分子定点靶向和激活的短肽阿霉素的制备和用途的制作方法

本发明涉及药物化学，具体涉及阿霉素抗肿瘤药物，尤其涉及双靶向激活的阿霉素衍生物及其制备和用途。
背景技术：
：盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)为已上市传统化疗药物，其结构式如下所示：盐酸阿霉素的抗瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀灭作用，适用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。盐酸阿霉素的作用机制主要是阿霉素分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。然而，这一蒽环类化合物因为具有严重的毒副作用，包括骨髓毒性，胃肠疾病，口腔炎，脱发，外渗，急性和累积性心脏毒性。因此，临床上应用时而盐酸阿霉素的使用剂量受到限制。盐酸阿霉素的主要限制是在每个疗程后，大剂量盐酸阿霉素导致骨髓和血液中单核细胞和血小板急剧减少。特别令人关切的是累积性心脏毒性能够引发心肌充血性心力衰竭，是不可逆转的。因此，需要将传统盐酸阿霉素或其衍生物改变为分子定点靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物。技术实现要素：本发明通过系列试验证明了分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物具有抗肿瘤特异双靶向激活特性。相对于阿霉素或其衍生物和单一靶向分子，抑制肿瘤的广谱性和抑制的药效具有很大的提高，更为关键的是药物的化疗毒性大大降低，并且出现了意想不到的治疗转移和放疗及免疫治疗的协同效果，具有非常好的应用前景。迄今为止，尚未有专利和文献报道本发明，因此，本发明提供了一种新颖的分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物用于治疗人体肿瘤的有效方法，具有非常好的应用前景和巨大的社会效益。具体而言，本发明提供具有下式I所示结构的化合物：式中，X为极性和非极性不带电荷的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸；Z为阿霉素、表阿霉素或吡喃阿霉素，其中，Z通过其氨基与式I中的乳糖-XANL部分相连。在一个具体实施例中，X为丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甘氨酸。在一个具体实施例中，Z为阿霉素，所示式I化合物具有下式II结构：式中，X为前述所定义的氨基酸残基，优选选自丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。在一个具体实施例中，所示式II化合物选自：在一个具体实施方式中，式I化合物的结构如下式III所示：式中，X的定义与式I中X的定义相同。在一个具体实施例中，式III中，X选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一个具体实施例中，式III化合物为如下的S7：Lacto-AANL-表阿霉素：在一个具体实施例中，式I化合物具有下式IV所示的结构：式中，X的定义相同。在一个具体实施例中，式IV中，X选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一个具体实施例中，式IV化合物为如下的S8：Lacto-AANL-吡喃阿霉素：本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明式I的化合物或其药学上可接受的盐。在一个具体实施例中，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供一种药盒，该药盒含有本发明药物组合物。本发明提供本发明式I化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症用的药物中的用途。在一个具体实施例中，所述癌症是实体癌。在一个具体实施例中，所述癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如支气管肺癌，包括未分化小细胞性和非小细胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、血癌(例如慢性或急性白血病，包括淋巴细胞性和粒细胞性白血病)、恶性淋巴瘤、纤维素肉瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、甲状腺癌和头颈部鳞癌。本发明还提供一种疾病治疗方法，所述方法包括向需要治疗的对象提供治疗有效量的本发明式I的化合物或其药学上可接受的盐，或治疗有效量的本发明药物组合物。在一个具体实施例中，所述疾病是癌症。在一个具体实施例中，所述癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如支气管肺癌，包括未分化小 细胞性和非小细胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、血癌(例如慢性或急性白血病，包括淋巴细胞性和粒细胞性白血病)、恶性淋巴瘤、纤维素肉瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、甲状腺癌和头颈部鳞癌。附图说明图1显示分子定点靶向和激活的短肽阿霉素的双靶向分子受体在肿瘤细胞表面分布相同。荧光共聚焦显微镜检测对应抗体标记的MDA-MB435肿瘤细胞，天冬氨酸肽链内切酶(左1，绿色)，唾液酸糖蛋白受体(左2，红色)，细胞核染色用DAPI(蓝色)，两图合并共同分布为黄色(左3)。图2显示本发明S1，S2，S3，S4，S5和S6溶液在裸鼠中的药效研究。