缀合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生命科学和化学生物学领域，具体地，涉及缀合物及其制备方法和用途。

背景技术：

自然界中几乎所有生命过程都是由分子识别和分子相互作用调控的，多肽和蛋白质之间的特异性相互作用是生物体内分子识别的关键步骤。构成多肽的基本单元包括20种性质不同的氨基酸，由此构成的多肽库种类繁多、性质各异，加之多肽良好的生物相容性、细胞/组织穿透能力和化学稳定性，赋予了多肽巨大的潜能，被广泛应用于生命科学、化学生物学、医药学等研究领域。

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命与健康，研究人员发展了许多的诊断方法与治疗手段用于肿瘤的攻克。化学治疗，是一种重要的肿瘤治疗手段，然而目前大部分的抗癌药物杀伤细胞缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞存在明显毒副作用。为了克服这个问题，具有低毒副作用的靶向药物的研制日益成为有效的途径。结合靶向药物运载与智能响应性药物释放成为肿瘤治疗的研究热点。

通过靶向配体与抗癌药物相连，构成配体药物缀合物，能够选择性地将药物运载到肿瘤细胞中，从而特异性地杀伤肿瘤细胞。目前这类靶向配体主要包括抗体、核酸适配体、小蛋白支架、多肽、低分子量非肽配体等。纳米载药系统具有被动靶向的功能，也作为一种靶向治疗的研究分支受到广泛关注。以抗体作为靶向配体的抗体药物缀合物已有两种获得FDA批准上市。

然而，随着对于肿瘤的深入研究，研究者发现抗体作为生物大分子靶向探针，存在着一些明显的局限性，例如大部分抗体来源于动物，进入人体后有免疫原性；抗体体积大，组织穿透能力差；抗体偶联药物只能在水相进行；难以预测抗体/药物偶联的计量关系，产物存在异质性等。

因而，目前的配体药物缀合物研究仍有待加强。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种分子量小，组织穿透能力强，不易引起免疫反应，能够选择性地进入肿瘤细胞中，且能够快速释放抗肿瘤药物从而特异性地杀伤肿瘤细胞的缀合物。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和进一步的工作而完成的：

以多肽作为靶向配体构建的配体药物缀合物具有分子量小，组织穿透能力强，不易引起免疫反应，修饰位点易于偶联药物，产物单一，结构明确等优点。多肽与药物之间的偶联方式多样，例如酰胺键、羧酸酯键、硫醚键、腙键等，多肽官能团的易于修饰性，有利于靶向药物的设计与合成。因而，在复杂生物体系中，高灵敏度、高选择性、多参数地对肿瘤细胞的分子事件进行识别与跟踪具有挑战性，以多肽作为靶向配体，加之智能响应的功能单元而构建的靶向药物释放系统有望为肿瘤的靶向治疗开辟一条新的思路。

进而，发明人以在肿瘤细胞中高表达的溶酶体四次穿膜蛋白(LAPTM4B)为靶标，以能选择性识别LAPTM4B蛋白的AP2H多肽(IHGHHIISVG)为靶向功能基团，以DNA损伤型广谱抗癌药阿霉素(Doxorubicin,DOX)为模式药物，通过不同的偶联方式，先后设计了三种多肽药物缀合物，分别是以酰胺键偶联的多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)，以氧化还原响应型二硫键偶联的多肽药物缀合物-2(AP2H-s-s-DOX)和以pH响应型腙键偶联的多肽药物缀合物-3(AP2H-hydrazone-DOX)，并先后考察了三种多肽药物缀合物的细胞识别与细胞杀伤性能，结果发现：

(1)多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)能选择性地识别LAPTM4B蛋白上调的肿瘤细胞，并由LAPTM4B蛋白介导进入细胞质，体现了AP2H多肽的靶向性。然而AP2H-DOX未能有效杀伤细胞，其原因可能是AP2H-DOX滞留于细胞质中，未能进入细胞核，而DOX是DNA损伤型细胞杀伤药物，因而不能发挥药效；其次，偶联于AP2H多肽上的阿霉素药效可能会降低，即使进入细胞核，药效也不能完全发挥。总之，以这种以酰胺键偶联的多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)，不能实现肿瘤细胞的有效杀伤。

(2)多肽药物缀合物-2(AP2H-s-s-DOX)能选择性地识别LAPTM4B蛋白上调的肿瘤细胞，并由LAPTM4B蛋白介导进入细胞质，体现了AP2H多肽的靶向性。然而AP2H-s-s-DOX由LAPTM4B蛋白介导进入细胞中内涵体、溶酶体等细胞器，DOX不能释放进入细胞核，未能有效损伤DNA。因此，这种靶向溶酶体的，以二硫键偶联的多肽药物缀合物，不能实现靶向肿瘤杀伤的目的。

