共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体及其制备方法与应用，另外也涉及一种结构新颖的增敏剂3-(2-噻吩基)苯并[5,6]香豆素。本发明的制备过程简单快捷，原料易得，所制备的PTX/ThBC纳米脂质体粒径较均一，稳定性佳，包封率≥94%。该制剂相对于传统的PTX注射液，具有明显的缓释性能，毒副作用降低；相对于已有的PTX纳米脂质体，由于ThBC的增敏作用，对肿瘤细胞，如HeLa细胞增殖抑制活性更佳。
【专利说明】共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗肿瘤药，具体涉及一种共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备 方法与应用。另外也涉及一种结构新颖的增敏剂3-(2-噻吩基）苯并[5, 6]香豆素。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇（Pac I i taxe 1，或Taxo 1，缩写PTX )，最初是由两位美国化学家Wani和 Wall于1963年从生长在美国西部大森林中的一种被称为太平洋杉的树皮和木材中分 离得到，并发现它具有广泛的抗恶性肿瘤作用（Wani MC，Taylor HL，Wall ME，ei a人 Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc, 1971， 93(9): 2325- 2327.)。该活性成分在植物中含量极低，直到1971年，通过X-射线衍射分 析才确定了其结构。1994年7月，美国FDA批准PTX作为一种新型抗微管、抗癌药物进入市 场。现已作为治疗多种肿瘤，如乳腺癌、非小细胞肺癌和卵巢癌等的一线用药，对宫颈癌、大 肠癌、原发性肝癌、直肠癌也有比较显著的疗效。研究发现，PTX与β微管蛋白结合，影响 α、β微管蛋白二聚体与微管间的动态平衡，促进微管蛋白组装成微管，并使已组装的微 管凝结、聚集，阻滞其解聚成亚单位，使细胞周期停滞于G 2/M期（Rowinsky EK, Donehower RC. Paclitaxel (taxol). N Engl J Med, 1995, 332(15): 1004-1014. )〇
[0003] 然而，PTX难溶于水（〈0· 3 μ g/mL)，制成注射剂有一定的困难（Kakinoki A, Kaneo Y, Tanaka T, et al. Synthesis and evaluation of water-soluble poly (vinyl alcohol)-paclitaxel conjugate as a macromolecular prodrug. Biol Pharm Bull, 2008，31(5): 963-969.)。目前临床使用的PTX注射液有国产的紫素，泰素，进口的紫 杉醇注射液（美国BMS公司），Anzatax (澳大利亚Fauliding公司）等产品，这些产 品均采用了表面活性剂增溶法，即以非离子表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL) 与乙醇以1 : 1的比例组成的混合液来稳定和溶解制剂中的PTX，解决PTX不溶于水的 缺点，达到静脉给药目的（Zhang JA, Anyarambhatla G, Ma L, ei a人 Development and characterization of a novel Cremophor EL free liposome-based paclitaxel (LEP-ETU) formulation. 2005，59(1): 177-187·)。但是，该剂 型伴随很多难以解决的临床问题：（1)由于聚氧乙烯蓖麻油会引起体内组胺释放，产生过 敏反应、超过敏反应，如出现药物性皮疹，呼吸急促，支气管痉挛，低血压等。有超过2 %的严 重过敏反应发生而引起死亡。（2)PTX的聚氧乙烯蓖麻油溶液存在稳定性和相容性的问题， 如药物一经稀释PTX就易发生沉淀。（3)制剂使用过程繁琐，病人顺应性差。（4) PTX利用 率低，靶向性差，有一定的神经毒性。由于这类PTX制剂缺乏靶向性，易造成药物全身分布 引起全身毒性；为了能够清除肿瘤细胞或病灶，不得不加大给药剂量，导致毒副作用增加。 因此临床上迫切需要研制出不含聚氧乙烯蓖麻油的PTX新型给药系统，以克服目前PTX剂 型的缺陷。