图3显示：与Succinyl-AANL-DOX相比，S1静脉注射后具有更多的肿瘤组织分布和渗透。具体实施方式本发明所述“分子定点靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物”是指本发明所述化合物通过双靶向肿瘤表面特有的并共同分布的去唾液酸糖蛋白受体和天冬氨酸肽链内切酶，而只在肿瘤微环境中聚集和专一性激活释放药物的活性成分。本发明提供的分子定点靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物，由于在阿霉素或其衍生物上结合了所述短肽侧链，从而封闭了化合物毒性或活性，同时由于双定点靶向于肿瘤部位激活阿霉素或其衍生物，单一定位不激活药物，而提供了更为精确靶向治疗肿瘤的方法，实验结果发现分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物可以成为更为广谱性抗肿瘤药物，对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效，并且分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物于定点放疗具有协同治疗效果，并可通过杀伤肿瘤免疫抑制细胞而提高免疫治疗的协同效果，因此可以制备成以前没有的高效靶向可协同作用的抗肿瘤化疗药物。本发明阿霉素衍生物包括表阿霉素和吡喃阿霉素。本发明化合物的结构如式I所示，优选式II、式III和式IV的化合物，更优 选化合物S1－S8。本发明包括式I化合物的药学上可接受的盐，其的例子包括无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。本发明的药物组合物可含有本发明式I所述的化合物或其药学上可接受的盐，优选含有式II、式III和式IV的化合物，更优选含有化合物S1－S8。药物组合物中还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。载体或赋形剂可以是本领域周知的各种药学上可接受的载体或赋形剂，并依药物剂型或施用方式不同而不同。在一具体实施例中，药物组合物中含有溶媒、增溶剂/助溶剂、pH调节剂、冻干赋形剂和渗透压调节剂中的一种或多种。适用于本发明的冻干赋形剂包括糖类(例如乳糖、麦芽糖、右旋糖酐、葡萄糖、果糖)、氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、甘露醇、酒石酸、马来酸、柠檬酸、氯化钠和环糊精(例如羟丙基β环糊精、磺丁基β环糊精)中的一种或多种。适用于本发明的pH调节剂包括盐酸、磷酸、硫酸、碳酸、硝酸、醋酸、枸橼酸、DL-酒石酸、D-酒石酸、L-酒石酸、氢氧化钠、氢氧化钾、葡甲胺、马来酸、乙二胺、三乙胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、马来酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种。适用于本发明的溶媒优选为有机溶媒，包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、叔丁醇、甘油、吐温、大豆油、羟丙基β环糊精溶液和磺丁基β环糊精溶液中的一种或多种。适用于本发明的渗透压调节剂包括葡萄糖、氯化钠、甘露醇和乳酸钠中的一种或多种。适用于本发明的增溶剂/助溶剂包括吐温80、吐温60、波洛沙姆、羟丙基β环糊精、聚乙二醇(PEG)十二羟基硬脂酸锂、磺丁基β环糊精、PVP、甘油和聚氧乙烯蓖麻油中的一种或多种。一般情况下，对哺乳动物每天口服给予本发明化合物或其药学上可接受的 盐，药量通常为约0.0025到50毫克/公斤体重，最好是约0.01到10毫克/公斤体重。如果同时施用一个已知的抗癌药物或施与其它治疗，其剂量应可有效地实现其预期的目的。这些已知的抗癌药物的最佳剂量是本领域技术人员所熟知的。单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物或其药学上可接受的盐。单位剂量可给予一次或多次，每天为一剂或多剂，每剂含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其药学上可接受的盐。本发明化合物或药物组合物可用于治疗已知能用阿霉素或其衍生物(如表阿霉素和吡喃阿霉素)治疗的各种疾病，尤其是各种癌症，包括但不限于膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如支气管肺癌，包括未分化小细胞性和非小细胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、血癌(例如慢性和急性白血病，包括淋巴细胞性和粒细胞性白血病)、恶性淋巴瘤、纤维素肉瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、甲状腺癌和头颈部鳞癌等。本发明的化合物或药物组合物还可用于阻止肿瘤转移，尤其是阻止肿瘤肺转移。在一个实施例中，本发明的化合物或药物组合物可用于阻止乳腺癌肺转移。本发明的化合物或药物组合物还可用于与放疗一同治疗癌症，尤其是例如乳腺癌。由于化疗药物损伤免疫系统，目前免疫抑制调节点的PD-1抗体等肿瘤免疫治疗无法同期与紫杉醇等传统化疗药物结合使用。肿瘤通过分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制并直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。肿瘤相关巨噬细胞(M2-MΦ型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)确认标记就是豆荚蛋白酶的表达。