人参皂苷Rg1在制备提高机体运动能力保健品中的应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人参皂苷Rg1在制备提高机体运动能力保健品中的应用。

背景技术：

提高战斗人员、抢险救灾人员、高强度体育运动人员以及参加各种竞技比赛动物的运动能力是人类已久的梦想。以往，人们主要通过补充营养物质和加强体能训练来提高运动能力。据2004年美国奥林匹克委员会的调查显示，约有90％以上的运动员通过饮食补充各类营养物质。这一现象在其他高强度体力工作人员中也普遍存在。营养物质从先前补糖、盐，到近些年补充氨基酸、肌酸和牛磺酸，甚至使用固醇激素和兴奋剂。事实上，过量服用某些营养物质可能会带来很多潜在的风险和危害。补充激素和兴奋剂更是违反体育道德和相关法律。随着科学技术的进步和发展，人们逐渐认识了肌肉的收缩机制和肌肉产生疲劳的原因，认识了肌肉疲劳和身体疲劳的相互关系。同时，也发现许多促进骨骼肌高效率工作和抗疲劳的有效方法。骨骼肌高效率工作涉及能量物质摄取与代谢，肌蛋白种类与数量，钙离子藕联与浓度等众多因素，其中，提高能量供给与摄取是最直接、最可控和最有效的方法。

骨骼肌细胞膜上葡萄糖转运体4(Glucose transporter type 4，GLUT4)是葡萄糖分子从骨骼肌细胞膜外进入细胞内的唯一通道，也就是葡萄糖在细胞膜上发生易化扩散的主要运载蛋白。它发挥骨骼肌细胞能量原料供给泵的作用。它的基因表达水平和膜转位决定着葡萄糖的摄取效率。GLUT4由509个氨基酸构成，相对分子质量为45 000-55 000，主要存在于骨骼肌、心肌和脂肪组织中。在安静状态下，GLUT4绝大多数分布于细胞内的囊泡膜上，当胰岛素分泌或运动刺激时，GLUT4转位至细胞膜并发生结构改变，进行葡萄糖摄取，为骨骼肌活动提供能量物质。机体中85％的葡萄糖是直接供给骨骼肌摄取和利用。因此，促进骨骼肌细胞中GLUT4的基因表达和膜转位，是增加骨骼肌葡萄糖供给，提高运动能力重要方法和途径。

人参在我国被誉为“百草之王”，是地球上最古老的孑遗植物之一。在《神农本草经》等多部中药学专著均有记载。人参中含有多种人参皂苷和多糖生物活性化合物。具有抗癌、降糖、防辐射、促生长、增活力和抗衰老等功能。

人参皂苷Rg1是人参中最活跃的生物活性成分之一，我们对其药理作用进行了广泛而深入的研究。研究结果表明：人参皂苷Rg1能够促进骨骼肌细胞中GLUT4的基因表达和膜转位，能够加强骨骼肌细胞能量供给，提高机体运动能力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种人参皂苷Rg1应用于制备提高机体运动能力的保健品。

实验结果显示,GLUT4的基因表达和膜转位对葡萄糖摄取和利用具有十分重要的作用。人参皂苷Rg1能增强GLUT4的基因表达和膜转位，从而促进骨骼肌细胞对葡萄糖摄取和利用。

首先在实验室培养成肌细胞C2C12(购于上海瑞楚生物科技有限公司)；试用三种不同浓度(10,20,40μM)的Rg1(购于南京上海原叶生物科技有限公司，纯度为98.0％)与C2C12共孵育，20μM以上浓度人参皂苷Rg1对GLUT4表达有显著的促进作用。应用RT-PCR、Westernblot等实验方法，证实人参皂苷Rg1与C2C12细胞共孵育后，检测到C2C12细胞中GLUT4基因转录增加，GLUT4蛋白水平升高，GLUT4由胞浆向胞膜转位加强。

有益效果:提高机体运动能力的本质是增强骨骼肌做功，增加骨骼肌细胞能量物质供给是增强骨骼肌做功重要途径。人参皂苷Rg1能够促骨骼肌细胞GLUT4的表达和膜转位，提高骨骼肌对葡糖糖的摄取和利用，直接支持骨骼肌做功，提高机体运动能力。

