普鲁士蓝纳米粒子作为光声成像造影剂的新用途
【专利摘要】本发明公开普鲁士蓝纳米粒子的一种新用途，将其用作光声成像的造影剂。该类材料包括实心、介孔和中空结构，在波长为500-1300nm的近红外区域具有强吸收，是一种高效的近红外光热剂。使用普鲁士蓝纳米粒子作为光声成像的造影剂，其能有效增加近红外激光对组织的穿透深度，具有显著的造影增强效果。此外，普鲁士蓝是一种临床药物，具有很好的体内生物安全性，其制备方法简单、绿色、成本低，将其用于光声成像造影剂具有广阔的应用前景。
【专利说明】普鲁士蓝纳米粒子作为光声成像造影剂的新用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及普鲁士蓝纳米粒子作为光声成像造影剂 的新用途。 技术背景
[0002] 近年来，光声成像作为一种新兴的非侵入性成像技术已受到广泛关注，其原理是 通过测量生物组织吸收脉冲激光后产生的超声波来进行重构成像。由于综合了脉冲激光的 可选择性和超声检测的高分辨率，光声成像可以精确进行组织结构和功能的成像。相对于 其它的光学成像技术，如共聚焦显微镜和光学相干断层成像等，光声成像能够对更深的组 织进行高分辨率的成像。然而，光在穿过组织过程中会发生严重的吸收和散射效应，入射激 光的强度会呈现指数性的衰减，导致光声成像的信噪比也呈现指数型的衰减。由于生物组 织在近红外光区域内没有明显的吸收，其对组织的穿透更深，所以近红外激光作为光声成 像的激发光源已越来越多被应用，从而实现对更深层的组织进行成像。然而体内的一些发 色团如血红蛋白，对近红外光的吸收很弱，导致形成的光声信号强度也较弱，因此需要引入 在近红外区域具有强吸收的光声成像造影剂来提高光声成像的信噪比。
[0003] 目前文献报道的光声成像造影剂包括各种金纳米结构的粒子（Nano Lett.， 2004,4,1689 ;0pt. Express.，2010,18,8867 ;J. Biomed. Opt.，2009,14.)，碳纳米管（恥七 Nanotechnol.，2008, 3, 557 ; J. Biomed. Opt. 2009,14,034018)，硫化铜纳米粒子（ACSNano， 2012,6,7489)，虽然前期的研究证实这些纳米粒子具有明显的光声成像增强效果，但它们 的生物安全性仍然没有得到证实，此外它们的制备方法相对复杂，成本相对较高。
[0004] 普鲁士蓝是一种古老的蓝色染料，其制备过程非常简单、绿色，且成本低、价格便 宜、可进行大批量生产。同时在医学上普鲁士蓝是一种解毒剂，可以用于治疗某些重金属中 毒，如铊和铯，因此体内生物安全性高。最为重要的是普鲁士蓝还是一种新型的近红外光热 治疗转换剂，和传统的光热治疗剂相比，普鲁士蓝具有光热转换效率高、成本低和制备简单 的优点（Chemical Communications，2012,94,11567)。
[0005] 综上所述，开发新型的、高效安全的光声成像造影剂具有重要的实际应用价值。基 于以上考虑，我们将普鲁士蓝纳米粒子应用于光声成像，开发了一种新型的近红外光声成 像造影剂，该造影剂具有很高的生物安全性和稳定性，具备很好的近红外光吸收能力和光 声成像增强效果，因此具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供普鲁士蓝纳米粒子作为光声成像造影剂的新用途。
[0007] 为了证实本发明所述的普鲁士蓝纳米粒子用于光声成像造影剂的新用途，包括以 下实验步骤：