(3)多肽药物缀合物-3(AP2H-hydrazone-DOX)能选择性地结合在肿瘤细胞膜LAPTM4B蛋白上，并内吞进入内涵体-溶酶体等细胞器，并在弱酸性条件下快速释放几乎全部阿霉素，阿霉素逃离溶酶体并扩散进入细胞核，损伤DNA，进而杀伤细胞。AP2H多肽的肿瘤细胞靶向性能与腙键的pH响应性断裂性能使得AP2H-hydrazone-DOX能够选择性地对LAPTM4B蛋白高表达的A549肿瘤细胞与HepG2肿瘤细胞产生杀伤作用，而对正常的HEK293细胞无影响。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种缀合物。根据本发明的实施例，所述缀合物具有如下所示的结构：TP-L-D，其中，TP表示靶向肽，所述靶向肽适于将所述缀合物靶向至肿瘤细胞，并且所述肿瘤细胞表面携带LAPTM4B蛋白作为所述靶向肽的特异性靶标；D表示治疗活性剂；L表示连接臂，用于将所述治疗活性剂连接至所述靶向肽，其中，所述连接臂与所述治疗活性剂之间通过腙键结合。

发明人发现，本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性强，不易引起免疫反应，进而能够有效用于制备治疗肿瘤的药物组合物，或者直接用于治疗肿瘤。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于治疗癌症的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物含有：前面所述的缀合物。由此，本发明的药物组合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性强，从而能够有效用于治疗肿瘤。

本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，从而该缀合物能够有效用于制备靶向性杀伤表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞从而治疗肿瘤的药物。由此，根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备前面所述的缀合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)通过固相多肽合成法合成靶向肽，以便获得键合有所述靶向肽的树脂，其中，所述靶向肽具有氨基酸序列IHGHHIISVG，在所述固相多肽合成法中采用Fmoc-甘氨酸-Wang树脂，所述Fmoc-甘氨酸-Wang树脂的甘氨酸键合量为0.4mmol/g作为起始原料，脱保护使用含有20体积％六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，脱保护2次，每次5min，偶联步骤使用3倍摩尔量的Fmoc-氨基酸和3倍摩尔量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，N-甲基吗啡啉作为碱性催化剂；

(2)在N-甲基吗啡啉作为催化剂的条件下，使所述键合有所述靶向肽的树脂与琥珀酸酐接触，以便获得键合有所述靶向肽-SA的树脂，其中所述琥珀酸酐的量是所述靶向肽的3倍摩尔量；

(3)使步骤(2)所得到的反应产物与3倍摩尔量的Fmoc-肼、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N-羟基苯并三氮唑在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应；

(4)使步骤(3)中所得到的产物进行脱Fmoc保护基处理；

(5)按一定体积分数配制裂解液：95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％三异丙基硅烷，将步骤(4)所得到的反应物与裂解液进行反应，反应时间2h；

(6)使用砂芯漏斗过滤步骤(5)中的反应溶液，将滤液旋转蒸发浓缩，加入预冷的乙醚进行沉淀；

(7)将步骤(6)中得到的固体通过液相色谱进行纯化，得到TD-SA-肼；以及

(8)使步骤(7)中所得到的产物与2倍摩尔量的盐酸阿霉素反应，反应溶剂为添加有0.2体积％三氟乙酸的无水甲醇，以便获得式I所示化合物。

发明人发现，利用该方法能够有效地制备获得本发明的缀合物，并且该方法成本低、效率高，步骤简单易操作，获得的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性突出，能够直接用于治疗肿瘤，或者有效用于制备治疗肿瘤的药物组合物。

根据本发明实施例的缀合物具有下列优点的至少之一：

1、本发明的缀合物，以多肽作为靶向配体，具有分子量小，组织穿透能力强，不易引起免疫反应，修饰位点易于偶联药物，产物单一，结构明确等优点。

2、本发明的缀合物，以pH响应型腙键偶联治疗活性剂和靶向肽，基于腙键的pH响应性断裂性能，本发明的缀合物被内吞进入靶标肿瘤细胞的内涵体-溶酶体等细胞器后，在这些细胞器的弱酸性环境中缀合物的腙键断裂，从而能够快速释放治疗活性剂，使治疗活性剂逃离溶酶体并扩散进入细胞核，损伤DNA，进而杀伤肿瘤细胞。

3、本发明的缀合物分子量小，组织穿透能力强，能够选择性地进入表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞中并快速释放治疗活性剂，使治疗活性剂进入细胞核，损伤DNA，从而能够特异性地杀伤靶标肿瘤细胞。即本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性强，不易引起免疫反应。

