一种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)及其制备方法与应用。具有双特异性抗体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，是由CD3单抗与针对肿瘤相关抗原(TAAs)的任意抗体组合为双特异性抗体装备CTL细胞得到的，命名为CTL(BiAT)细胞。本发明联合利用多种肿瘤相关抗原表位肽刺激DC诱导产生靶向特异性CTL和肿瘤相关抗原抗体(一种或多种)的靶向结合，通过双重机理来确保CTL细胞的靶向作用，增加了CTL细胞作用的靶点数量，进一步提高了CTL细胞免疫效应的靶向性，能更高效地杀伤肿瘤细胞。
【专利说明】一种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)及其制备方法与 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及恶性肿瘤的靶向免疫细胞治疗药物，具体涉及一 种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)及其制备方法，以及其在制备增强特异性细胞毒性 T淋巴细胞（CTL)的免疫杀伤效应的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞治疗是当前恶性肿瘤免疫治疗的主流治疗方法，是通过采集肿瘤患者自 身外周血一定量的单个核细胞，在GMP实验室里经过体外培养，扩增并活化得到具有抗肿 瘤作用的免疫活性细胞，或用肿瘤抗原诱导进行靶向性处理，然后通过静脉、皮内注射、介 入等方式回输到患者体内杀灭肿瘤细胞，同时调节机体的免疫反应，增强抑制或杀灭肿瘤 细胞的免疫能力。
[0003] 目前，临床常用的过继性肿瘤免疫细胞治疗技术，过继性免疫细胞治疗是指将体 外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞的治疗方法， 具体包括以下几种：
[0004] CIK(cytokine-induced killer,多种细胞因子诱导的杀伤细胞），是将人外周血 单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-Y等）共同培养 诱导，而获得的一群⑶3+⑶56+为主的异质细胞，以及少量以⑶3+⑶8+为主的细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)，因此CIK是含有至少上述细胞表型特征的细胞 群。由于该群细胞的主体同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样 T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点。
[0005] DC-CIK技术，是利用树突状细胞（Dendritic cells，DC)和CIK两种细胞联合协 同治疗肿瘤。用肿瘤细胞或肿瘤抗原致敏患者外周血提取分化培养的DC，并与前述所得的 CIK共培养，从而使DC提呈肿瘤抗原给CIK，增强CIK对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤效 力，从而提1?治疗效果。
[0006] DC-CTL技术，是利用DC和抗肿瘤效应细胞（T淋巴细胞）两种细胞联合协同治疗 肿瘤。通过DC的抗原递呈，激活T淋巴细胞，生成机体抗肿瘤最重要的并赋予抗肿瘤特异 性的效应细胞一细胞毒性T淋巴细胞（CTL)。CTL识别递呈发生在肿瘤细胞表面并与Main histologic complex (MHC)-I类分子结合的抗原肽片段，通过分泌型杀伤（胞吐颗粒释放 效应分子如穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素、TNF相关蛋白等引起靶细胞裂解或凋亡）或非分泌 型杀伤（表达FasL和TRAIL与靶细胞表面的相应受体分子结合，启动信号转导途径而诱导 凋亡）途径杀伤肿瘤细胞。DC-CTL技术的典型实施方法之一是用病毒技术进行基因转导。
[0007] Bi_CIK(双特异性抗体装备的CIK)技术，是以单抗结合免疫细胞治疗为基础靶向 引导CIK (cytokine-induced killer,多种细胞因子诱导的杀伤细胞）治疗肿瘤，选用两个 特异性抗体在体外进行化学交联成特异性双抗（bi-specific antibodies，BiAb)，同时对肿 瘤患者自体外周血单核细胞依次进行分离、培养、扩增成CIK，并与BiAb结合后回输患者体 内。其中的一个抗体结合细胞作为效应细胞一T细胞，而另一个抗体为肿瘤特异性抗原抗 体，结合携带特异性表面抗原的靶细胞一肿瘤细胞，从而靶向地将效应细胞（T细胞）和靶 细胞（肿瘤细胞）结合对肿瘤进行靶向杀伤，达到治疗恶性肿瘤的目的。
[0008] 但是，以上临床常用的过继性肿瘤免疫细胞治疗技术存在以下技术问题及缺陷：
[0009] CIK技术：非靶向性杀伤作用，杀瘤活性相对较低，即使大剂量使用CIK，也仅能达 到很有限的抗肿瘤疗效。
[0010] DC-CIK技术：肿瘤抗原的来源存在一定的困难，需要从患者肿瘤组织中提取；肿 瘤抗原免疫原性较弱，诱导的CIK细胞靶向性弱；CIK杀瘤活性相对较低。
