一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸及其制备方法与流程

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸及其制备方法。
背景技术：
：随着社会经济的发展，国民生活方式发生了深刻的变化，尤其是人口老龄化及城镇化进程的加速，中国心血管病危险因素流行趋势明显，导致了心血管病的发病人数持续增加。今后十年，心血管病患病人数仍将快速增长，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。山楂叶为蔷薇科植物山里红(CrataeguspinnatifidaBge.varmajor)、山楂(C.pinnatifidaBge.)的干燥叶，收载于中国药典。山楂叶，甘酸，性温，入心肝脾胃，能化瘀理气，通经活血，健脾消食，疏肝解郁，宽畅胸膈。现代研究认为其具有扩张心血管，发送血氧供应，降低血脂水平，调节脂质代谢，降低外周血管阻力，改善微循环的作用。目前，国内已上市治疗冠心病、高血脂症、心绞痛及心律失常等疾病的药物中含山楂叶成分的代表药物有心安胶囊、益心酮、复心片、山玫胶囊等。牡荆素-2"-O-鼠李糖苷（vitexin-2"-O-rhamnoside）为山楂叶中主要活性成分，含量达2%以上，且其水溶性强，药理活性强，无细胞毒，适合开发成新药。体外培养细胞研究结果表明：牡荆素-2"-O-鼠李糖苷通过调节细胞膜钙离子门控通道，来影响膜电位及钙离子浓度稳定细胞膜；使LDH等酶产生和露出减少；调节心肌细胞活性物质产量和活性等方面，可以明显保护心肌细胞缺氧再给氧性损伤，保护缺血再灌注损伤心肌细胞，并可在生理范围内降低心肌细胞搏动频率；另外，该化合物可使缺氧再给氧后内皮细胞血管舒张因子NO产量，缩血管因子ET-1mRNA表达及ET-1明显减少。另有研究发现，牡荆素鼠李糖苷对离体动脉环具有浓度依赖性舒张作用，该作用通过内皮依赖性和内皮非依赖的方式产生，并具有部分钙拮抗剂的药理作用特点。因此，发现牡荆素鼠李糖苷具有直接扩张动脉血管的新的药理作用，可用于心脑血管疾病治疗药物的制备。冰片，辛苦，微寒，归心、脾、肺经，有开窍醒神、清热止痛的功效。《本草衍义》认为其作用特点为“独行则势弱,佐使则有功”。有研究表明，单味冰片对急性心肌梗死具有与冠心苏合丸类似的使冠状窦血流量回升、减慢心率和降低心肌耗氧量的作用，临床上冰片也常用于心脑血管疾病防治。现有的研究表明：牡荆素-2"-O-鼠李糖苷口服给药后生物利用度低，主要由严重的肠首过效应所致。舌下黏膜血管丰富，舌下腺位于舌下黏膜，分泌积存的唾液多，药物在这里溶解吸收，疗效发挥迅速，尤其适用于救治某些急症病人。与其他给药途径相比，舌下给药时药物吸收迅速，在很大程度上避免首过消除。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸及其制备方法，选用牡荆素-2"-O-鼠李糖苷为主要成分，与吸收促进剂冰片联合用药制成滴丸，具有吸收快、剂量小，便于携带的效果。为实现本发明的上述目的，本发明提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸，由牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片、及滴丸基质组成；所述牡冰滴丸中每丸含牡荆素-2"-O-鼠李糖苷1～10mg、冰片1～5mg。所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷与冰片的重量份数比为3～10:3；所述滴丸基质与牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的重量份数比为10～1:1。所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷是从山楂叶中提取分离得到的单体化合物。所述滴丸基质为聚乙二醇4000与聚乙二醇6000中的任意一种或它们的混合液。本发明还提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸的制备方法，包括如下步骤。步骤1、按配方比例称取牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片，加入到熔融的滴丸基质中，得混合液。步骤2、将所述混合液继续加热，不断搅拌，制成均匀的熔融药液。步骤3、将所述熔融药液转移至贮液瓶中，调节滴丸机温度控制系统，在保温下将所述熔融药液通过滴丸机滴头，以20～60滴·min-1的速度滴入冷凝剂中，得固态溶液。