4、本发明的缀合物以DNA损伤型广谱抗癌药阿霉素为治疗活性剂，能够有效损伤阿霉素敏感性的靶标肿瘤细胞DNA，进而有效杀伤该靶标肿瘤细胞。

5、本发明缀合物的靶向肽具有氨基酸序列：IHGHHIISVG，从而本发明的缀合物能够选择特异性地识别LAPTM4B蛋白，进而能够靶向性杀伤表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞，而对正常的细胞无影响。

6、本发明的缀合物能够有效用于治疗肿瘤，或者用于制备治疗肿瘤的药物组合物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，多肽药物缀合物AP2H-DOX的合成流程图；

图2显示了根据本发明一个实施例，多肽药物缀合物AP2H-DOX的ESI-MS表征结果；

图3显示了根据本发明一个实施例，两种细胞对AP2H-DOX和DOX的摄入的激光共聚焦显微镜观察结果(标尺20μm)；

图4显示了根据本发明一个实施例，不同浓度AP2H-DOX与两种细胞孵育48h后的细胞的存活率检测结果；

图5显示了根据本发明一个实施例，AP2H-s-s-DOX的合成流程与GSH响应性药物释放原理图；

图6显示了根据本发明一个实施例，多肽药物缀合物AP2H-s-s-DOX的ESI-MS表征结果；

图7显示了根据本发明一个实施例，两种细胞对AP2H-s-s-DOX的摄入的激光共聚焦显微镜观察结果；

图8显示了根据本发明一个实施例，不同浓度AP2H-s-s-DOX与两种细胞孵育48h后的细胞的存活率检测结果；

图9显示了根据本发明一个实施例，AP2H-s-s-DOX与商品化溶酶体荧光探针LysoTracker共染HepG2细胞的检测结果；

图10显示了根据本发明一个实施例，合成AP2H-hydrazone-DOX的路径以及酸催化腙键断裂的反应过程示意图；

图11显示了根据本发明一个实施例，AP2H-hydrazide的液相色谱鉴定与ESI-ion trap质谱表征结果；

图12显示了根据本发明一个实施例，AP2H-hydrazide-DOX的表征结果，其中，

图12A和图12B为液相色谱鉴定结果，

图12C为ESI-ion trap质谱表征结果，

图12D为高分辨率MALDI-TOF质谱表征结果；

图13显示了根据本发明一个实施例，AP2H-hydrazone-DOX的HPLC-ESI-ion trap MS对反应液的监测结果；

图14显示了根据本发明一个实施例，AP2H-hydrazone-DOX的pH响应性药物释放的体外监测结果；

图15显示了根据本发明一个实施例，肿瘤细胞(HepG2细胞和A549细胞)和一种正常细胞(HEK293细胞)对AP2H-hydrazone-DOX和DOX的摄入与细胞内分布的激光共聚焦显微镜观察结果(标尺为20μm)；

图16显示了根据本发明一个实施例，AP2H-hydrazone-DOX与LysoTracker Green双染HepG2细胞与A549细胞的结果图(标尺为20μm)；

图17显示了根据本发明一个实施例，HEK293细胞、A549细胞、HepG2细胞分别与AP2H-hydrazide、DOX或AP2H-hydrazone-DOX孵育48h的细胞存活率结果；

图18显示了根据本发明一个实施例，两种肿瘤细胞HepG2与A549的存活率与AP2H-hydrazone-DOX或DOX浓度的关系考察结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

缀合物

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种缀合物。根据本发明的实施例，所述缀合物具有如下所示的结构：TP-L-D，其中，TP表示靶向肽，所述靶向肽适于将所述缀合物靶向至肿瘤细胞，并且所述肿瘤细胞表面携带LAPTM4B作为所述靶向肽的特异性靶标；D表示治疗活性剂；L表示连接臂，用于将所述治疗活性剂连接至所述靶向肽，其中，所述连接臂与所述治疗活性剂之间通过腙键结合。

发明人惊奇地发现，本发明的缀合物分子量小，组织穿透能力强，能够选择性地进入表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞中并快速释放治疗活性剂，使治疗活性剂进入细胞核，损伤DNA，从而能够特异性地杀伤肿瘤细胞。根据本发明的实施例，本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性强，且不易引起免疫反应，进而能够有效用于制备治疗肿瘤的药物组合物，或者直接用于治疗肿瘤。

其中，需要说明的是，本发明的缀合物，以多肽作为靶向配体，具有分子量小，组织穿透能力强，不易引起免疫反应，修饰位点易于偶联药物，产物单一，结构明确等优点；以pH响应型腙键偶联治疗活性剂和靶向肽，基于腙键的pH响应性断裂性能，本发明的缀合物被内吞进入靶标肿瘤细胞的内涵体-溶酶体等细胞器后，在这些细胞器的弱酸性环境中缀合物的腙键断裂，从而能够快速释放治疗活性剂，使治疗活性剂逃离溶酶体并扩散进入细胞核，损伤DNA，进而杀伤肿瘤细胞。