[0011] DC-CTL技术：肿瘤抗原免疫原性较弱，诱导的CTL细胞靶向性弱，肿瘤特异性杀伤 效应较低；存在MHC限制性，MHC代表个体特异性的同种异型抗原称移植抗原或组织相容性 抗原，其中能引起强而迅速排斥反应的抗原称主要组织相容性抗原。一方面，MHC分子直接 参与抗原提呈细胞（APC)对内源性或外源性抗原的提呈；另一方面，在TCR特异性识别APC 所提呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的MHC分子，才能产生T细胞 激活信号，即MHC限制性。
[0012] Bi-CIK技术：单靶向性杀伤作用，CIK杀瘤活性相对较低。
[0013] 综上所述，虽然肿瘤免疫细胞治疗技术发展迅速，但现有技术仍然存在着不同程 度的缺陷。CIK肿瘤杀伤效应低，靶向性不明显，DC的联合和DC-CTL技术能在一定程度 上呈递肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs)，不过多祀向特异性杀瘤作用 仍受到限制，而多靶点作用能针对性地解决肿瘤通过下调一些TAAs的表达降低其免疫原 性的免疫逃逸；CTL虽具有特异性和相对较高效的杀瘤效应，但存在MHC限制性，据报道 25%-75%的肿瘤细胞有不同形式的人白细胞抗原（HLA)表型改变，导致免疫识别障碍， 为肿瘤免疫逃逸的主要原因之一；此外，CTL的特异性杀伤效应虽然相对较高，但有限的靶 向性只能杀死小部分肿瘤细胞，这些缺陷都严重限制了以CTL为基础的肿瘤免疫治疗的疗 效。因此，增强针对肿瘤细胞的靶向杀伤效应、提高对肿瘤细胞的多靶点作用、克服肿瘤免 疫逃逸等已成为现有肿瘤免疫细胞治疗技术需改进的技术热点及难点。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的在于提供一种具有双特异性抗体的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)及其制备方法，以及其在制备增强特异性细胞毒性T淋巴 细胞（CTL)的免疫杀伤效应的药物中的应用。
[0015] 本发明所提供的具有双特异性抗体的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，是由CD3单抗与 针对肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs)的任意抗体组合为双特异性抗体 装备CTL细胞得到的，命名为CTL(BiAT)细胞。
[0016] 所述⑶3单抗是一类抗人T淋巴细胞⑶3抗原的单克隆抗体，可作为一种免疫 调节剂对T细胞的多种功能产生调节作用，它与IL-2具协同作用，诱导T细胞扩增，增强 细胞毒活性，具体可为兔抗人CD3单抗、鼠抗人CD3单抗等，优选为鼠抗人CD3单克隆抗体 (0KT3)。
[0017] 所述TAAs(tumor-associated antigens, TAAs，肿瘤相关抗原）是指在肿瘤发 生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质，具体可为AFP、CEA、Survivin、Telomerase、 Tyrosinase、P53、EpCAM、LAMP2、PSA、PAP、PSMA、VLH、CAIX、Gastrin-17、NY-ESO-1、gplOO、 CK19、CA19-9、CA125、CA15-3、CA242、CA50、K-ras、HER2、c-myc、Bcl-2、c-Met、CD20、HAbl8G、 EGFR、VEGF-A、MAGE、MACC1、MTA1、MART-1等，针对不同肿瘤的特异性表达选择其中的一种 或多种。
[0018] 本发明还提供一种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)的制备方法，包括以下步 骤：
[0019] 1)将⑶3单抗和一种或多种针对TAAs的单克隆抗体等摩尔比混匀，结合产生双特 异性抗体BiAb ;
[0020] 2)将特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)加入双特异性抗体BiAb中孵育进行装备， 得到具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)。
[0021] 在上述制备方法中，所述步骤1)中的CD3单抗具体可为兔抗人CD3单抗、鼠抗人 CD3单抗等，优选为鼠抗人CD3单克隆抗体（0KT3)。
[0022] 其中一个实施例步骤2)中针对TAAs的单克隆抗体可为鼠抗人的HER2单克隆抗 体（Herceptin，赫赛汀）和EGFR单克隆抗体（Cetuximab，爱必妥）。
[0023] 所述步骤2)中的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的获得方法可包括以下步骤：
[0024] 2. 1) DC培养及抗原负载
[0025] 将单个核细胞（PBMC)在无血清培养基中中孵育，分离贴壁细胞（DC前体细胞） 和悬浮细胞（T淋巴细胞，非特异性），悬浮细胞转移至另外的细胞培养瓶中备用；贴壁细 胞中加入重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(recombinant human interleukin-4, rhIL-4)，刺激细胞向DC (树突状细胞）分化；收获未成熟的树突状细胞， 加入根据特定肿瘤组合（恶性胶质瘤：ffiR2、TRP-2、gplOO、MAGE-1、AM-2 ;乳腺癌：HER2、 CA15-3、EpCAM、MUCl ;胃癌：Gastrin-17、HER2、CA50、P53、CEA)的化学合成的 TAA 表位肽， 孵育刺激抗原特异性的DC产生；在培养的第7d，加入肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor- a )刺激DC成熟时后收获DC ;