[0008] 1)实验装置的搭置：实验中利用Q转换的Nd:YAG激光（LS-2137/2, L0TIS TII， Minsk，Belarus)及泵浦可调节 Ti 蓝宝石激光（LT-2211A，L0TIS TII，Minsk，Belarus)来 作为激发光源产生光声信号，并且通过毛玻璃使激光均匀化地照射到测试样品上。实验中 选用脉冲频率为10Hz的近红外脉冲激光，并且控制照射在测试样品表面的入射光的强度 低于10mJ cnT2。实验中使用2. 25MHz的不聚焦超声探头来检测测试样品产生的超声信号。 为了减少超声信号的衰减，测试样品和探头均浸没在水槽中，并且利用步进式马达使超声 探头以半径为12cm的圆围绕测试样品水平地转动。实验装置见附图1。
[0009] 2)配制不同浓度的普鲁士蓝纳米粒子（80μ g/mL，60y g/mL，40y g/mL，20y g/ mL，10yg/mL，0yg/mL)在一定波长近红外脉冲激光照射下，通过步骤1)所述的装置检测 样品光声信号的产生能力。以此证明普鲁士蓝纳米粒子具备作为光声成像造影剂的潜力。
[0010] 3)体外光声信号增强效果评价：将不同浓度（20μ g/mL，40y g/mL，60y g/mL， 80 μ g/mL和100 μ g/mL)的普鲁士蓝纳米粒子加入到由琼脂凝胶制成的仿体中，然后将此 仿体置于不同厚度鸡胸肉下获得不同浓度普鲁士蓝纳米粒子的光声断层图像，以此探讨普 鲁士蓝纳米粒子作为光声造影剂的可能性以及其在近红外光波长处有效的成像深度。
[0011] 4)体内光声信号增强效果评价：首先利用脱毛膏去除小鼠头部上的体毛，在其头 部上涂上超声耦合剂减弱超声信号的衰减。小鼠麻醉后将其头部从水槽底部的缺口中突 出，注射普鲁士蓝纳米粒子前，先对小鼠大脑皮质进行光声成像。然后分别经尾静脉注射一 定体积和一定浓度的普鲁士蓝纳米粒子，在不同的时间点对小鼠大脑皮质进行光声成像。 观察其对小鼠大脑皮质的光声成像增强效果。
[0012] 5)将步骤4)所得的结果进行数据处理分析。计算当给小鼠注射一定体积和一定 浓度的普鲁士蓝纳米粒子后，在不同时间点小鼠脑部血管的光声信号的变化情况，并与注 射普鲁士蓝纳米粒子溶液之前做比较。
[0013] 在步骤1)中，所述的近红外脉冲激光的波长范围在500-1300nm之间，优选765nm ; 在步骤2)中，所述普鲁士蓝纳米粒子包括实心、介孔和中空结构，其内充物质选自各类生 物相容性好的气体、液体和固体物质，粒径范围在2-10000mm之间；在步骤4)和步骤5)中， 所述普鲁士蓝纳米粒子的注射体积在50-400 μ L之间，浓度范围为2-20mg/mL ;在步骤5) 中，所述的不同时间点范围在5分钟到一周之间。
[0014] 同现有光声成像造影剂相比较，本发明所述的普鲁士蓝纳米粒子开发为新型的光 声成像造影剂，具有以下突出优点：
[0015] (1)普鲁士蓝纳米粒子的制备方法简单、绿色、成本低，并且大小可控，适合于大批 量生产。
[0016] (2)普鲁士蓝纳米材料已应用于临床，具有很好的体内生物安全性。