根据本发明的实施例，所述治疗活性剂携带酮羰基以便与所述连接臂形成腙键。由此，能够方便有效地形成具有pH响应性断裂性能的腙键，实现以pH响应型腙键偶联治疗活性剂和靶向肽。

根据本发明的实施例，在本发明的缀合物中，治疗活性剂的种类不受特别限制，可以为任何对肿瘤细胞具有杀伤作用的有效抗癌药。根据本发明的一些实施例，所述治疗活性剂为选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春新碱、伊达比星、多西他赛、卡巴他赛和艾日布林的至少一种，优选阿霉素。由此，本发明的缀合物与LAPTM4B蛋白结合后內吞进入肿瘤细胞后，能够快速有效地释放治疗活性剂，进而有效杀伤靶标肿瘤细胞，且杀伤性强。

根据本发明的实施例，本发明缀合物的靶向肽的具体氨基酸序列不受特别限制，只要能够有效识别LAPTM4B蛋白，并能够将连接靶向肽的药物靶向至表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞即可。根据本发明的一些实施例，所述靶向肽为AP2H，具有氨基酸序列：IHGHHIISVG(SEQ ID NO:1)。由此，该靶向肽对LAPTM4B蛋白特异性地识别能力突出，从而本发明的缀合物能够选择性地对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞产生杀伤作用，而对正常的细胞无影响，且靶向杀伤性强。

根据本发明的实施例，所述连接臂具有下式所示的结构：

其中，R为C1～5的烷基，优选R为C2的烷基。由此，上述的靶向肽和治疗活性剂能够被有效连接，从而形成本发明的缀合物，并实现pH响应型腙键偶联方式。

根据本发明的实施例，所述缀合物具有下式所示的结构：

由此，本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性突出，能够直接用于治疗或预防肿瘤，或者有效用于制备治疗或预防肿瘤的药物组合物。

缀合物的用途

如前所述，本发明的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，从而该缀合物能够有效用于制备靶向性杀伤表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞从而治疗或预防肿瘤的药物，进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。

需要说明的是，术语“癌症”用于指任何细胞恶性肿瘤，其特有的症状在于失去正常控制(导致不受调节的生长)、没有分化以及能够侵袭局部组织和转移。癌症可在任何器官的任何组织中发生。

根据本发明的实施例，本发明的缀合物以及药物组合物所适用的癌症种类不受特别限制，只要是肿瘤细胞表面携带LAPTM4B蛋白且适于以缀合物采用的治疗活性剂进行治疗的癌症均可。具体地，根据本发明的实施例，所述癌症为选自肝癌、肺癌、胆囊癌、卵巢癌、结肠癌、子宫癌和乳腺癌的至少一种，优选肝癌。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于治疗或者预防癌症的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物含有：前面所述的缀合物。由此，本发明的药物组合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性强，从而能够有效用于治疗或预防肿瘤。

根据本发明的一些实施例，包含本发明的缀合物的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的另一些实施例，本发明的药物组合物中还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。

根据本发明的实施例，本发明的缀合物和药物组合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，对于治疗或预防肿瘤有效，因而，本发明的缀合物以及包含该缀合物的药物组合物可以在治疗相应癌症时被给药。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的缀合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，腙键断裂，因此口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解或破坏。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在癌症治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果，例如抑制癌细胞生长、导致癌细胞死亡或改善疾病或病症。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指癌症)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防癌症)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述缀合物的药物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的缀合物或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的缀合物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的缀合物、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

缀合物的制备方法

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备前面所述的缀合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)通过固相多肽合成法合成靶向肽，以便获得键合有所述靶向肽的树脂，其中，所述靶向肽具有氨基酸序列IHGHHIISVG，在所述固相多肽合成法中采用Fmoc-甘氨酸-Wang树脂，所述Fmoc-甘氨酸-Wang树脂的甘氨酸键合量为0.4mmol/g作为起始原料，脱保护使用含有20体积％六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，脱保护2次，每次5min，偶联步骤使用3倍摩尔量Fmoc-氨基酸和3倍摩尔量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，N-甲基吗啡啉(NMM)作为碱性催化剂；

(2)在NMM作为催化剂的条件下，使所述键合有所述靶向肽的树脂与琥珀酸酐接触，以便获得键合有所述靶向肽-SA的树脂，其中所述琥珀酸酐的量是所述靶向肽的3倍摩尔量；

(3)使步骤(2)所得到的反应产物与3倍摩尔量的Fmoc-肼、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N-羟基苯并三氮唑(HOBT)在DMF溶剂中反应；