[0026] 所述化学合成的 TAA 表位肤，可为 AFP、CEA、Survivin、Telomerase、Tyrosinase、 P53、EpCAM、LAMP2、PSA、PAP、PSMA、VLH、CAIX、Gastrin-17、NY-ES0-l、gpl00、CK19、CA19-9、 CA125、CA15-3、CA242、CA50、K-ras、HER2、c-myc、Bcl-2、c-Met、CD20、HAbl8G、EGFR、VEGF-A、 MAGE、MACC1、MTA1、MART-1中的一种或多种；其中一个实施例选用HER2和EGFR表位肽； [0027] 2. 2)DC与T淋巴细胞共培养及冻存
[0028] 将收获的DC与收集备用的T淋巴细胞共培养，在第3天，更换新鲜无血清培养基， 加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA)和重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)继续培养， 收获细胞，即CTL细胞。
[0029] 所述步骤2)中用鼠抗人的HER2单克隆抗体（Here印tin，赫赛汀）和EGFR 单克隆抗体（Cetuximab，爱必妥）制备的双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)可命名为 CTL(BiAT-HER2/EGFR)。
[0030] 所述双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)在制备增强特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的免疫杀伤效应的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0031] 所述双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)在制备针对恶性肿瘤的靶向免疫细胞治疗 或传染病治疗药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0032] 本发明适用于针对恶性肿瘤的靶向免疫细胞治疗，所述恶性肿瘤包括鼻咽癌（腺 癌）、肺癌、食道癌（腺癌）、胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌（腺癌）、肾癌、膀胱癌、前列腺 癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、恶性胶质瘤、头颈部鳞 状细胞癌、颅脑恶性肿瘤等。
[0033] 本发明提供了一种具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)及其制备方法与应用。本 发明联合利用多种肿瘤相关抗原表位肽刺激DC诱导产生靶向特异性CTL和肿瘤相关抗原 抗体（一种或多种）的靶向结合，通过双重机理来确保CTL细胞的靶向作用，增加了 CTL细 胞作用的靶点数量，进一步提高了 CTL细胞免疫效应的靶向性，能更高效地杀伤肿瘤细胞。 [0034] 本发明较现有技术具有以下有益效果：
[0035] 1、与现有技术比较，本发明首次公开了双特异抗体技术只有与具有特异杀伤作用 的CTL相结合，才会使后者的效能产生飞跃式提高（见实施例2相关数据分析），而其它非 特异性杀伤的细胞如CIK细胞或其它各种非特异性免疫细胞则不能产生如此巨大的效能 提升作用。这一意外发现，有其特殊的机制机理，无法用双特异性抗体结合CIK细胞或其它 非特异性免疫细胞增加效能的同一机制进行解释。
[0036] 2、本发明将围绕着双特异性抗体与特异性CTL结合用于治疗肿瘤和传染病的应 用展开。本发明所阐述的细胞，必须是特异性的CTL，必须排除非特异免疫细胞，包括CIK、 NK、非特异性T淋巴细胞等。
[0037] 3、本发明阐述了联合利用多种肿瘤相关抗原表位肽刺激DC诱导产生靶向特异性 CTL和肿瘤相关抗原抗体（一种或多种）的靶向结合，通过双重机理来确保CTL的靶向作 用，增加了 CTL作用的靶点数量，进一步提高了 CTL免疫效应的靶向性，其多靶点作用在一 定程度上克服了肿瘤通过下调一些TAAs的表达而降低其免疫原性的免疫逃逸，而抗原抗 体靶向结合克服了因MHC限制性导致免疫识别障碍的肿瘤免疫逃逸机制，更高效地杀伤肿 瘤细胞。
[0038] 4、本发明阐述了用一种或多种双特异性抗体装备通过多种肿瘤相关抗原表位肽 诱导的特异性CTL，具有比现有CIK、DC-CIK、DC-CTL、Bi-CIK等技术倍增的强效杀瘤作用， 是一种更为先进的、低成本的肿瘤治疗方法。
[0039] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为培养收获的成熟DCs细胞形态
[0041] 图2为流式细胞仪检测CTL表达的IFN- y、CD8、CD69