本发明的化合物或药物组合物只在肿瘤局部激活，避免了传统化疗药物会损伤免疫系统的缺陷，研究发现本发明的化合物或药物组合物不仅对机体的免疫系统没有毒性作用，反而可以通过抑制肿瘤相关巨噬细胞而具有刺激免疫的 协同治疗作用，能够同免疫治疗联合使用，提高癌症的治愈率。因此，本发明的化合物或药物组合物还可以用于抑制肿瘤相关巨噬细胞，因而具有刺激免疫的协同治疗作用。因此，本发明化合物或药物组合物能同免疫治疗联合使用，如Pd-1抗体和PdL2-HSA蛋白等免疫治疗联合使用，提高癌症的治愈率。在一个具体实施例中，本发明的化合物或药物组合物与免疫治疗联用治疗肺癌。因此，本发明包括癌症治疗方法，包括给予需要的患者治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明还包括阻止肿瘤转移的方法，包括给予需要的患者治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。阻止肿瘤转移包括但不限于阻止肿瘤肺转移和/或骨转移。TAM作为一种关键的炎性细胞在肿瘤相关炎症中扮演极其重要的角色。在肿瘤微环境中，TAM通过影响肿瘤各方面的生物学特性来促进肿瘤发展。它分泌一些分子(如EGF)来直接促进肿瘤细胞的生长，促进血管新生，从而为癌细胞的浸润和转移创造条件，同时还能抑制获得性免疫行使功能。因此，本发明还包括抑制肿瘤相关巨噬细胞的方法，包括给予需要的患者治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。通过抑制肿瘤相关巨噬细胞，可抑制肿瘤生长、抑制血管新生，并抑制癌细胞的浸润和转移，促进抗肿瘤免疫，从而实现癌症的预防和/或治疗。在一个具体实施例中，肿瘤相关巨噬细胞表达豆荚蛋白酶，为M2-MΦ型。本发明上述方法可与本领域已知的放疗或免疫疗法联用。因此，本发明还包括用于上述各种方法或用途的本发明化合物、其药学上可接受的盐，或本发明药物组合物。本发明也包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备治疗或预防癌症及癌症转移(尤其是上述癌症转移)用的药物中的用途。本发明也包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞、抑制肿瘤生长、抑制血管新生、抑制癌细胞的浸润和转移和/或促进抗肿瘤免疫用的药物中的用途。本发明还提供一种降低阿霉素或阿霉素衍生物毒副作用的方法，所述方法 包括将阿霉素或阿霉素衍生物经由短肽与能与唾液酸糖蛋白受体结合的部分偶联，形成偶联物，其中，所述短肽能被天冬氨酸肽链内切酶切割，从而允许所述抗癌药从所述偶联物中释放出来。能与唾液酸糖蛋白受体结合的部分包括但不限于乳糖部分，例如本申请式I中与X连接的乳糖部分。适用的短肽包括XANL，其中X如前文所定义。通常，阿霉素或其衍生物通过其氨基与短肽的羧基缩合，形成肽键。本发明通过试验发现(1)分子定点靶向和激活的短肽阿霉素在肿瘤表面共同表达去唾液酸糖蛋白受体和天冬氨酸肽链内切酶的位点处具有聚集，滞留的靶向效应，具有分子定点靶向肿瘤的特性。(2)分子定点靶向和激活的短肽阿霉素通过分子定点靶向能够刺激倍增激活效率，在肿瘤部位定点激活产生阿霉素。(3)在体外体内代谢实验中双靶向激活的阿霉素在血液中并不激活，具有长期的血液稳定性和对正常组织器官低毒的特性。(4)双靶向激活的阿霉素的毒性相比单一靶向的阿霉素大大降低。(5)由于化学结构间的构效关系和极性改变，分子定点靶向和激活的短肽阿霉素相比单一靶向的阿霉素的激活效率更高，而连接其他毒物则不能激活。(6)分子定点靶向和激活的短肽阿霉素因为高效激活，直接能够改变单一靶向适应症限制的情况，开发成为更为广谱性抗肿瘤药物。(7)肿瘤细胞转移时表达有更大量的被靶向双分子，所以分子定点靶向和激活的短肽阿霉素对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。(8)分子定点靶向和激活的短肽阿霉素用于定点放疗合并治疗时，放疗会导致两个靶分子共同表达增高，实验发现具有对照化合物没有的协同治疗药效。(9)化合物中的阿酶素结构可替换为表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影响药物的激活效率和抗癌效果。(10)部分肿瘤免疫抑制细胞有表达的被靶向双分子，分子定点靶向和激活的短肽阿霉素可通过杀伤肿瘤免疫抑制细胞而提高免疫治疗效果，不同于传统化疗药物会损伤整体免疫系统，解决免疫治疗很难与化疗药物结合使用的弊端。应理解，本发明“含有”、“包括”也包括“由……组成”、“由……构成”。所有重量百分比或体积百分比之和应等于100％。实施例中使用到的各种试剂和产品，除非另有说明，否则为市售产品；对于所涉及的方法，除非另有说明，否则按常规技术实施。下述实施例并非是对本发明范围的限制。下面结 合实施例对本发明的技术方案做进一步地说明。实施例1本发明人研究发现，分子定点靶向和激活的短肽阿霉素的双靶向分子受体在肿瘤细胞表面分布相同(见图1)。在MDA-MB231乳腺癌肿瘤细胞的免疫荧光染色中发现，唾液酸糖蛋白受体和天冬氨酸肽链内切酶的位点分布相同。用荧光共聚焦显微镜检测对应抗体标记的唾液酸糖蛋白受体与天冬氨酸肽链内切酶，细胞核染色用DAPI。双靶向分子受体共同分布存在，可以使药物在靶向分子附近积累和滞留，提高药物的局部浓度和激活效率。实施例2：化合物构象效应的筛选和对药物激活的影响本发明提供的分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物，实验思路来源于依靠我们特有的合成技术，通过大量的合成难以合成的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到阿霉素或其衍生物上，再通过肿瘤组织激活效率的大小进行筛选，并依次筛选所得化合物在不同短肽，不同基团，不同毒物对肿瘤的激活促经作用。肿瘤组织特异性的激活位点是短肽，因为天冬氨酸肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。