(4)使步骤(3)中所得到的产物进行脱Fmoc保护基处理；

(5)按一定体积分数配制裂解液：95％三氟乙酸(TFA)，2.5％水，2.5％异丙基硅烷(TIS)，将步骤(4)所得到的反应物与裂解液进行反应，反应时间2h；

(6)使用砂芯漏斗过滤步骤(5)中的反应溶液，将滤液旋转蒸发浓缩，加入预冷的乙醚进行沉淀；

(7)将步骤(6)中得到的固体通过液相色谱进行纯化，得到TD-SA-肼；以及

(8)使步骤(7)中所得到的产物与2倍摩尔量的盐酸阿霉素反应，反应溶剂为添加有0.2体积％三氟乙酸的无水甲醇，以便获得式I所示化合物。

发明人发现，利用该方法能够有效地制备获得本发明的缀合物，并且该方法成本低、效率高，步骤简单易操作，获得的缀合物能够对表面携带LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞进行靶向性杀伤，且靶向性、杀伤性突出，能够直接用于治疗或预防肿瘤，或者有效用于制备治疗或预防肿瘤的药物组合物。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

发明人针对肿瘤相关蛋白-溶酶体四次穿膜蛋白(LAPTM4B)，以选择性识别LAPTM4B蛋白的AP2H多肽(IHGHHIISVG)为靶向功能基团，以DNA损伤型广谱抗癌药阿霉素(DOX)为模式药物，采用不同的偶联方式，先后设计并成功构建了三种多肽药物缀合物(peptide-drug conjugates，PDCs)，然后示踪分析了三种多肽药物缀合物的细胞摄入与亚细胞定位，并对三种多肽药物缀合物进行了肿瘤细胞选择性识别性能以及肿瘤细胞杀伤性能的考察，具体如下：

实施例1酰胺键偶联多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)的合成与性能考察

(1)AP2H-DOX的设计与合成

氨基酸通过氨基与羧基的缩合构成多肽，基于此，发明人首先模拟形成多肽的化学键-酰胺键，通过AP2H多肽C端的羧基与抗癌药物阿霉素的氨基进行缩合，形成酰胺键，构成多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)，合成流程如图1。将AP2H多肽(1eq)溶解于DMF中，取DOX·HCl(2eq)加入其中，再加入DIPEA(10eq)，EDC·HCl(3eq)，HOBt·H2O(3eq)，室温反应6h。反应液通过半制备液相色谱柱进行纯化，得到最终产物AP2H-DOX。经过液相色谱纯化后，使用ESI质谱对产物进行了鉴定，可见[M+H]⁺:1595.04,[M+2H]²⁺:797.87,[M+3H]³⁺:532.15等质谱信号，表明成功合成得到目标物AP2H-DOX(Exact Mass：1593.75)，如图2所示。

(2)AP2H-DOX的肿瘤细胞靶向识别性能考察

DOX不仅能损伤DNA，也具有发射红色荧光的性质，因此AP2H-DOX在细胞中的分布可以通过激光共聚焦显微镜来观察。考察了两种细胞系-HepG2细胞(人肝癌细胞)和Chang Liver细胞(张氏肝细胞，正常肝细胞)对AP2H-DOX的摄入情况。将这两种细胞与AP2H-DOX(10μM)共同孵育，如图3(A，B)所示，孵育2h后，在HepG2细胞中能看到明显的红色荧光，表明HepG2细胞已将AP2H-DOX摄入，在对照细胞Chang Liver细胞内，未检测到荧光信号。实验结果表明AP2H-DOX能选择性地识别HepG2细胞。作为对照实验，两种细胞分别与DOX共同孵育，如图3(C，D)所示，两种细胞中均可观察到明显的红色荧光信号，表明DOX无选择性地进入肿瘤细胞和正常细胞。

(3)AP2H-DOX的肿瘤细胞靶向杀伤性能考察

采用标准MTT法，考察了AP2H-DOX的靶向肿瘤细胞杀伤性能。实验中使用了两种细胞，HepG2细胞和Chang Liver细胞，将这两种细胞分别与不同浓度的AP2H-DOX(0.01,0.1,1,10μM)共同孵育。如图4所示，AP2H-DOX与细胞孵育48h后，HepG2和Chang Liver细胞的存活率均未见明显下降。因此，这种以酰胺键偶联的多肽药物缀合物-1(AP2H-DOX)，不能实现对肿瘤细胞的有效杀伤。

实施例2氧化还原响应型多肽药物缀合物-2(AP2H-s-s-DOX)的合成与性能考察

(1)AP2H-s-s-DOX的设计与合成

使用商品化试剂3,3-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺)酯(DSP)对AP2H与DOX进行偶联，多肽药物缀合物-2(AP2H-s-s-DOX)的合成流程和GSH响应性药物释放原理如图5所示。具体地，将AP2H多肽(1eq)溶解于DMSO中，加入DOX·HCl(1eq)，混合均匀后，加入DSP(1eq)，再加入Et3N(6eq)，室温反应12h。反应液通过半制备液相色谱柱进行纯化，得到最终产物AP2H-s-s-DOX。经过液相色谱对反应目标物进行纯化后，使用ESI质谱对产物进行了鉴定，可见[M+H]⁺:1787.01,[M+2H]²⁺:894.05,[M+3H]³⁺:596.24等质谱信号，表明成功合成得到目标物AP2H-s-s-DOX(Exact Mass：1785.74)，如图6所示。