[0042] 图 3-1 为 CTL、CD3-CTLs、Bi-CIK (HER2)、CTL (BiAT-HER2)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR) 与人乳腺腺癌细胞SK-BR-3 (T)共培养分泌IL-2、TNF- a、IFN- Y和GM-CSF的检测结果
[0043] 图 3-2 为 CTL、CD3-CTLs、Bi-CIK (HER2)、CTL (BiAT-HER2)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR) 与人恶性胶质瘤细胞A-172 (T)共培养分泌IL-2、TNF- a、IFN- y和GM-CSF的检测结果
[0044] 图 3-3 为 CTL、CD3-CTLs、Bi-CIK (HER2)、CTL (BiAT-HER2)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR) 与人胃癌细胞SGC-7901 (T)共培养分泌IL-2、TNF- a、IFN- y和GM-CSF的检测结果
[0045] 图 4-1 为 CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-HER2/EGFR)、Bi-CIK (HER2)、CTL 和 CIK 对 乳腺腺癌细胞SK-BR-3的杀伤作用
[0046] 图 4-2 为 CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-HER2/EGFR)、Bi-CIK (HER2)、CTL 和 CIK 对 人恶性胶质瘤细胞A-172的杀伤作用
[0047] 图 4-3 为 CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-HER2/EGFR)、Bi-CIK (HER2)、CTL 和 CIK 对 人胃癌细胞SGC-7901的杀伤作用
[0048] 图 5 为 CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-EGFR)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR)对人胃癌细胞 SGC-7901的杀伤作用
[0049] 图 6 为 CIK、Bi-CIK (HER2)、CTL、CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-HER2/EGFR)对荷瘤 小鼠的肿瘤抑制作用
[0050] 图 7 为 CIK、Bi-CIK (HER2)、CTL、CTL (BiAT-HER2)、CTL (BiAT-HER2/EGFR)对荷瘤 小鼠生存期的影响
【具体实施方式】
[0051] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)〇
[0052] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量（W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、 质量/体积（W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/100mL)百分比浓 度。
[0053] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0054] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0055] 实施例1、制备具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)
[0056] 制备具有双特异性抗体的细胞CTL (BiAT)，包括以下步骤：
[0057] 1)将⑶3单抗和一种或多种针对TAAs的单克隆抗体等摩尔比混匀，结合产生双特 异性抗体BiAb ;
[0058] 2)将特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)加入双特异性抗体BiAb中孵育进行装备， 得到具有双特异性抗体的细胞CTL (BiAT)。
[0059] 一、制备特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)
[0060] 所述步骤2)中的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的获得方法可包括以下步骤：
[0061] 2. 1、DC培养及抗原负载
[0062] 将单个核细胞（PBMC)通过白细胞单采技术收集后重悬于无血清培养基（购自 尼普洛公司）中，置于37°C、5% C02浓度的培养箱中孵育3h，分离贴壁细胞（DC前体细 胞）和悬浮细胞（T淋巴细胞，非特异性），悬浮细胞转移至另外的细胞培养瓶中备用。 培养于RPMI 1640的贴壁细胞中加入重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte - macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF) lOOOU/mL 和重组人白 细胞介素 _4 (recombinant human interleukin-4, rhIL-4) 500U/mL，刺激细胞向 DC (树突状 细胞）分化；根据生长情况每2-3d进行一次半量换液；在培养的第6d，收获未成熟的DC(树 突状细胞），加入根据特定肿瘤组合（恶性胶质瘤：ffiR2、TRP-2、gpl00、MAGE-l、AM-2 ;乳腺 癌：冊1?2、〇六15-3、￡?〇六1、]\^(：1;胃癌：6&8^^11-17、冊1?2、〇六50、？53、〇￡六）的化学合成的丁八八 表位肽（约10 6/mL DCs加入每种表位肽10 y g/mL)，置于37°C、5% C02浓度的培养箱中孵育 16-20h，刺激抗原特异性的DC产生；在培养的第7d，加入50ng/mL肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a )刺激DC成熟；24小时后收获DC (图1)。