S1～S8样品化合物和部分对照化合物统一溶解，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在本发明的实验中，在37℃、2小时条件下在100微克酸化的人肝癌(HepG2)肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物，肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放阿霉素/阿霉素衍生物，通过HPLC能够检测化合物的减少和阿霉素/阿霉素衍生物的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率〔指被酶剪切而释放出来的阿霉素占原化合物的比例〕。下表1显示了激活效率。表1：S1～S8和部分对照化合物激活效率化合物激活效率(％)C1:AANL-DOX35.4C2:CH3-TANL-DOX37.9C3:peg-VANL-DOX31.4C4:Succinyl-AANL-DOX36.7C6:BOC-AANL-DOX29.3C7:Lacto-RANL-DOX1.1C8:Lacto-FANL-DOX4.7C9:Lacto-DANL-DOX5.8C10:Lacto-ASNL-DOX1.3C11:Lacto-AVNL-DOX2.4C12:Lacto-ATNL-DOX2.4S1:Lacto-AANL-DOX95.5S2:Lacto-TANL-DOX89.5S3:Lacto-VANL-DOX72.4S4:Lacto-LANL-DOX85.4S5:Lacto-IANL-DOX72.4S6:Lacto-GANL-DOX65.4S7:Lacto-AANL-表阿霉素92.8S8:Lacto-AANL-吡喃阿霉素90.7上述结果说明：本发明定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物不同基团的连接对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。C7～C9不被激活说明，短肽第一位置不能为芳香或带电荷的氨基酸。C10～C12不被激活说明，短肽第二位置只能为丙氨酸。S1，S2，S3，S4，S5，S6在相同肿瘤类型中的激活倍增说明短肽第一位置可以为极性和非极性不带电荷的氨基酸。S1，S2，S3，S4，S5，S6化合物的各基团选择是相对激活效率倍增的最佳搭配(表1)。S7和S8在相同肿瘤类型中的激活倍增说明阿酶素可以替换成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影响激活活性。通过筛选实验的结果和与C1～C6对比，由此推测Lacto的连接不会带来空间位阻，同时能够增加切割位点的极性，增强化合物与酶切位点的相互作用，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点，增加激活效率。实施例3：分子定点靶向和激活的短肽阿霉素比单点靶向具有特殊的组织分 布特性S1，S2，S3，S4，S5，S6化合物能够靶向唾液酸糖蛋白受体与天冬氨酸肽链内切酶，而本发明以前的研究中Succinyl-AANL-DOX没有。由于DOX，Succinyl-AANL-DOX和S1，S2，S3，S4，S5，S6具有自发荧光，可用荧光显微镜检测肿瘤组织中它们的分布情况。静脉注射10umol/kg的Succinyl-AANL-DOX和S1，S2，S3，S4，S5，S6。12小时后检测肿瘤组织切片的药物分布图像和肿瘤组织匀浆荧光强度。细胞核染色用DAPI。与Succinyl-AANL-DOX相比，S1静脉注射后具有更多的肿瘤组织分布和渗透，说明S1分子定点靶向使它们比Succinyl-AANL-DOX具有很强的肿瘤部位的滞留效应(见图3)。实施例4：激活研究检测分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物比单点靶向具有治疗的广谱性使用溶剂1(50％注射用水，45％～49％酒精，1％～5％吐温80)统一溶解S1～S8(实施例11-12制得)，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。37℃下，将1毫克/毫升的样品化合物加到100微克酸化的肿瘤组织匀浆(pH6.0)中。通过HPLC检测化合物的减少和产物的增加。实验结果如下表2所示。表2：不同肿瘤组织匀浆中的S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8的化合物激活效率(％)产生肿瘤的细胞S1S2S3S4S5S6S7S8人纤维肉瘤HT-108079.780.472.979.674.559.656.768.4人乳腺癌MDA-MB43597.396.495.497.894.487.867.475.4人卵巢癌SK-OV-393.489.684.368.883.348.857.473.5人结肠癌HT-2984.494.996.495.693.565.678.585.4人慢性白血病K56249.758.355.259.253.649.267.563.8人胰腺癌Panc-199.898.896.598.196.368.189.479.4人非小细胞肺癌A54991.494.486.488.687.368.694.578.6人前列腺癌PC-392.393.491.398.592.368.591.578.6人肾癌OS-RC-291.496.591.495.590.465.578.588.5人心脏无无无无无无无无唾液酸糖蛋白受体在各种肿瘤细胞都有表达，在肝细胞和肝癌细胞为高表达，由于药物释放的低效性，以前的单一靶向唾液酸糖蛋白受体的药物通常只针对肝癌有一定效果，局限了药物的广谱性。