[0017] (3)普鲁士蓝纳米粒子具有高效稳定的近红外光热效应，能高效稳定的吸收近红 外光，其光声成像效果显著，具有广阔的实际应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明进行体外含普鲁士蓝纳米粒子凝胶的光声成像的实验装置图；图2 是本发明所述普鲁士蓝纳米的透射电镜（a)和紫外可见近红外吸收光谱图（b);图3是普 鲁士蓝纳米粒子的光声信号强度随浓度增加的变化曲线图；图4是含不同浓度普鲁士蓝纳 米粒子凝胶（a)在不同鸡肉层数厚度下的光声成像图，其中浓度①100 μ g/mL，②80 μ g/ 1111^，@6〇4 8/1]11^，@4〇4 8/1]11^，?2〇4 8/1]11^，鸡肉层数厚度〇3)?0，（(3)?1.2〇11，（(1)? 2. 2cm，（e)?3. 4cm，（f)?4. 3cm ;图5是静脉注射普鲁士蓝纳米粒子水溶液后小鼠脑部 的光声成像随着时间的变化图：(a)注射前，（b)注射5分钟后，（c)注射30分钟后，（d)实 验所用小鼠的头部图片，（e)图片b扣除图片a背景后的光声成像图，（f)图片c扣除图片 a背景后的光声成像图；图6是静脉注射普鲁士蓝纳米粒子水溶液后小鼠脑部的光声信号 强度随着时间的变化图。
【具体实施方式】
[0019] 通过以下【具体实施方式】将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0020] 实施例1
[0021] 实验装置的搭置：实验中利用Q转换的Nd:YAG激光（LS-2137/2, LOTIS TII， Minsk，Belarus)及泵浦可调节 Ti 蓝宝石激光（LT-2211A，LOTIS TII，Minsk，Belarus)来 作为激发光源产生光声信号，并且通过毛玻璃使激光均匀化地照射到测试样品上。实验中 选用脉冲频率为10Hz的765nm近红外脉冲激光，并且控制照射在测试样品表面的入射光的 强度低于10mJ cnT2。实验中使用2. 25MHz的不聚焦超声探头来检测测试样品产生的超声 信号。为了减少超声信号的衰减，测试样品和探头均浸没在水槽中，并且利用步进式马达使 超声探头以半径为12cm的圆围绕测试样品水平地转动。实验装置见附图1。
[0022] 实施例2
[0023] 普鲁士蓝纳米粒子的制备：在100毫升的圆底烧瓶中，依次加入20毫升浓度 为1. OmM的FeCl3水溶液和0. 5mmol的柠檬酸，加热至60°C后，往其中加入20毫升含有 0. 5mmol的柠檬酸的浓度为1. OmM的K4 [Fe (CN) 6]水溶液，60°C下搅拌20分钟后，冷却至室 温，继续搅拌30分钟，离心分离提纯。所得纳米粒子的透射电镜见附图2a，粒径约为40nm， 其吸收光谱显示普鲁士蓝纳米粒子在650-900nm波长范围内具有较强吸收（附图2b)。
[0024] 实施例3
[0025] 配制不同浓度的普鲁士蓝纳米粒子（80μ g/mL，60y g/mL，40y g/mL，20y g/mL, 10 μ g/mL，0 μ g/mL)在765nm脉冲激光照射下，通过实施例1的装置检测样品光声信号的产 生能力。实验结果显示普鲁士蓝纳米粒子对765nm脉冲激光具有极好的响应能力，并且产 生的光声信号强度随着普鲁士蓝纳米粒子浓度的增加而呈现出线性的增加（附图3)，以此 证明普鲁士蓝纳米粒子具备作为光声成像造影剂的潜力。
[0026] 实施例4
[0027] 体外光声信号增强效果评价：将不同浓度（20 μ g/mL，40 μ g/mL，60 μ g/mL， 80μ g/mL和100μ g/mL)的普鲁士蓝纳米粒子加入到由琼脂凝胶制成的仿体中，然后将此 仿体置于不同厚度鸡胸肉下获得不同浓度普鲁士蓝纳米粒子的光声断层图像，以此探讨普 鲁士蓝纳米粒子作为光声造影剂的可能性以及其在765nm波长处有效的成像深度（装置见 附图1)，实验过程中，光声图像信号利用频率为2. 25MHz的超声探头进行采集，得到普鲁士 蓝纳米粒子置于鸡胸肉厚度分别为0cm，1. 2cm，3. 4cm和4. 3cm的光声断层图像。实验结果 如附图4所示，尽管随着鸡胸肉厚度的增加，近红外光的强度由于光的散射等效应大大降 低，但仿体中的普鲁士蓝纳米粒子仍然清晰可见。体外仿体的光声实验结果证明了普鲁士 蓝纳米粒子作为潜在的光声成像造影剂能够显著的增强组织的光声信号，在非侵入性的检 测深部生物组织方面有很好的应用前景。