[0063] 其中，单个核细胞可从血液中分离得到，血液可以为外周血或脐带血，可以为自体 外周血或异体脐带血，上述血液来源可从商用或公开渠道获得，例如血站、血库、脐带血库， 或直接使用可商业利用的单个核细胞。
[0064] 该步骤中提到的化学合成的TAA表位肽，可为AFP、CEA、Survivin、Telomerase、 Tyrosinase、P53、EpCAM、LAMP2、PSA、PAP、PSMA、VLH、CAIX、Gastrin-17、NY-ES0-1、gplOO、 CK19、CA19-9、CA125、CA15-3、CA242、CA50、K-ras、HER2、c-myc、Bcl-2、c-Met、CD20、HAbl8G、 EGFR、VEGF-A、MAGE、MACC1、MTA1、MART-1等TAAs，针对不同肿瘤的特异性表达选择其中的 一种或多种。本实施例采用HER2和EGFR表位肽。
[0065] 2. 2、DC与T淋巴细胞共培养及冻存
[0066] 2.2. 1、将收获的DC与前面收集备用的T淋巴细胞（非特异性）按数量比1 :25共 培养，在第3天，更换新鲜无血清培养基（购自尼普洛公司），加入终浓度为20IU的植物血 凝素（phytohemagglutinin，PHA)和终浓度为300IU的重组人白细胞介素-2(rhIL_2)继续 培养4天，收获细胞，即CTL细胞（细胞毒性T淋巴细胞（c ytotoxic lymphocyte, CTL)，是 白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿 瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。），通过流式细胞仪检测其表达的IFN- Y高于30 %、CD69 高于50%、⑶8高于40% (图2)，表明获得了 CTL细胞。
[0067] 2. 2. 2、冻存：将CTLs收获洗涤后悬于10% DMS0和20%白蛋白或自体血楽，程序 降温后，贮存于液氮。最终冻存品中，不得含有外源性rhIL-2、PHA或其它培养用试剂。
[0068] 二、制备双特异性抗体（BiAb)
[0069] 1、取鼠抗人⑶3单克隆抗体（0KT3,购自Hyskill公司）lmg溶解于超过其5倍摩 尔浓度的交联剂Traut's试剂（购自Sigma公司）lmL,室温下反应1小时后通过ro-10层 析柱（购自尼普洛公司）过滤纯化，去除未结合的单抗和化学交联剂。
[0070] 2、将鼠抗人的HER2单克隆抗体（Here印tin，赫赛汀）或EGFR单克隆抗体 (Cetuximab，爱必妥）lmg溶解于超过其4倍摩尔浓度的Sulfo-SMCC交联剂（购自Sigma 公司）lmL，室温下反应1小时后通过ro-10层析柱过滤纯化，去除未结合的单抗和化学交 联剂。
[0071] 此步骤中的单克隆抗体可为针对TAAs的任一抗体，如⑶20(Rituximab，美罗华）、 VEGF_A(Avastin，安维汀）、ER_EGFR(Nimotuzumab，泰欣生）、HAbl8G(Metuximab，利卡汀） 等，本实施例选用针对HER2的单克隆抗体（Here印tin，赫赛汀）和针对EGFR的单克隆抗体 (Cetuximab，爱必妥）。
[0072] 3、将以上经处理已交联的⑶3单抗和HER2单抗（或EGFR单抗）等摩尔比混匀， 于4°C结合一晚后产生双特异性抗体（BiAb-HER2或BiAb-EGFR)。
[0073] 三、用双特异性抗体（BiAb)修饰CTL和CIK
[0074] 1、用双特异性抗体（BiAb)修饰CTL
[0075] 将步骤一收获冻存的CTLs进行复苏，洗涤，重悬于含2%白蛋白的血浆注射液，以 100ng BiAb/106 CTLs的浓度加入步骤二产生的Traut' s试剂交联的CD3单抗，或步骤二产 生的 BiAb-HER2 或 BiAb-EGFR，或 BiAb-HER2 和 BiAb-EGFR (各 50ng BiAb/106CTLs)，混匀 后置于离心管4°C孵育1小时进行装备。用2%白蛋白的血浆注射液2次洗脱未结合的游 离抗体，装备好的 CTL (CD3-CTLs 或 MAT-HER2 或 BiAT-EGFR 或 MAT-HER2/EGFR)转入输注 袋备用，将用双特异性抗体（BiAb)装备的CTL细胞统一命名为CTL(BiAT)。
[0076] 该步骤CTL装备过程中，可根据将要治疗肿瘤所特异性表达的TAAs加入一种或多 种BiAb，多种BiAb装备的BiAT具备多靶点作用效应。
[0077] 2、用双特异性抗体（BiAb)修饰CIK