步骤4、待所述固态溶液冷却收缩成丸形后，将滴丸机出口处的滴丸取出，除去表面冷凝剂，干燥即得本发明牡冰滴丸。所述冷凝剂为液体石蜡、植物油或二甲基硅油。所述步骤3中保温的温度为70℃～90℃。所述步骤3中冷凝剂的温度为-15℃～20℃。与现有技术相比本发明的有益效果。本发明提供的治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸及其制备方法，选用山楂叶活性单体成分牡荆素-2"-O-鼠李糖苷与冰片联合用药制成滴丸，冰片作为吸收促进剂有促进肠渗透的作用，可显著提高牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的生物利用度；另外，肠道中广泛存在的P-糖蛋白可通过外排泵的输送机制减少药物的跨膜转运，成为某些药物的吸收屏障，而冰片可以作为P-糖蛋白的抑制剂提高牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的肠吸收。该滴丸可经舌下给药，吸收快、剂量小，在临床用药时可通过增减服用的丸数精确地调整用药剂量，且便于携带，作为天然产物开发中药的一类新药，具有广阔的市场前景。附图说明图1为本发明治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸制备方法流程图。图2为牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肝首过效应及胃肠首过效应的药时曲线图。图3为冰片对牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肠吸收影响研究中其在大鼠体内的药时曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1。本实施例提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸，由牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片、滴丸基质组成；所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷与冰片的重量份数比为4:3；所述滴丸基质与牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的重量份数比为5:1，所述滴丸基质为PEG6000。所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷是从山楂叶中提取分离得到的单体化合物。其分离纯化过程为：（1）化学成分的提取：取山楂叶30kg，粉碎后，置提取容器中，经70%乙醇加热回流提取两次，第一次为12倍量的70%乙醇提取1.5h，第二次为10倍量的70%乙醇提取1h，滤过、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏2000g，备用。（2）化学成分的纯化：所述浸膏溶解后上AB-8型大孔树脂柱，以10倍柱体积水洗脱，除去树脂表面或内部的残留杂质，再以3倍70%乙醇梯度洗脱，洗脱液减压回收乙醇。洗脱液使用乙醚萃取至无色，弃去乙醚层，水洗脱部分浓缩，得到浓缩浸膏500g。（3）牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的分离：所述浓缩浸膏溶解后上AB-8型大孔树脂柱，经水、30%乙醇、50%乙醇以及70%乙醇梯度洗脱。将30%乙醇所得馏分分别以聚酰胺柱分离，用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇梯度洗脱，分瓶收集溶液并以聚酰胺薄膜层析检查跟踪成分。30%乙醇及50%乙醇所得馏分减压回收乙醇至无醇味，干法装于硅胶柱，以200-300目硅胶柱分离。用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系统不同比例洗脱，薄层色谱确定牡荆素鼠李糖苷，将其分离后，再以SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱纯化，放置，重结晶，得到晶体，即为牡荆素-2"-O-鼠李糖苷。请参阅图1，本实施例还提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸的制备方法，包括如下步骤。步骤1、按配方比例称取牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片，加入到熔融的PEG6000中，得混合液。步骤2、将所述混合液继续加热，不断搅拌，制成均匀的熔融药液。