[0004] 香豆素类化合物广泛存在于天然产物及合成药物中，具有多种生理活性，例如：抗 炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等作用（Riveiro ME, De Kimpe N, Moglioni A, ei al. Coumarins: old compounds with novel promising therapeutic perspectives. 2010，17(13): 1325-1338.)。近几年，香豆素的抗肿瘤作用成为研究的 热点，人们已经建立多种细胞模型，并逐步深入到分子机制上，如发现其主要是通过作用 于细胞周期，诱导细胞凋亡以及阻断多种信号等途径抑制肿瘤细胞的增殖（Zhou Y，Zhao ff, Xie G, et al. Induction of Nur77-dependent apoptotic pathway by a coumarin derivative through activation of JNK and p38 MAPK. Carcinogenesis，2014, Epub ahead of print.)。然而，到目前为止，具有临床应用价值的实用性香豆素类抗肿瘤化合 物鲜有报道(马龙，张波，陈耀等，具有抗肿瘤活性的香豆素类化合物，CN 103172606 A.)。一方面，该类化合物中的绝大多数抗肿瘤作用弱，活性低，单独成药的可能不大。另一 方面，同PTX -样，诸多香豆素类化合物水溶性差，制剂困难；此外，部分化合物结构中的内 酯环对PH变化很敏感，易于水解，导致稳定性不佳。
[0005] 脂质体（Liposomes)的迅猛发展为解决PTX等难溶性药物提供了良好的应用平 台。脂质体是由磷脂和胆固醇组成的类似生物膜的双分子层结构。由于其结构类似生 物膜，可包封水溶性和脂溶性药物，具有提高药物稳定性、减少药物用量、降低毒性；减轻 变态反应和免疫反应；延缓释放、降低体内消除速度；改变药物在体内的分布等优点而得 到广泛的应用。脂质体常作为药物的储库，用于肿瘤、感染性疾病、心血管疾病等治疗中 (Sempkowski M, Locke T, Stras S, et al. Liposome-based approaches for delivery of mainstream chemotherapeutics: preparation methods, liposome designs, therapeutic efficacy, TfeF 2014, 19(3-4): 177-221·)。但是，月旨质体的稳 定性差已成为其应用中的主要问题：脂质体进入体内后，由于受血液中的蛋白、抗体等各种 因素作用，易发生破裂，包封药物快速渗漏，并很快被网状内皮系统识别、吸收，限制了它在 临床上的应用。
[0006] 纳米脂质体（Nanoliposomes，或 Nano-liposomes、Nano-lipo)是在常规脂质体基 础上结合纳米技术发展起来的一种新型给药系统。纳米脂质体的粒径小，包封率高，祀向作 用强，同时具有辅料相容性好、体外释放可控性强等优点。研究表明：紫杉醇纳米脂质体制 剂与传统的注射剂相比，疗效相似，但可避免聚氧乙烯蓖麻油复合溶媒带来的不良反应，稳 定性显著提高，药物不易渗漏；同时纳米脂质体的天然生物膜结构在体内具有被动靶向性， 可以改善PTX在动物体内的代谢动力学，降低毒副作用，患者顺应性佳。
[0007] 将紫杉醇和增敏剂香豆素类化合物共同载入纳米脂质体中，则可以解决PTX临床 使用中以下几个难题：（1)将PTX载于脂质体，免除了产生毒副作用的表面活性剂的使用。 (2) 将其制成纳米脂质体制剂，避免网状内皮系统的吞噬，使PTX在体内产生一定的储库效 应和靶向性，药物在纳米脂质体中停留时间明显延长，有利于肿瘤组织及病理部位的吸收。 (3) 纳米脂质体中引入增敏剂香豆素类化合物，可显著增强PTX对某些肿瘤细胞的增殖抑 制作用；这样，临床使用时，可在保证疗效的前提下，减少PTX用药剂量，从而降低其毒副作 用，达到"增敏减毒"PTX之目的。
【发明内容】
[0008] 为了将紫杉醇和增敏剂香豆素类化合物共同载入纳米脂质体中，达到"增敏减 毒"PTX之目的，本发明提供一种不含聚氧乙烯蓖麻油的新型给药系统一共载紫杉醇和增敏 剂的纳米脂质体。本发明的另一目的在于提供该纳米脂质体的制备方法，本发明的第三个 目的在于提供上述纳米脂质体作为制备抑制肿瘤药物的应用。