(2)AP2H-s-s-DOX的肿瘤细胞靶向识别性能考察

考察了两种细胞(HepG2细胞和Chang Liver细胞)对AP2H-s-s-DOX的摄入情况。将这两种细胞与AP2H-s-s-DOX(10μM)共同孵育，如图7A所示，孵育8h后，在HepG2细胞中能看到明显的红色荧光，表明HepG2细胞已将AP2H-s-s-DOX摄入。在对照细胞Chang Liver细胞中(图7B)，几乎未看到红色荧光。显示了AP2H-s-s-DOX选择性识别肿瘤细胞的能力。然而在HepG2细胞中的红色荧光主要分布在细胞质中，细胞核中较少。表明AP2H-s-s-DOX主要位于细胞质，而只有少部分进入细胞核。

(3)AP2H-s-s-DOX的肿瘤细胞靶向杀伤性能考察

使用标准的MTT法，考察了AP2H-s-s-DOX的靶向肿瘤细胞杀伤性能。实验中使用了两种细胞，HepG2细胞和Chang Liver细胞，将这两种细胞分别与不同浓度的AP2H-s-s-DOX(0.01,0.1,1,5,10μM)共同孵育。如图8所示，AP2H-s-s-DOX与细胞孵育48h后，HepG2和Chang Liver细胞的存活率均未见明显下降。结合荧光成像的实验结果，证明大部分AP2H-s-s-DOX滞留在细胞质中，并未进入细胞核，使阿霉素不能作用于DNA，因而不能对肿瘤细胞产生有效杀伤。由于多肽AP2H靶向的LAPTM4B蛋白是溶酶体四次穿膜蛋白，为了考察AP2H-s-s-DOX在细胞质中的分布与定位，研究药物未能释放的确切原因，发明人对HepG2细胞进行了AP2H-s-s-DOX与商品化溶酶体荧光探针的双染实验，如图9所示，AP2H-s-s-DOX的红色荧光与LysoTracker的绿色荧光共定位良好，表明AP2H-s-s-DOX主要定位于溶酶体，DOX未能进入细胞核，未产生药效。因此，这种靶向溶酶体的，以二硫键偶联的多肽药物缀合物，不能实现靶向肿瘤杀伤的目的。然而，基于AP2H为靶向的多肽药物缀合物定位于溶酶体等酸性细胞器的现象，发明人可以对此加以利用，实现药物的响应性释放。

实施例3 pH响应型多肽药物缀合物-3(AP2H-hydrazone-DOX)的合成

鉴于多肽药物缀合物-2(AP2H-s-s-DOX)在细胞内定位于溶酶体，DOX不能释放进入细胞核的结果，于是设计了一种pH响应性断裂的化学键用于多肽与药物的偶联，从而实现在溶酶体等弱酸性细胞器中释放药物，使药物进入细胞核，进而产生药效。于是将AP2H多肽与阿霉素通过包含pH敏感性腙键的连接手臂偶联在一起，构建多肽药物缀合物-3(AP2H-hydrazone-DOX)。

AP2H-hydrazide由Fmoc固相多肽合成策略合成得到，如图10。Fmoc-甘氨酸-Wang树脂(甘氨酸键合量为0.4mmol/g)用作起始原料。脱保护使用含有20体积％六氢吡啶的DMF溶液，脱保护2次，每次5min。偶联步骤使用3倍摩尔量的Fmoc-氨基酸和3倍摩尔量的HBTU，NMM作为碱性催化剂。每次偶联及脱保护步骤采用Kaiser试剂检测。丁二酸的手臂通过琥珀酸酐(3倍摩尔量)与AP2H末端的氨基在NMM作催化剂的条件下引入。然后加入3倍量Fmoc-肼，HBTU，HOBT与修饰丁二酸手臂的AP2H的树脂在DMF溶剂中室温反应过夜。在脱去Fmoc保护基后，使用DMF，DCM，MeOH分别清洗树脂，并在干燥器中干燥2h。按一定体积分数配制裂解液：95％TFA，2.5％H2O，2.5％TIS，裂解时间为2h。使用砂芯漏斗过滤得到滤液后，使用旋转蒸发仪浓缩滤液，最后加入预冷的乙醚，得到的白色沉淀，在干燥器中干燥2h。粗产品通过半制备液相色谱柱进行纯化。纯化步骤后，AP2H-hydrazide的合成产率为73％。使用液相色谱和质谱对产物进行了鉴定，结果显示成功合成得到目标物AP2H-hydrazide(Exact Mass：1182.63)，如图11所示。