[0028] 实施例5
[0029] 体内光声信号增强效果评价：首先利用脱毛膏去除小鼠头部上的体毛，在其头部 涂上超声耦合剂，以减弱成像过程中超声信号的衰减。小鼠麻醉后将其头部从水槽底部的 缺口中突出，注射普鲁士蓝纳米粒子前，先对小鼠大脑皮质进行光声成像。然后分别经尾静 脉注射200 μ L浓度为2mg/mL的普鲁士蓝纳米粒子，在不同的时间点对小鼠大脑皮质进行 光声成像。观察其对小鼠大脑皮质的光声成像增强效果。由于血液中血红蛋白在765nm处 的吸收较低，在注射普鲁士蓝纳米粒子之前，小鼠大脑皮质处血管的光声信号比较弱（见 附图5a)。如附图5b所示，在注射普鲁士蓝纳米粒子5min后，小鼠的脑部血管的光声信号 得到了明显的增强，表明在小鼠血管内循环的普鲁士蓝纳米粒子增强了小鼠脑部血管和脑 实质的造影。实验中将注射粒子前后的光声图像进行逐个像素的减法，获得完全是由于普 鲁士蓝纳米粒子对光声信号的增强而形成的光声图像，更好的证明了普鲁士蓝纳米粒子体 内作为光声成像造影剂的潜力（附图5e)。而在注射普鲁士蓝纳米粒子30min后，光声信号 与注射前相比依然有显著的增强（附图5c，f)，结果表明普鲁士蓝纳米粒子不仅具有优异 的光声成像性能，还具有较长的体内循环时间，这就为普鲁士蓝纳米粒子通过被动靶向到 肿瘤部位提供了可能。
[0030] 实施例6
[0031] 将实施例5所得的结果进行数据处理分析，结果如附图6a所示。当给小鼠注射普 鲁士蓝纳米粒子（200μ L，2mg/mL)45min后，小鼠脑部血管的光声信号达到最强，是注射粒 子前信号强度的3倍。即使注射完普鲁士蓝纳米粒子60min后，光声信号的衰减仍然比较 少。这与上述结果中表述的普鲁士蓝纳米粒子增强大脑皮质血管造影相符合。如附图6b 所示，在血液中注射普鲁士蓝纳米粒子后，光声成像的对比噪声比有了明显的增加，大大提 高了光声成像的分辨率。因此，普鲁士蓝纳米粒子能够作为一种优良的光声造影剂。
【权利要求】
1. 普鲁士蓝纳米粒子的新用途，其特征在于：所述的普鲁士蓝纳米粒子用于作为光声 成像的造影剂。
2. 根据权利要求1所述的普鲁士蓝纳米粒子的新用途，其特征在于：所述的普鲁士蓝 纳米粒子在波长为500-1300nm的近红外区域具有强吸收。
3. 根据权利要求1和2所述的普鲁士蓝纳米粒子，其特征在于：所述的普鲁士蓝纳米 粒子包括实心、介孔和中空普鲁士蓝纳米粒子。
4. 根据权利要求3所述的介孔或中空普鲁士蓝纳米粒子，其特征在于：其内部孔隙的 填充物质包括各种具有良好生物相容性的气体、液体和固体物质。
5. 根据权利要求1，2和3所述的普鲁士蓝纳米粒子，其特征在于：所述的普鲁士蓝纳 米粒子的粒径范围在2-10000nm之间。
6. 根据权利要求1所述的普鲁士蓝纳米粒子用于光声成像的新用途，其特征在于：成 像过程中所用激光的波长范围在500-1300nm之间。
【文档编号】A61K9/14GK104096242SQ201310119420
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】戴志飞, 梁晓龙, 李长辉, 邓梓健, 井立佳, 黄毛毛, 李小达 申请人:北京大学