步骤3、将所述熔融药液转移至贮液瓶中，调节滴丸机温度控制系统，在80℃～90℃保温下，将所述熔融药液通过滴丸机滴头，以40滴·min-1的速度滴入-15℃～-5℃液体石蜡中，得固态溶液。步骤4、待所述固态溶液冷却收缩成丸形后，将滴丸机出口处的滴丸取出，除去表面冷凝剂（沥尽冷凝剂），干燥即得本实施例牡冰滴丸。为进一步验证本发明的有益效果，本发明提供以下试验案例。试验例1。1.1、药品与试剂。牡荆素-2"-O-鼠李糖苷（实验室自制，纯度＞99%）；橙皮苷（中国药品生物制品检定所提供，批号为110721-200613）；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；磷酸(分析纯，天津市进丰化工有限公司）；冰乙酸（华北地区特种化学试剂开发中心）；纯化水（哇哈哈有限公司）；冰片（株洲松本林化有限公司）。1.2、动物。健康Wistar大鼠，雄性（250-300g），30只，由辽宁中医药大学实验动物中心提供；实验中所使用动物研究严格按照实验室动物保护指导原则进行，所使用动物征得辽宁中医药大学动物实验伦理委员会同意。实验期间自由饮水，大鼠给药试验前禁食12h。1.3、色谱条件。色谱柱：DiamonsilC18（150mm×4.6mm，5μm）（迪马公司，中国北京）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水（40:60；V/V）；检测波长：330nm；流速：1mL/min；内标物：橙皮苷；柱温：室温；进样量：5μL。1.4、生物样品的制备。取血浆样品100μL，置2mL具塞离心试管中，依次加入20μL冰乙酸，50μL内标溶液（40μg/mL），500μL甲醇，涡旋混合1min，离心15min（3000r/min），取上清液，于50℃氮气流下吹干，残渣加入流动相100μL，涡旋溶解1min，离心5min（15000r/min），取上清液5μL注入UHPLC进行分析，分别记录色谱图及峰面积。1.5、肝首过效应研究。选取两组大鼠，即股静脉给药组与肝门静脉给药组，每组5只，实验前夜禁食但自由饮水。20%乌拉坦（5mL/kgi.p.）轻微麻醉后仰卧于手术台，置于灯下使体温维持37±1℃，苏醒前将大鼠颈动脉插管，管中充满80U/mL的肝素用于抗凝和取血。对于股静脉给药组，在大腿内侧剖开一个小口，找到股静脉，将牡荆素-2"-O-鼠李糖苷溶液5min内匀速注入股静脉中（5mg/kg），给药后，立即用棉花物理按压止血，缝合伤口。对于肝门静脉给药组，腹部剖开后，沿肠找到肠系膜上静脉，并沿着肝门静脉的方向注入牡荆素-2"-O-鼠李糖苷（5mg/kg），5min内匀速完成，给药后，立即用棉花轻按压于给药处进行生理止血，止血后，缝合刀口。于给药后2、5、8、11、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、300min采血0.3mL，置于预先肝素化的EP管中，离心15min（3000r/min），得血浆样品置-20℃冰箱中保存，待测。1.6、胃肠首过效应研究。选取两组大鼠，即十二指肠给药组与胃给药组，每组5只，实验前夜禁食但自由饮水。20%乌拉坦（5mL/kgi.p.）轻微麻醉后仰卧于手术台，置于灯下使体温维持37±1℃，苏醒前将大鼠颈动脉插管，管中充满80U/mL的肝素用于抗凝和取血。对于十二指肠给药组，经十二指肠上段（幽门下1cm）灌注牡荆素-2"-O-鼠李糖苷溶液（40mg/kg），5分钟内匀速完成。对于胃给药组，经胃底部贲门处5分钟内匀速注入牡荆素-2"-O-鼠李糖苷溶液（40mg/kg）。于给药后2、5、8、11、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、300min采血0.3mL，置于预先肝素化的EP管中，离心15min（3000r/min），得血浆样品置-20℃冰箱中保存，待测。1.7、吸收促进剂冰片对牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肠吸收的影响。为研究吸收促进剂对牡荆素鼠李糖苷肠吸收的影响，将冰片（30mg/kg）与牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的混合溶液灌注至十二指肠。于给药后2、5、8、11、15、20、30、45、60、90、120、180、240、300min采血0.3mL，置于预先肝素化的EP管中，离心15min（3000r/min），得血浆样品置-20℃冰箱中保存，待测。1.8、结果。