[0078] 通过白细胞单采技术收集的PBMC按2X106/mL密度接种于含有100IU/mL的白细 胞介素 _2(IL_2, Chiron Corp.，Emeryville, CA)无血清培养基（购自尼普洛公司）中，添 加终浓度为100IU青霉素、100IU链霉素和2mM L-谷氨酰胺置于37°C、5% C02浓度的培养 箱中培养24小时，加入10ng/mL可溶性的鼠抗人的0KT3,培养14天后，收获CIK细胞，收 获的细胞经流式细胞仪检查⑶3阳性细胞彡85%，⑶3和⑶8双阳性细胞彡60%，⑶3和 CD56双阳性细胞彡20%。用PBS洗涤CIK细胞2次，加入步骤三制备的BiAb-HER2(100ng BiAb/10 6 CIK)，混匀后静置于离心管4°C孵育1小时，PBS洗涤2次洗脱未结合的游离抗体， 收获细胞，将用双特异性抗体（BiAb)装备的CIK细胞统一命名为CIK(BiAT)或Bi-CIK。
[0079] 四、ELISA 检测 BiAT 细胞分泌 IL-2、TNF- a、IFN- Y 和 GM-CSF 情况
[0080] 人乳腺腺癌细胞SK-BR-3或人恶性胶质瘤细胞A-172或人胃癌细胞SGC-7901以 2X 105的密度接种于24孔板的每个培养孔，于37°C培养12小时。第二天将步骤一收获冻 存的CTLs (未装备的CTLs)或步骤三收获的CD3-CTLs、Bi-CIK(HER2)和CTL(BiAT-HER2)作 为效应细胞，分别以2 X 106/孔加到培养好的肿瘤细胞（SK-BR-3或A-172或SGC-7901)中， 保持每孔培养液2mL，继续培养24小时。每个培养孔的上清汇集以ELISA (R&D pharmingen) 检测IL-2、TNF-a、IFN-r和GM-CSF的分泌量。未加入效应细胞之前，肿瘤细胞培养液中各 细胞因子含量少于5pg。
[0081] 结果显示CTL(BiAT-HER2)与肿瘤细胞共培养能显著增加四种细胞因子的分泌 (图 3_1，3_2，3_3)。
[0082] 图 3-1 表明 CD3-CTLs、Bi-CIK(HER2)、CTL(BiAT-HER2)和 CTL(BiAT-HER2/EGFR) 与肿瘤细胞SK-BR-3共培养24小时，加入CTL (BiAT-HER2)和CTL (BiAT-HER2/EGFR)的培养 液上清中GM-CSF含量显著升高，达3400pg/106细胞、3673pg/10 6细胞，IL-2、TNF- a、IFN-r 亦有不同程度的升高。〇1(8丨4!'-册1?2/^6?1〇相比(：11(8141'-册1?2)11-2、了呖-〇、正^1'和 GM-CSF的分泌量明显增强。
[0083] 图 3-2 表明 CD3-CTLs、Bi-CIK(HER2)、CTL(BiAT-HER2)和 CTL(BiAT-HER2/EGFR) 与肿瘤细胞A-172共培养24小时，加入CTL(BiAT-HER2)和CTL(BiAT-HER2/EGFR)的培养 液上清中IFN-r含量显著升高，达1400pg/10 6细胞、1518pg/106细胞，GM-CSF、IL-2、TNF-a 亦有不同程度的升高。〇1(8丨4!'-册1?2/^6?1〇相比(：11(8141'-册1?2)11-2、了呖-〇、正^1'和 GM-CSF的分泌量明显增强。
[0084] 图 3-3 表明 CD3-CTLs、Bi-CIK(HER2)、CTL(BiAT-HER2)和 CTL(BiAT-HER2/EGFR) 与肿瘤细胞 SGC-7901 共培养 24 小时，加入 CTL(BiAT-HER2)和 CTL(BiAT-HER2/EGFR)的 培养液上清中GM-CSF、IL-2、TNF-a、IFN-r含量均显著升高，其中加入CTL(BiAT-HER2)的 培养液上清中分别达1800pg/10 6细胞、2750pg/106细胞、1960pg/106细胞、2580pg/10 6细 胞。加入CTL(BiAT-HER2/EGFR)的培养液上清中分别达1950pg/106细胞、2820pg/10 6细 胞、2100pg/106 细胞、2730pg/106 细胞。CTL(BiAT-HER2/EGFR)相比 CTL(BiAT-HER2) IL-2、 TNF- a、IFN-r和GM-CSF的分泌量明显增强。
[0085] 实施例2、具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)的抑瘤效果
[0086] 一、具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)的体外肿瘤细胞靶向杀伤作用
[0087] 以HER2⑴的乳腺腺癌细胞SK-BR-3、人恶性胶质瘤细胞A-172、人胃癌细 胞SGC-7901和HER2 (-)的肝细胞癌细胞H印3B为靶细胞，以CTL、CTL(BiAT-HER2)、 CTL(BiAT-HER2/EGFR)、CIK和Bi-CIK(HER2)为效应细胞，以T淋巴细胞和PBS作为对照。 将靶细胞4X 103/孔接种于96孔板中，于37°C、5% C02培养箱中过夜培养，第二日以效靶 比10:1、20:1、40:1、60:1分别加入各种效应细胞，于37°C、5% C02培养箱中共同孵育24h， 加入MTS 20 ill/孔，置于37°C、5% C02培养箱中孵育4h，酶标检测仪检测波长495nm的光 密度（0D)值，杀伤率（％ ) = [PBS对照组0D值-(不同效靶比实验组0D值-T淋巴细胞对 照组0D值）]/PBS对照组0D值X 100 %。
[0088] 这里，CIK为非靶向性，CTL为表位肽诱导的多靶点，Bi-CIK为抗原抗体结合的单 靶点，BiAT-HER2、BiAT-HER2/EGFR为CTL多靶点的基础上再添加了抗原抗体结合的靶向 性。