将AP2H-hydrazide(11.8mg，10μmol)，盐酸阿霉素(11.6mg，20μmol)，无水甲醇(3mL)和三氟乙酸(6μL)加入到5mL具塞反应瓶中。在室温黑暗条件下反应24h，反应过程如图10所示，反应液通过半制备液相色谱柱进行分离。冷冻干燥后，AP2H-hydrazone-DOX为红色粉末。AP2H-hydrazone-DOX的合成产率为62％。使用液相色谱、ESI质谱和高分辨率MALDI-TOF质谱对产物进行了鉴定，ESI质谱图中可见[M+H]⁺:1709.01,[M+2H]²⁺:854.93,[M+3H]³⁺:570.57等质谱信号，高分辨MALDI-ToF质谱图中可见分子离子峰1708.79639，表明成功合成得到目标物AP2H-hydrazone-DOX(Exact Mass：1707.79)，如图12所示。

实施例4 AP2H-hydrazone-DOX的pH响应性DOX释放过程考察

考察了不同pH条件下，AP2H-hydrazone-DOX的药物释放过程。(1)正常生理环境(PBS，pH 7.4)；(2)肿瘤组织微酸性环境(PBS，～pH 6.0)；(3)内涵体-溶酶体内酸性环境(PBS，～pH 5.0)。首先将AP2H-hydrazone-DOX溶解在不同的缓冲溶液中，最终的浓度为10μM。将反应溶液放在37℃恒温摇床中，以120r/min的转速孵育。在不同的反应时间点(0，1，2，4，8，12，24，36，48h)，取出100μL样品，进行高效液相色谱-质谱联用分析(平行3次，每次30μL)。

图13显示了HPLC-ESI-ion trap MS对反应液的监测结果，其中，(A)为液相色谱图，监测波长为495nm(DOX的特征吸收峰)；(B)为液相色谱图，监测波长220nm；(C)为液相色谱图中3个色谱峰对应的质谱图。

图14(A)-(C)分别显示了在pH 5.0、pH 6.0和pH 7.4条件下，反应液在不同反应时间(0,1,2,4,8,12,24,36,48h)变化的色谱图，图14(D)显示了HPLC检测AP2H-hydrazone-DOX在不同的pH值条件下(pH 5.0、pH 6.0和pH 7.4)，随着孵育时间的延长，释放DOX的比例。

在pH 5.0条件下，随着孵育时间的延长，AP2H-hydrazone-DOX对应的色谱峰逐渐变小，DOX对应的色谱峰逐渐变大。孵育36h后，AP2H-hydrazone-DOX释放的DOX基本达到平台，释放比例为85％，孵育48h后，DOX的释放比例达到89％。当pH为6.0时，DOX释放速率明显变慢，AP2H-hydrazone-DOX孵育48h后，DOX释放比例为31％。表明腙键对环境中pH值的变化非常敏感。在生理pH 7.4的条件下，DOX的释放量几乎可以忽略。孵育时间达48h后，DOX的释放比例仅为10％，表明AP2H-hydrazone-DOX在正常体液这种中性的pH值条件下十分稳定。AP2H-hydrazone-DOX的pH响应性药物释放性能，加上AP2H的肿瘤细胞靶向功能，使得DOX能集中释放于肿瘤细胞，而不会提前释放在体液中，从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的。

实施例5 AP2H-hydrazone-DOX的细胞摄入与亚细胞器分布分析

采用共聚焦显微镜对AP2H-hydrazone-DOX的细胞摄入与亚细胞器分布进行了分析。具体地，将HepG2细胞和A549细胞与AP2H-hydrazone-DOX(10μM)共同孵育，如图15(A，B)所示，孵育2h后，在HepG2细胞和A549细胞中均能看到明显的红色荧光，表明两种肿瘤细胞对多肽药物缀合物的成功摄入。如图15(G，H)所示，当孵育时间延长到6h后，两种细胞内的红色荧光强度得到显著增强，显示了细胞对AP2H-hydrazone-DOX的持续吞入作用。细胞内红色荧光呈点状分布，表明AP2H-hydrazone-DOX极有可能分布于内涵体-溶酶体等细胞器中。作为对照细胞系，选择了HEK293细胞(人胚肾细胞，正常细胞系)，将其与AP2H-hydrazone-DOX共同孵育，如图15(C，I)所示，孵育2h和6h后，细胞中均未发现任何红色荧光。作为对照实验，三种细胞分别与DOX共同孵育。如图15(D，E，F，J，K，L)所示，三种细胞中均可观察到明显的红色荧光信号，表明DOX无选择性地进入肿瘤细胞和正常细胞。通过AP2H多肽的靶向识别作用，AP2H-hydrazone-DOX由LAPTM4B蛋白介导的内吞作用选择性地进入肿瘤细胞。