请参阅表1，为牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肝首过及胃肠首过效应的相关药动参数；请参阅图2，为牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肝首过效应及胃肠首过效应的药时曲线。表1：牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肝首过效应及胃肠首过效应药动参数。组别剂量（mg/kg）AUC0→∞(µg·min/ml)生物利用度股静脉组5725.49±26.13100肝门静脉组51151.9±38.25158.77十二指肠组40220.98±24.372.4胃组40263.89±97.362.86请参阅表2，为冰片对牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肠吸收影响的相关药动参数；请参阅图3，为冰片对牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肠吸收影响研究中其在大鼠体内的药时曲线。表2：冰片对牡荆素-2"-O-鼠李糖苷肠吸收影响的药动参数。组别剂量（mg/kg）AUC0→∞（µg·min/ml）十二指肠组40230.00±36.45冰片组40628.54±25.55由表1、表2、图1、图2可知，在肠首过效应实验中，肠的表观生物利用度为2.4%。与十二指肠组相比较，冰片组生物利用度增加1.73倍。牡荆素-2"-O-鼠李糖苷在体内发生严重的首过效应主要是由其肠道引起的，即对于黄酮类化合物的首过效应，其肠道首过效应要比其肝脏代谢起到更重要的作用，并且在肝肠循环中，肠循环更常用于解释黄酮类化合物较低生物利用度的原因。冰片可显著提高牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的生物利用度，其主要原因是冰片作为吸收促进剂有促进肠渗透的作用。另外，肠道中广泛存在的P-糖蛋白可通过外排泵的输送机制减少药物的跨膜转运，成为某些药物的吸收屏障，而冰片可作为P-糖蛋白的抑制剂提高牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的肠吸收。试验例2。2.1、药品和试剂。牡冰滴丸由本实施例1的方法制备而成；丹参滴丸：天士力制药集团股份有限公司产品，批号：国药准字Z10950111；盐酸异丙肾上腺素(Iso)：上海禾丰制药有限公司产品，批号：国药准字H31021344。2.2、动物。Wistar大鼠90只，雄性，体重（200±20）g，所有实验动物及饲料均购于辽宁长生生物技术有限公司，大鼠合格证号SYXK(辽)2010-0001。室温20～25℃，自由饮食，实验室适应一周后用于实验。2.3、实验方法。Wistar大鼠90只，随机分为9组，分别为空白组、模型组、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷低剂量（20mg/kg）、中剂量（40mg/kg）、高剂量（80mg/kg）组（简称糖苷低剂量组、糖苷中剂量组、糖苷高剂量组）、及其在本实施例牡冰滴丸中低剂量（20mg/kg）、中剂量（40mg/kg）、高剂量（80mg/kg）组（简称牡冰低剂量组、牡冰中剂量组、牡冰高剂量组）、丹参滴丸（85mg/kg）阳性对照组（简称丹参滴丸组）。牡荆素-2"-O-鼠李糖苷低剂量组、中剂量组、高剂量组，牡冰滴丸低剂量、中剂量、高剂量组，及丹参滴丸组均给予相应治疗药物灌胃，每天1次，连续14天；空白组和模型组灌胃同体积蒸馏水（15mL/kg）。最后3天除空白组外，其余各组在给药后1h分别腹腔注射异丙肾上腺素（5mg/kg），以建立大鼠急性心肌缺血模型，空白对照组相应腹腔注射等量（5mg/kg）生理盐水。末次给药1h后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。2.4、血清生化指标测定。腹主动脉取血5-6mL于预先肝素化的离心管中，离心10min（3000r/min），收集上清液，采用罗氏cobas8000生化分析仪，原装试剂。2.5、结果。请参阅表3，为牡冰滴丸对急性心肌缺血大鼠心肌酶含量的影响（均数±标准差，n=10）。与空白组比较，模型组心肌酶CK-MB、LDH和HBDH含量均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，牡荆素-2"-O-鼠李糖苷低剂量组、中剂量组CK-MB，LDH，HBDH含量均无显著变化，高剂量组中CK-MB，LDH，HBDH含量明显降低。