而由于双靶向分子受体共同分布特点以及酶分子可重复激活的特性，分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物有更为集中的靶向和更高的激活效果。实验证明本发明分子定点靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物在不同肿瘤都有很好的激活效果，具有的治疗的广谱性。实施例5：本发明分子定点靶向和激活的短肽阿霉素具有更低的毒性试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD(最大耐受剂量)实验，了解本发明阿霉素衍生物的急性毒性。试验药物：S1，S2，S3，S4，S5和S6注射液和对照药物使用注射用水统一溶解，试验时用生理盐水稀释到相应剂量。动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重19-21g，全为雌性。方法和结果：受试BALB/C小鼠36只，体重19-21g，全为雌性，按体重随机分为7组，每组10只。如表3所示，按表3中所示剂量分别一次性静脉注射S1，S2，S3，S4，S5和S6。并进行生理盐水组、阿霉素组注射液(市售，北京悦康)的对照试验，每个小鼠给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。死亡率结果如下表3所示。表3：受试小鼠分别接受不同剂量的S1，S2，S3，S4，S5和S6注射液以及生理盐水、阿霉素注射液的死亡率结果组别剂量(mg/kg)动物(只)死亡数(只)死亡(％)1生理盐水0mg/kg10002S1125mg/kg10003S1150mg/kg10004S1175mg/kg10005S1200mg/kg102206S2125mg/kg10007S2150mg/kg10008S2175mg/kg10009S2200mg/kg1022010S3125mg/kg100011S3150mg/kg100012S3175mg/kg100013S3200mg/kg1033014S4125mg/kg100015S4150mg/kg100016S4175mg/kg100017S4200mg/kg1022018S5125mg/kg100019S5150mg/kg100020S5175mg/kg100021S5200mg/kg1011022S6125mg/kg100024S6150mg/kg100024S6175mg/kg100025S6200mg/kg1022026S7125mg/kg100027S7150mg/kg100028S7175mg/kg1011029S7200mg/kg1033030S8125mg/kg100031S8150mg/kg100032S8175mg/kg101133S8200mg/kg1033034阿霉素35mg/kg10440％35阿霉素40mg/kg10890％36Succinyl-AANL-DOX75mg/kg100037Succinyl-AANL-DOX100mg/kg1055％38Succinyl-AANL-DOX125mg/kg10880％39Succinyl-AANL-DOX150mg/kg1010100％结果显示，注射本发明的S1、S2、S3、S4、S5和S6溶液的小鼠组，在175mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况。如表3所示S1和S2溶液的MTD值(最大耐受剂量)为175mg/kg，远大于阿霉素的MTD值25mg/kg和Succinyl-AANL-DOXMTD值75mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明定点靶向和激活的短肽阿霉素S1，S2，S3，S4，S5和S6的毒性因为其靶向的聚集效应使毒性比Succinyl-AANL-DOX更为降低。实施例6：本发明S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S8溶液在裸鼠中的药效研究试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1～S8化合物的抗肿瘤药效。试验药物：S1～S8溶液(同实施例5样品)；阿霉素注射液(市售，同上)；试验时用生理盐水稀释到相应浓度；对照组为生理盐水。方法和结果：1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性，上海斯莱克实验动物有限公司。2.产生肿瘤模型1)人肝癌HepG2(细胞)从美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。2)肿瘤产生，将5×106HepG2细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至 少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。3)治疗过程根据S1～S8临床用药使用IV注射，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8治疗组、阿霉素治疗组以及Succinyl-AANL-DOX治疗组都使用1/3MTD的剂量，对照组使用生理盐水，每周给药一次，共4周。4)分组与结果测量如图2所示。5)抑瘤率计算如表4。表4：S1～S8药物、阿霉素及对照组对裸鼠治疗肿瘤的效果组别动物(只)24天肿瘤平均大小(mm3)24天抑瘤率S1组100100％S2组100100％S3组100100％S4组100100％S5组100100％S6组100100％S7组100100％S8组100100％阿霉素治疗组101572.18±895.5629.4％Succinyl-AANL-DOX10812.47±495.4669.3％对照组(生理盐水)102227.81±1104.74_5)结果与讨论：如表4所示，与等毒性的阿霉素药物治疗组，Succinyl-AANL-DOX治疗组比较，S1、S2、S3、S4、S5和S6治疗组能够治愈肿瘤，说明药物S1、S2、S3、S4、S5和S6具有更好的疗效。