附图说明

图1为人参皂苷Rg1与C2C12细胞共孵育后，RT-PCR检测GLUT4mRNA转录水平。

图2为人参皂苷Rg1与C2C12细胞共孵育后，Western blot检测GLUT4蛋白表达水平。

图3为人参皂苷Rg1与C2C12细胞共孵育后，Western blot检测细胞膜GLUT4蛋白水平。

图4为人参皂苷Rg1与C2C12细胞共孵育后，葡萄糖氧化法检测葡萄糖摄取利用水平。

具体实施方式

1.C2C12细胞培养

从－80℃冰箱中取出冻存的C2C12细胞，迅速转移到37℃水浴锅中使细胞速溶,800r离心5分钟，弃上清。用10％胎牛血清DMEM培养液在37℃、5％CO₂细胞培养箱中。换低浓度血清培养液培养促其分化。换DMEM高糖培养液培养，在培养液中加人参皂苷Rg1共孵育。

2.RT-PCR检测GLUT4mRNA

C2C12细胞在含人参皂苷Rg1培养液中温育24h后，使用Trizol提取C2C12细胞中总RNA，通过260nm和280nm处OD值检测，测量所提取RNA量以及纯度。根据Takara公司提供的RT-PCR试剂盒说明进行反转录和扩增实验，引物序列如下：GLUT4上游引物为5′-AGGCTGCCTATAAACACTGG-3’；GLUT4下游引物为5′-AGGAAGGATGAAGTGCAAAG-3’。选用退火温度为60℃。使用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物量。

3.Western blot检测GLUT4表达

C2C12细胞在含人参皂苷Rg1培养液中温育24h后，提取总蛋白进行SDS-PAGE。用Semi-Dry电转仪将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜。电转后的PVDF膜在甲醇中脱水，脱脂奶粉封闭，一抗体(山羊抗鼠)与PVDF膜共同孵育，TBST洗涤，二抗体(家兔抗山羊IgG)孵育，TBST洗涤，用ECL Kit检测目的蛋白。

4.Western blot检测GLUT4膜转位

C2C12细胞在含人参皂苷Rg1培养液中温育24h后，细胞经冷磷酸缓冲液洗脱，匀浆，差速离心，质膜分离，提取膜蛋白进行SDS-PAGE。方法同3。

5.葡萄糖消耗检测

C2C12细胞在含人参皂苷Rg1培养液中温育24h后，检测培养液中的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值为对照，计算出其它各复孔细胞对葡萄糖的消耗量。

6.结果分析

(1)人参皂苷Rg1促进C2C12GLUT4mRNA转录

RT-PCR实验检测人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4mRNA转录的影响。RT-PCR结果显示，人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4mRNA转录有明显促进作用，并具有浓度依赖性，如图1。图中1为对照组，未添加人参皂苷Rg1；2-4为人参皂苷Rg1孵育组；人参皂苷Rg1浓度分别为10、20和40uM。其中，20和40uM组对GLUT4细胞mRNA转录水平有显著促进作用。

(2)人参皂苷Rg1促进C2C12细胞GLUT4蛋白表达

Western blot实验检测人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4蛋白表达的影响。Western blot结果显示，人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4蛋白表达有明显促进作用，并具有浓度依赖性，如图2。图中1为对照组，未添加人参皂苷Rg1；2-4为人参皂苷Rg1孵育组；人参皂苷Rg1浓度分别为10、20和40uM。其中，20和40uM组对GLUT4蛋白表达有显著促进作用。

(3)人参皂苷Rg1促进C2C12细胞GLUT4膜转位

Western blot实验检测人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4蛋白膜转位的影响。Western blot结果显示，人参皂苷Rg1对C2C12细胞GLUT4蛋白膜转位有明显促进作用，如图3。图中人参皂苷Rg1孵育组(20和40uM)C2C12细胞膜GLUT4蛋白水平比对照组有显著升高。

(4)人参皂苷Rg1促进C2C12细胞葡萄糖摄取

葡萄糖氧化法实验检测人参皂苷Rg1对C2C12细胞对葡萄糖摄取利用影响。葡萄糖氧化实验结果显示，人参皂苷Rg1能促进C2C12细胞葡萄糖摄取，如图4。图中人参皂苷Rg1孵育组(40uM)细胞培养液中葡萄糖水平显著降低。

综上可以看出，人参皂苷Rg1能够促进成骨细胞C2C12GLUT4基因转录和蛋白表达，并能促进GLUT4膜转位，增强C2C12对葡萄糖的摄取和利用，具有增强骨骼肌做功，提高机体运动能力的作用。