牡冰滴丸低剂量组、中剂量组、高剂量组CK-MB，LDH，HBDH含量与模型组相比较均显著或极显著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中，牡冰滴丸低剂量及中剂量组效果明显优于高剂量组，且牡冰滴丸中剂量组效果最为明显；与丹参滴丸组比较，牡冰滴丸低剂量组、中剂量组、高剂量组CK-MB，LDH，HBDH含量差异无统计学意义。结果显示，仅高剂量组牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对大鼠盐酸异丙肾上腺素所致急性心肌缺血性损伤有保护作用，本实施例的牡冰滴丸可显著提高对大鼠盐酸异丙肾上腺素所致急性心肌缺血性损伤的保护作用。表3：各组对急性心肌缺血大鼠心肌酶含量的影响。组别CK-MB（u/l）LDH（u/l）HBDH（u/l）空白组151.90±19.651397.33±101.03493.33±25.93模型组219.07±14.15*2055.00±281.86*819.33±100.80*糖苷低剂量组199.00±13.892005.33±23.44796.33±26.43糖苷中剂量组195.33±16.031986.00±47.62789.67±14.57糖苷高剂量组170.67±12.58**1815.33±93.94**683.00±99.29**牡冰低剂量组179.27±18.431270.33±164.26**513.67±66.58**牡冰中剂量组141.67±39.83**1147.67±271.61***457.67±106.40**牡冰高剂量组156.43±31.47**1660.67±314.08**643.67±145.58**丹参滴丸组203.93±12.801792.00±179.97687.00±85.26注：与空白组比较,*P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.05，***P＜0.01。实施例2。本实施例提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸，由牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片、滴丸基质组成；所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷与冰片的重量份数比为4:3；所述滴丸基质与牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的重量份数比为6:1，所述滴丸基质为PEG4000。本实施例还提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸的制备方法，包括如下步骤。步骤1、按配方比例称取牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片，加入到熔融的PEG4000中，得混合液。步骤2、将所述混合液继续加热，不断搅拌，制成均匀的熔融药液。步骤3、将所述熔融药液转移至贮液瓶中，调节滴丸机温度控制系统，在80℃～90℃保温下，将所述熔融药液通过滴丸机滴头，以50滴·min-1的速度滴入-15℃～-5℃的植物油中，得固态溶液。步骤4、待所述固态溶液冷却收缩成丸形后，将滴丸机出口处的滴丸取出，除去表面冷凝剂，干燥即得本实施例牡冰滴丸。实施例3。本实施例提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸，由牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片、滴丸基质组成；所述牡荆素-2"-O-鼠李糖苷与冰片的重量份数比为4:3；所述滴丸基质与牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的重量份数比为7:1，所述滴丸基质由PEG4000与PEG6000组成，所述PEG4000与PEG6000的重量份数比为1:1。本实施例还提供一种治疗急性心肌缺血的牡冰滴丸的制备方法，包括如下步骤。步骤1、按配方比例称取牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、冰片，加入到熔融的PEG4000与PEG6000中，得混合液。步骤2、将混合液继续加热，不断搅拌，制成均匀的熔融药液。步骤3、将所述熔融药液转移至贮液瓶中，调节滴丸机温度控制系统，在80℃～90℃保温下，将所述熔融药液通过滴丸机滴头，以30滴·min-1的速度滴入-15℃～-5℃二甲基硅油中，得固态溶液。步骤4、待所述固态溶液冷却收缩成丸形后，将滴丸机出口处的滴丸取出，除去表面冷凝剂，干燥即得本实施例牡冰滴丸。当前第1页1 2 3