S7和S8能够治愈肿瘤说明阿酶素可以替换成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影响药物的疗效。实施例7：S1化合物在多肿瘤模型的药效研究试验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解S1的抗肿瘤药物的广谱性。治疗药物：S1溶液(同实施例5样品)，试验时用生理盐水稀释到相应浓 度。方法和结果：1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性(上海斯莱克实验动物有限公司)。2.产生肿瘤模型1)对应的细胞从美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。2)肿瘤产生，将5×106对应细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。3)治疗过程使用1/3MTD的剂量，每周一次给药，共3周。4)分组与结果测量如下表5所示。表5：S1在多肿瘤模型的治疗效果组别肿瘤细胞抑瘤率(24天)人乳腺癌MDA-MB435100％人卵巢癌SK-OV-368.6％人结肠癌HT-2989.7％人慢性白血病K56247.9％人直肠癌HT108096.3％人胰腺癌Panc-1100％人非小细胞肺癌A54975.6％人肝癌HepG2100％人肾癌OS-RC-265.7％5)结果与讨论：如表5所示，S1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物不但可以肝癌，而且是一个广谱性的肿瘤治疗药物。实施例8：S1～S8药物在BALB/C小鼠的转移模型中的药效研究试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1～S8药物的抗肿瘤转移药效。试验药物：S1～S8溶液(同实施例5样品)；阿霉素注射液(市售，同上)；试验时用生理盐水稀释到相应浓度；对照组为生理盐水。1.动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，6-8周龄，全为雌性。2.产生肿瘤模型1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。2)肿瘤产生，将5×1064T1细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始低剂量定位放射治疗，每周1次，共3周。以开始治疗当天为第一天。3)治疗过程根据S1～S8临床用药使用IV注射，S1～S8治疗组、阿霉素治疗组以及Succinyl-AANL-DOX治疗组都使用1/3MTD的剂量，对照组使用生理盐水，放疗后的第4天给药，共3周。4)分组与结果测量如表6所示。表6：S1～S8药物、阿霉素治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果组别动物数量转移肿瘤数量抑制转移率S1组100100％S2组100100％S3组102±098.7％S4组109±976.1％S5组1011±1192.4％S6组1042±971.2％S7组100100％S8组100100％阿霉素治疗组10143±552.1％Succinyl-AANL-DOX治疗组10115±2121.5％溶媒对照组10146.0±46—5)结果与讨论：如表7所示，与阿霉素治疗组对照组比较，在S1、S2、S3、S4、S5和S6组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。S7和S8能够治愈肿瘤转移说明阿酶素可以替换成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影响药物的疗效。实施例9：S1～S8药物在BALB/C小鼠用于放射性治疗中协同治疗药物的用途的药效研究试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1～S8药物的用于放射性治疗中协同治疗药物的用途的药效。试验药物：S1～S8溶液(同实施例5样品)；阿霉素注射液(市售，同上)；试验时用生理盐水稀释到相应浓度；对照组为生理盐水。1.动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，6-8周龄，全为雌性。2.产生肿瘤模型1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。2)肿瘤转移的产生，将106个T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’ssolution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。3)治疗过程：使用IV注射，S1、S2、S3、S4、S5和S6都使用1/6MTD的剂量，即12毫克/公斤剂量；阿霉素药物治疗组使用1/6MTD的剂量，即4毫克/公斤剂量；S7和S8使用12毫克/公斤的剂量；对照组使用生理盐水；每三天一次给药，共4次。4)放疗组与非放疗组肿瘤组织匀奖的western-blot检测靶点表达相对强度 比较如下表7所示：表7组别肿瘤数量去唾液酸糖蛋白受体天冬氨酸肽链内切酶放疗组53462±16356324±1563非放疗组51462±4671243±7835)分组与结果测量如表8所示。表8：S1～S8、阿霉素治疗组及对照组对于中协同治疗药物的用途的药效6)结果与讨论：肿瘤定点放疗导致去唾液酸糖蛋白受体表达增加，而天冬氨酸肽链内切酶更是成倍增加，因此可能导致药物的靶向激活效率大增。