为了进一步考察内吞进入细胞的AP2H-hydrazone-DOX在亚细胞层面上的分布情况，发明人对细胞进行了双染实验。使用AP2H-hydrazone-DOX与Hoechst 33342(一种商品化细胞核指示染料，蓝色荧光)对HepG2与A549进行双染，如图15(A，B)所示，HepG2与A549两种细胞在红色与蓝色通道中均能检测到荧光信号，细胞核中红色荧光和蓝色荧光的重叠表明从AP2H-hydrazone-DOX释放的DOX主要分布在细胞核中，这种亚细胞的定位特性，与自由DOX的性质是相关的。与此同时，在两种细胞的细胞质中也能观察到红色荧光，表明AP2H-hydrazone-DOX主要分布于细胞质，而释放的药物DOX则通过扩散作用进入细胞核。

为了进一步考察AP2H-hydrazone-DOX进入细胞后是否进入某种特定的细胞器，发明人进行了AP2H-hydrazone-DOX与LysoTracker(一种商品化溶酶体指示染料，绿色荧光)的双染实验。如图16所示，绿色荧光与细胞核外的红色荧光重叠良好，显示了在细胞质中的AP2H-hydrazone-DOX定位于溶酶体中，这种实验结果与LAPTM4B蛋白在细胞中的分布是相关的，LAPTM4B蛋白在细胞膜上和内涵体-溶酶体中呈现动态分布，这也是其介导靶向药物进入细胞的原理。

以上实验结果表明：通过AP2H多肽的识别作用，AP2H-hydrazone-DOX与肿瘤细胞膜表面的LAPTM4B蛋白结合，通过LAPTM4B蛋白的胞吞作用，介导进入细胞内涵体与溶酶体，在这些细胞器的酸性pH环境中，腙键断裂，释放DOX。进一步DOX逃离溶酶体，扩散进入细胞核，嵌入DNA，达到杀伤细胞的目的。

实施例6 AP2H-hydrazone-DOX的靶向肿瘤细胞杀伤性能

AP2H-hydrazide，AP2H-hydrazone-DOX或DOX的储备液由细胞培养液稀释至不同浓度，并与细胞共同孵育，最终的浓度分别为0.01μM，0.1μM，1μM，10μM。培养48h后，细胞存活率使用MTT方法测定。评价药物细胞毒性的IC50值由存活率-浓度曲线拟合得到。

如图17所示，AP2H-hydrazone-DOX与细胞孵育48h后，HepG2和A549细胞的存活率明显下降，分别下降到26.6％和29.2％，表明其对肿瘤细胞的有效杀伤作用。作为对照，HEK293细胞的存活率与未加药的HEK293细胞组相当(98.1％)，显示了AP2H-hydrazone-DOX对正常细胞没有毒副作用。这与激光共聚焦实验中，AP2H-hydrazone-DOX选择性地进入肿瘤细胞，而不进入正常细胞的结果相互吻合。当三种细胞与自由的DOX孵育时，三种细胞的存活率均有明显的下降，HEK293细胞的存活率下降到57.0％，这样的结果也表明抗癌药物DOX在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也具有明显的毒副作用。为了排除AP2H-hydrazide可能的影响，对照实验中三种细胞与AP2H-hydrazide共同孵育，结果显示AP2H-hydrazide对三种细胞几乎均没有杀伤作用，这也表明了AP2H-hydrazone-DOX的肿瘤杀伤能力来源于释放的药物DOX，而不是AP2H-hydrazide部分，而选择性肿瘤细胞识别的性能来源于AP2H-hydrazide。

更进一步，AP2H-hydrazone-DOX的细胞杀伤效能通过将细胞与不同浓度的药物孵育来考察。测试的药物浓度分别为0.01、0.1、1、5、10μM。如图18所示，AP2H-hydrazone-DOX对两种肿瘤细胞呈现剂量依赖的杀伤能力。当药物浓度为10μM时，AP2H-hydrazone-DOX对HepG2细胞的杀伤能力与自由的DOX相当。对于自由DOX与AP2H-hydrazone-DOX，计算得到的IC50值分别为0.75μM和4.0μM。A549细胞实验也得到了相似的结果，对于自由DOX与AP2H-hydrazone-DOX，计算得到的IC50值分别为0.14μM和1.14μM。AP2H-hydrazone-DOX的IC50值高于DOX，可能是由于DOX需要经过腙键断裂，从内涵体、溶酶体中逃逸出来并扩散进入细胞核等多个步骤所致。但其优异的靶向性，对正常细胞的低毒副作用，使其在肿瘤治疗中具有优势。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。