[0089] 结果显示 CTL (BiAT-HER2)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR)细胞对 HER2 (+)的 SK-BR-3、 八-172及56(：-7901细胞的杀伤作用比(：11、(：11(、81-(：11((冊1?2)细胞显著增强（图4-1，4-2， 4-3)，且 CTL(BiAT-HER2/EGFR)相比 CTL(BiAT-HER2)杀伤作用明显增强，而对 HER2(_)的 Hep3B细胞没有显著的杀伤作用，表明CTL (BiAT-HER2)细胞对肿瘤的杀伤作用具有HER2特 异性。
[0090] 图4-1显示，效应细胞对乳腺腺癌细胞系SK-BR-3的杀伤率在效靶比为40:1时 效果最为显著，其中 CTL(BiAT-HER2)组为 69. 7%，Bi-CIK(HER2)组为 32. 13%，CTL 组为 20. 17%，CIK组为10%。据此可见CIK、CTL、Bi-CIK(HER2)的杀伤效力依次递增约10% 左右，而 CTL(BiAT-HER2)较 Bi-CIK(HER2)效力增强了 30% 以上，CTL(BiAT-HER2/EGFR)较 Bi-CIK (HER2)效力增强了 35%以上。
[0091] 图4-2显示，效应细胞对人恶性胶质瘤细胞A-172的杀伤率在效靶比为80:1时 效果最为显著，其中 CTL(BiAT-HER2)组为 57.43%，Bi-CIK(HER2)组为 31.33%，CTL 组 为25.67%，CIK效应细胞组基本不产生抑瘤效果。Bi-CIK(HER2)较CTL的杀伤作用提 升不到 10 %，而 CTL(BiAT-HER2)较 Bi-CIK(HER2)提升 26 %，CTL(BiAT-HER2/EGFR)较 Bi-CIK (HER2)提升 30%。
[0092] 图4-3显示，效应细胞对人胃癌细胞SGC-7901的杀伤率在效靶比为40:1时效 果最为显著，其中 CTL(BiAT-HER2)组为 72.83%，Bi-CIK(HER2)组为 45.57%，CTL 效应 细胞组为35. 1%，CIK效应细胞组基本不产生抑瘤效果。Bi-CIK(HER2)较CTL的杀伤作 用提升 10 %，而 CTL(BiAT-HER2)较 Bi-CIK(HER2)提升 27 %，CTL(BiAT-HER2/EGFR)较 Bi-CIK(HER2)效力提升 32%。
[0093] 以人胃癌细胞 SGC-7901 为靶细胞，以 CTL(BiAT-HER2)、CTL(BiAT-EGFR)、 CTL (BiAT-HER2/EGFR)为效应细胞，以T淋巴细胞和PBS作为对照，靶效比40:1，参照以 上同样方法进行细胞杀伤实验。结果显示CTL(BiAT-HER2/EGFR)对SGC-7901细胞杀伤 作用比 CTL(BiAT-HER2)、CTL(BiAT-EGFR)增强（图 5)。图 5 显示，CTL(BiAT_HER2)和 CTL(BiAT-EGFR)为CTL多靶点的基础上添加了抗原抗体结合的单靶点；CTL(BiAT-HER2/ EGFR)为CTL多靶点的基础上添加了抗原抗体结合的双靶点，说明多靶点的可行性和效力 增强。
[0094] 二、具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)对荷瘤小鼠肿瘤的杀伤作用
[0095] 将 1 X 106 的 CIK、Bi-CIK (HER2)、CTL、CTL (BiAT-HER2)和 CTL (BiAT-HER2/EGFR) 经尾静脉注射于乳腺癌MDA-MB-231荷瘤SCID小鼠各两组，以生理盐水为对照组，每周注射 2次，连续2周。
[0096] 一组群于治疗后20天时，杀死荷瘤小鼠取出肿瘤称重。结果显示， CTL(BiAT-HER2/EGFR)、CTL(BiAT-HER2)、Bi-CIK (HER2)、CTL 对肿瘤生长有一定的抑制作 用，其中CTL(BiAT-HER2/EGFR)、CTL(BiAT-HER2)抑制肿瘤生长效应显著（表1，图6)。
[0097] 另一组群监测SCID小鼠存活期，所有对照组小鼠均在22天内、所有CIK组小鼠 均在30天内死于肿瘤进展，至第50天时，CTL(BiAT-HER2/EGFR)组小鼠死亡率为42%， CTL(BiAT-HER2)组小鼠死亡率为53%，Bi-CIK(HER2)组小鼠死亡率为75%，CTL组小鼠 死亡率为86 %，至第100天时，仍有42 %的CTL (BiAT-HER2/EGFR)组小鼠存活，30 %的 CTL(BiAT-HER2)组小鼠存活（图7)。
[0098] 表 1 CIK、Bi-CIK(HER2)、CTL、CTL(BiAT-HER2)和 CTL(BiAT-HER2/EGFR)对荷瘤 小鼠的瘤重抑制率
【权利要求】
1. 一种具有双特异性抗体的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，是由CD3单抗与针对肿瘤相 关抗原（tumor-associated antigens, TAAs)的任意抗体组合为双特异性抗体装备CTL细 胞得到的，命名为CTL(BiAT)细胞。
2. 根据权利要求1所述的具有双特异性抗体的细胞CTL (BiAT)，其特征在于：所述CD3 单抗是一类抗人T淋巴细胞CD3抗原的单克隆抗体，可作为一种免疫调节剂对T细胞的多 种功能产生调节作用，它与IL-2具协同作用，诱导T细胞扩增，增强细胞毒活性，具体可为 兔抗人CD3单抗、鼠抗人CD3单抗等，优选为鼠抗人CD3单克隆抗体（0KT3)。