如表8所示，与对照组比较，在S1～S8组给药后，极大提高了放疗的协同治疗效果，能够治愈一般化疗药物和放疗难以治愈的4T1实体瘤，而阿霉素和Succinyl-AANL-DOX无协同治疗效果。实施例10：S1～S8化合物在D121肿瘤免疫模型的药效研究1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限公司。2)肿瘤免疫，小鼠腹腔注射5x105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。下表9中的免疫组就是用D121肺癌细胞免疫，而无D121死肿瘤细胞免疫组注射生理盐水为对照。3)肿瘤产生：在免疫过程结束之后(4周后)，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗，记录计小鼠肿瘤大小(mm3)，并与溶媒对照组相比计算抑瘤率。4)治疗过程：使用IV注射，S1～S8都使用1/6MTD的剂量，每周一次。免疫抑制调节点蛋白PdL2-HSA(自产)IV注射治疗每周一次。共三周疗程。5)肿瘤CD8+T细胞(T淋巴细胞亚群)分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液 PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。6)分组与结果测量如下表9所示。表97)结果与讨论：与对照组和无免疫治疗组相比较，S1～S8在联合治疗中具有非常好的协同药效，联合治疗具有良好的促进免疫CD8+T上升的效果，导致CD8:CD45阳性细胞增殖。而Succinyl-AANL-DOX和LeuDOX不改变免疫治疗的效果。实施例11：分子定点靶向和激活的短肽阿霉素合成路线S1的合成路线如下：1)Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(I)的合成将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(100g，0.45mol)溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(72.6g，0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(103.3g，0.54mol)，搅拌反应1小时后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g，0.45mol)和N，N-二异丙基乙基胺(173.8g，1.34mol)的N，N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物经乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到纯品为白色固体I，即Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(101g，收率：73.1％)。2)Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(II)的合成将Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(100g，0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1摩尔/升氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至PH<6，减压蒸除四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II，即Cbz-Ala-Ala-OH(88g，收率：92.2％)。3)Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(III)的合成在三颈瓶中将L-亮氨酸叔丁酯(22.4g，0.1mol)，N-Fmoc-N’-三苯甲基天冬酰胺(59.6g，0.1mol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(1000mL)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(14.85g，0.11mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺 盐酸盐(23g，0..12mol)，冰浴至0℃下后，加入N，N-二异丙基乙基胺(25.8g，0.2mol)，搅拌10小时后，减压蒸出溶剂，粗产品溶于氯仿(1000ml)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液及水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸出溶剂得到的粗产品经重结晶(按体积比计，二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:1)纯化后得到白色固体III，即Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(42.4g，收率：55.4％)。4)L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(IV)的合成将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(7.65g，0.01mol)溶于二氯甲烷(100mL)和N，N-二甲基甲酰胺(100mL)的混合溶液中，加入哌啶(40ml)，室温下搅拌5小时后，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得到IV，即L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，为淡黄色固体，未经纯化直接用于下一步。