[0009] 本发明的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体，以下述配比的原料制成：紫杉醇：10 mg;注射用大豆卵磷脂：η大豆I卩磷脂：η紫杉醇=33?70 : 1;胆固醇：]^固醇：η大豆卵磷脂=0.05? 0. 15 : 1;增敏剂Iijewij: ?3 : 1;冻干保护剂：用量为注射用大豆卵磷脂及胆固 醇总质量的5%?10% ;磷酸盐缓冲液：pH7. 2?7. 4,用量为40?80 mL ; 其中η为摩尔数。
[0010] 为了计算方便，将有关原料的信息在这里列出。紫杉醇分子式C47H51NO14，分子量理 论值为853. 92,注射用大豆卵磷脂分子式为C42H8tlNO8P，分子量理论值为758. 06,胆固醇分 子量理论值为386. 6535。
[0011] 进一步，增敏剂为ThBC，其化学结构如式（I)所示： (I)
【权利要求】
1. 共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体，其特征是以下述配比的原料制成：紫杉醇： 10 mg;注射用大豆卵磷脂：n大豆麵脂：n紫杉醇=33?70 : 1;胆固醇：11)33固醇：n大豆麵脂= 0? 05?0? 15 : 1 ;增敏剂n增敏剂：11紫_ =1?3 : 1 ;冻干保护剂：用量为注射用大豆卵磷 脂及胆固醇总质量的5%?10% ;磷酸盐缓冲液：pH7. 2?7. 4,用量为40?80 mL ; 其中n为摩尔数。
2. 根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于：增敏剂为ThBC，其化学结构如式 (I)所示：
(I)。
3. 根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于：所述的冻干保护剂可为蔗糖、乳 糖、葡萄糖、甘露醇和/或海藻糖。
4. 权利要求1所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的制备方法包括： 将注射用大豆卵磷脂、胆固醇、紫杉醇及增敏剂用有机溶剂溶解，并混匀； 55 °C下水浴蒸发成膜，除去溶剂，真空干燥； 加入磷酸盐缓冲液及冻干保护剂，搅拌，充分溶胀至薄膜脱落，得到黄色混悬液；然后 冰水浴下分散，得到黄色略带荧光的悬液，再经0.22 滤器过滤除菌整粒，即得纳米脂质 体悬液；分装至西林瓶，冷冻干燥，得到共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：还包括一种增敏剂ThBC的合成，其 步骤包括如下： 向反应器中依次加入噻吩-2-乙酸，乙酸酐和2-羟基-1-萘甲醛，室温下搅拌，使固 体溶解后，加入三乙胺，氮气保护下加热回流，反应结束后冷却至室温，加入冰水，搅拌，析 出固体，抽滤，滤饼用冰水洗涤至中性，再加入CH2Cl2，过滤，去除不溶物，浓缩，硅胶柱层析 分离，得黄色固体，即目标产物。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：硅胶柱层析分离采用Kiigis : Kwm=1: 4的乙酸乙酯-石油醚混合流动相。
7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：注射用大豆卵磷脂及胆固醇一起用 5?8 mL的乙醚或三氯甲烷溶解；紫杉醇用1?4 mL乙醇或三氯甲烷溶解；增敏剂用1? 4 mL二氯甲烷或三氯甲烷溶解。
8. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：分散的方法为超声波细胞破碎仪间 歇超声法或高压乳匀法。
9. 权利要求1所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的在制备抗肿瘤药物方面的应 用，其中所述肿瘤包括宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：药物剂型为静脉注射剂。
【文档编号】A61K31/337GK104337807SQ201410595772
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】陈家念, 傅晓波, 李亭, 沈星灿, 王先富, 吴德文, 蒋邦平, 纪仕辰, 覃江克, 刘冬成, 黄春秋 申请人:广西师范大学