金纳米颗粒的制备 向700nm处紫外吸收为20的透膜肽结合的金纳米颗粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量为30mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)40mmol/mL和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)40mmol/mL，在70℃反应8小时，将反应液在20000转/分钟离心3min，去除上清液，将被沉淀在离心管底部的结合透膜肽的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液。负载到金纳米颗粒表面的铂浓度通过电感耦合等离子质谱或原子吸收光谱来定量。
实施例4 一、Hela细胞培养 将HeLa宫颈癌细胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2培养箱中培养。实验选用对数生长期细胞。
二、MTT法测定细胞活性 细胞毒性实验选用对数生长期细胞2×104个/mL接种在96孔板内，每孔100μL，培养24小时后更换新鲜的培养基，设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同浓度梯度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物；继续培养72小时后噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性，计算出实验组的细胞存活率，从而得到药物的细胞毒性。
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至2000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
2、5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，每个浓度设3复孔。
3、5％CO2，37℃孵育72小时，倒置显微镜下观察。
4、弃去旧的培养基加入新鲜培养基100μL，然后每孔加入25μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养2h。
6、每孔加入100μL细胞裂解液，5％CO2，37℃培养过夜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度A值。
存活率(％)＝[实验组(S)的A值-空白(B)A值]/[对照组(C)的A值-空白(B)的A值] 实验结果表明本发明的负载铂药物的透膜肽连接的金纳米颗粒上面后，提高了它对HeLa的细胞毒性，IC50值(抑制率50％的时候药物的浓度)为0.25μM，与铂类药物的IC50值(2.5μM)相比，提高了10倍。
权利要求
1.一种作为铂类药物载体的金纳米颗粒，特征在于其中的透膜肽通过巯基以共价键结合在金纳米颗粒的表面，且该透膜肽还通过氨基以酰氨键结合在铂类药物的前体药物的羧基上；
所述透膜肽是序列中包含1个半胱氨酸和5到19个精氨酸的一段包含8个到20个氨基酸的肽；
所述铂类药物的前体药物为顺铂的前体药物或为卡铂的前体药物或为奥沙利铂的前体药物；
所述顺铂的前体药物选自如下所列的化合物1或化合物2或化合物3；所述卡铂的前体药物选自化合物4或化合物5或化合物6；所述奥沙利铂的前体药物选自化合物7或化合物8或化合物9；
所述化合物1到化合物9的结构式为
其中1≤n≤5。
2.权利要求1所述作为铂类药物载体的金纳米颗粒的的制备方法，其特征在于包括如下步骤
第一步，透膜肽结合的金纳米颗粒的制备
金纳米种子溶液的制备将0.25～1mL的0.005～0.01M氯金酸加入到5～10mL的0.1～0.2M CTAB溶液中混合均匀，至溶液为棕黄色；加入0.5～1mL的0.01～0.02M的NaBH4溶液，快速搅拌2～20min，至溶液呈棕色；于30～50℃水浴中静置2～20小时，备用；
CTAB稳定的金纳米颗粒的制备先将5～10mL的0.1～0.2M CTAB和5～10mL的0.01～0.02M氯金酸在30～50℃水浴下用磁力搅拌器混合均匀；然后加入0.18～0.5mL的0.01～0.02M硝酸银和0.2～0.4mL 0.1～0.2M的抗坏血酸，用漩涡振荡器混合均匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.01～0.03mL上述制备的金纳米种子溶液，用漩涡振荡器混合10～50秒钟后静置于30～50℃水浴中2～24小时，得到金纳米颗粒溶液；
透膜肽结合的金纳米颗粒的制备向制备得到的金纳米颗粒溶液中加入透膜肽1mg～1g/mL；反应8小时～3天后，将反应液在4000～20000转/分钟离心3～60min，去除上清液中未反应的透膜肽；将被沉淀在离心管底部的与透膜肽结合的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液；
第二步，制备负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒
向700nm处紫外吸收为1～20的透膜肽结合的金纳米颗粒溶液中加入1～30mmol/mL化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7或化合物8或化合物9，及1～40mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1～40mmol/mL N-羟基丁二酰亚胺，在30～70℃反应8～48小时，将反应液在4000～20000转/分钟离心3～60min，去除上清液，将被沉淀在离心管底部的结合透膜肽的金纳米颗粒超声分散于超纯水中，即得到负载铂类药物的透膜肽结合的金纳米颗粒的水溶液；
所述化合物1到化合物9的结构式为
其中1≤n≤5；
第三步，细胞毒性实验
细胞毒性实验选用对数生长期细胞接种在96孔板内，培养2～24小时后更换新鲜的培养基，设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同浓度梯度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物；继续培养72小时后采用噻唑蓝法测定细胞活性，计算出实验组的细胞存活率，从而得到药物的细胞毒性。
全文摘要
本发明公开了一种作为药物载体的金纳米颗粒及其制备方法，特征是其中透膜肽通过巯基以共价键结合在金纳米颗粒的表面且该透膜肽还通过氨基以酰氨键结合在铂类药物的前体药物的羧基上；所述透膜肽是序列中包含1个半胱氨酸和5到19个精氨酸的一段包含8个到20个氨基酸的肽；所述铂类药物的前体药物为顺铂的前体药物或为卡铂的前体药物或为奥沙利铂的前体药物；所述顺铂的前体药物选自化合物1-3；所述卡铂的前体药物选自化合物4-6；所述奥沙利铂的前体药物选自化合物7-9。该连接铂药物和透膜肽的金纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性明显增强且未连接铂药物的金纳米颗粒本身无毒，本发明为金纳米颗粒在生物医药领域的应用开辟了新的途径。
文档编号A61K31/282GK101816797SQ20101011344
公开日2010年9月1日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者刘扬中, 闵元增 申请人:中国科学技术大学