5)Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(V)的合成将上步所得L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu粗产品溶于N，N-二甲基甲酰胺(200mL)中，加入Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(2.94g，0.012mol)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(6.07g，0.016mol)，冰浴至0℃下后加入N，N-二异丙基乙基胺(2.6g，0.02mol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于氯仿(100ml)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析(按体积比计，二氯甲烷：甲醇＝50:1—20:1)后得到化合物V，即Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu为白色固体(3.1g，二步总收率：37.8％)。6)L-Ala-LAla-L-Asn(Trt)-Leu-OtBu(VI)的合成将Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(10g，12.2mmol)溶于甲醇(400mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温常压下搅拌反应4小时，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，减压蒸除溶剂得到VI，即L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，为白色固体(7.6g，收率：91％)。7)Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(Ⅶ)的合成Lactobionicacid+L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu→Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBuVIVII将乳糖酸(2.0g，5.6mmol)溶于甲醇(100ml)中，升温至回流，反应24小时后，冷却至室温。将L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(1g，1.5mmol)溶解于甲醇(10ml)中，室温滴加至乳糖酸的甲醇溶液中。滴加完毕后，升温至55℃，反应过夜。蒸干反应液，粗品用反相制备纯化，得到Ⅶ，即Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，为白色固体(0.35g，收率24％)。8)Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(VIII)的合成将化合物Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(0.35g，0.34mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温下搅拌1小时后，减压蒸除溶剂，残留物用甲基叔丁基醚洗涤三次，抽滤，干燥，得到白色固体VIII，即Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(0.23g，收率：93％)9)Lacto-AANL-Doxorubicin(S1)的合成将Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(2.3g，0.32mmol)和DIPEA(1.23g)用干燥的N，N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.8g)，搅拌半小时，加入多柔比星(即阿霉素)盐酸盐(1.72g)，避光下反应温度缓慢升高至室温下搅拌3小时，反应液用反相制备纯化得到目标产物S1，即Lacto-AANL-DOX，为红色固体粉末(收率：55％)。S2，S3，S4，S5和S6的合成方法与S1类似，只是氨基酸连接时原料不同，如下表10所示，S7和S8的合成方法与S1类似，只是合成时使用的阿酶素分别替换为表阿酶素和吡喃阿霉素。将对应的R1氨基酸和R2氨基酸溶于N，N-二甲基甲酰胺中，分别加入相同的缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺，于0℃-25℃反应2-24h得到三肽。质谱(MS)检测结果确认S1-S8化合物(n＝1)分子量依次如下表，与结构计算预测的分子量相一致。表10实施例12：药品处理本发明化合物S1～S8(实施例11制得)和对照化合物C1，C2，C3经过冷冻干燥(-70℃)，在无菌室进行分装。在动物实验前，S1～S8在无菌室中可用注射用水溶解，再用注射用水稀释到所需浓度。S1，S2，S3，S4，S5、S6、S7和S8使用分析型HPLC(安捷伦1220，C8柱5μm，4.6mmIDx250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)测得纯度在95％-99％。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。当前第1页1 2 3