3. 根据权利要求1或2所述的具有双特异性抗体的细胞CTL (BiAT)，其特征在于：所 述TAAs (tumor-associated antigens, TAAs,肿瘤相关抗原）是指在肿瘤发生、发展过程 中新出现或过度表达的抗原物质，具体可为AFP、CEA、Survivin、Telomerase、Tyrosinase、 P53、EpCAM、LAMP2、PSA、PAP、PSMA、VLH、CAIX、Gastrin-17、NY-ES0-l、gpl00、CK19、CA19-9、 CA125、CA15-3、CA242、CA50、K-ras、HER2、c-myc、Bcl-2、c-Met、CD20、HAbl8G、EGFR、VEGF-A、 MAGE、MACC1、MTA1、MART-1等，针对不同肿瘤的特异性表达选择其中的一种或多种。
4. 一种制备权利要求1-3任一所述具有双特异性抗体的CTL细胞的方法，包括以下步 骤： 1) 将CD3单抗和一种或多种针对TAAs的单克隆抗体等摩尔比混匀，结合产生双特异性 抗体BiAb ; 2) 将特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)加入双特异性抗体BiAb，孵育进行装备，得到 具有双特异性抗体的细胞CTL (BiAT)。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的CD3单抗具体可为 兔抗人CD3单抗、鼠抗人CD3单抗等，优选为鼠抗人CD3单克隆抗体（0KT3)。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：其中一个实施例步骤2)中针对TAAs 的单克隆抗体可为鼠抗人的J1ER2单克隆抗体（Here印tin，赫赛汀）和EGFR单克隆抗体 (Cetuximab，爱必妥）。
7. 根据权利要求4或5或6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的特异性细 胞毒性T淋巴细胞（CTL)的获得方法包括以下步骤： 2. 1) DC培养及抗原负载 将单个核细胞（PBMC)在无血清培养基中中孵育，分离贴壁细胞（DC前体细胞）和 悬浮细胞（T淋巴细胞，非特异性），悬浮细胞转移至另外的细胞培养瓶中备用；贴壁细 胞中加入重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(recombinant human interleukin-4, rhIL-4)，刺激细胞向DC (树突状细胞）分化；收获未成熟的树突状细胞， 加入根据特定肿瘤组合（恶性胶质瘤：ffiR2、TRP-2、gplOO、MAGE-1、AM-2 ;乳腺癌：HER2、 CA15-3、EpCAM、MUCl ;胃癌：Gastrin-17、HER2、CA50、P53、CEA)的化学合成的 TAA 表位肽， 孵育刺激抗原特异性的DC产生；在培养的第7d，加入肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor- a )刺激DC成熟时后收获DC ; 所述化学合成的 TAA 表位肤，可为 AFP、CEA、Survivin、Telomerase、Tyrosinase、P53、 EpCAM、LAMP2、PSA、PAP、PSMA、VLH、CAIX、Gastrin-17、NY-ESO-1、gplOO、CK19、CA19-9、 CA125、CA15-3、CA242、CA50、K-ras、HER2、c-myc、Bcl-2、c-Met、CD20、HAbl8G、EGFR、VEGF-A、 MAGE、MACC1、MTA1、MART-1 中的一种或多种； 2. 2)DC与T淋巴细胞共培养及冻存 将收获的DC与收集备用的T淋巴细胞共培养，在第3天，更换新鲜无血清培养基，加入 植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA)和重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)继续培养，收获 细胞，即CTL细胞。
8. 权利要求1-3任一所述具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)在制备增强特异性细胞 毒性T淋巴细胞（CTL)的免疫杀伤效应的药物中的应用。
9. 权利要求1-3任一所述具有双特异性抗体的细胞CTL(BiAT)在制备针对恶性肿瘤的 靶向免疫细胞治疗或传染病治疗药物中的应用。
10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤包括鼻咽癌（腺癌）、 肺癌、食道癌（腺癌）、胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌（腺癌）、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、恶性胶质瘤、头颈部鳞状 细胞癌、颅脑恶性肿瘤等。
【文档编号】A61K35/15GK104450615SQ201410495045
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】胡祥, 孙平, 刘沐芸, 丁长才, 张芸 申请人:深圳市北科生物科技有限公司