通过双重免疫生物刺激来治疗肿瘤、获得性免疫缺陷综合征和白血病的疗法的制作方法

本发明涉及一种用于治疗人类和动物的肿瘤、获得性免疫缺陷综合征和白血病的组合物。作为人类和动物的抗肿瘤剂的本发明的组合物包含一种混合物，所述混合物包含或优选由以下组成：能够强烈刺激促炎性细胞因子(th1)干扰素inf-γ的产生的罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lre03dsm23879细菌菌株，所述细胞因子显示出显著的抗肿瘤活性，和/或能够强烈刺激树突细胞的产生的唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)ls06dsm26037细菌菌株，所述树突细胞也显示出显著的抗肿瘤活性。

目前关于肿瘤学已知的医学疗法包括化疗、内分泌治疗、用免疫应答调节剂进行的治疗和用分子靶向药物进行的治疗。抗肿瘤化疗的主要目的是杀死处于任何细胞周期阶段的赘生性细胞，并因此减少原发肿瘤和转移肿瘤。

已知抗肿瘤化疗治疗会降低免疫系统的活性，且受损的免疫系统不能保护机体免受病毒和细菌感染。

此外，已知化学治疗(化疗)主要影响肿瘤，但不幸的是，它也造成对健康组织的副作用，特别是具有快速增殖和周转的组织，例如食管粘膜、胃粘膜和肠粘膜，从而导致黏膜炎、恶心、呕吐、腹泻、营养吸收不良及因此引起的营养不良。

因此，所有化疗剂的共同点为：骨髓毒性，其进而导致免疫抑制和继发感染(主要是由革兰氏阴性细菌和诸如念珠菌属等真菌引起)、胃肠道上皮毒性和肠道微生物群毒性(化疗抗生素)。

因此，需要能够减轻化疗治疗的常见副作用的天然、有效和耐受性好的组合物。

因此，为了预防和/或减少用于肿瘤治疗的化学治疗的症状和副作用，对辅助疗法仍有强烈需要。

此外，仍需要能够通过刺激免疫系统(免疫刺激)而作用于免疫系统以恢复其功效的化疗辅助疗法，因为众所周知化疗使免疫系统功效降低。

在经过对属于不同物种的大量细菌菌株进行了长期和深入的研发活动后，本申请人鉴定并选择了适合地满足上述要求的特定细菌菌株。

本发明的一种客体是：

-一种属于罗伊氏乳杆菌物种的被鉴定为罗伊氏乳杆菌lre03的细菌菌株，其保藏号为dsm23879，由probioticalspa根据布达佩斯条约于2010年8月5日保藏于dsmz(德国微生物菌种保藏中心)，和/或

-一种属于唾液乳杆菌物种的被鉴定为唾液乳杆菌ls06的细菌菌株，其保藏号为dsm26037，由probioticalspa根据布达佩斯条约于2012年6月6日保藏于dsmz(德国微生物菌种保藏中心)。

本申请人发现，罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株显示出已被证明的和令人惊讶的刺激促炎性细胞因子(th1)干扰素inf-γ的产生的能力(参见实验部分)。罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株对干扰素γ(ifn-γ)的内源性产生显示出令人惊讶的免疫刺激活性。由于其通过刺激促炎性细胞因子(th1)干扰素inf-γ来激活免疫系统，本申请人选择的罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株显示出令人惊讶的免疫调节活性。与输注施用这些细胞因子(如在外源性细胞因子的情况下)相反，内源性细胞因子刺激/产生不会引起毒性。

凭借对促炎性细胞因子(th1)干扰素inf-γ的产生的强烈刺激，罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株能够通过阻碍和减少肿瘤细胞增殖而发挥有效的抗肿瘤作用。

本申请人还发现，唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株显示出已被证明的和令人惊讶的刺激树突细胞的产生的能力(参见实验部分)。树突细胞帮助免疫系统保护生物体免受诸如病毒和细菌等危险微生物的外部攻击。

由于其对树突细胞的产生的强烈刺激，唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株能够通过阻碍和减少肿瘤细胞增殖而发挥有效的抗肿瘤作用。

本发明的一种客体是(i)细菌混合物，其包括以下菌株或者由以下菌株组成：罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株和/或唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株，其用作人类或动物的抗肿瘤剂。

在一个实施方式中，所述(i)混合物包括以下菌株或者由以下菌株组成：

-罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株，和/或

-唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株，

其用于人类或动物的阻碍和/或减少肿瘤细胞增殖的肿瘤治疗中、获得性免疫缺陷综合征治疗中和白血病治疗中。

在另一个实施方式中，所述(i)细菌混合物包括以下菌株或者由以下菌株组成：

-重量比为1:5～5:1、优选为1:3～3:1、更优选为1:2～2:1或1:1的罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株和唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株。

所述(i)细菌混合物的细菌细胞浓度为1×10⁸ufc/g混合物～1×10¹²ufc/g混合物，优选为1×10⁹ufc/g混合物～1×10¹¹ufc/g混合物。在本发明的背景下，为简洁起见，将所有上述混合物都称为“所述细菌混合物或本发明的细菌混合物”。

本发明的另一个客体是一种药物组合物或一种医疗器械用组合物，其指符合指令93/42/eec定义的物质，后文中为简洁起见，将其称为“所述组合物或本发明的组合物”，所述组合物包含以下或者由以下组成：

(i)如上所述的本发明的细菌混合物，和/或

(ii)包含树胶(优选为藻酸盐或其衍生物)和/或凝胶(优选为芦荟凝胶或其衍生物)或者由其组成的混合物，和/或

(iii)高度可同化(assimilable)的锌源，和/或

(iv)机体可接受的一种或多种食品级或药物级赋形剂和/或添加剂和/或助剂(co-formulant)，例如优选为低聚果糖(fos)、绿茶、三氯蔗糖和/或麦芽糊精。

在一个实施方式中，作为本发明的客体，本发明的组合物包含以下或者由以下组成：(i)本发明的细菌混合物，和(iv)机体可接受的一种或多种食品级或药物级赋形剂和/或添加剂和/或助剂，所述组合物用于人类和动物的抗肿瘤化疗治疗、获得性免疫缺陷综合征治疗和白血病治疗。

在另一个实施方式中，作为本发明的客体，本发明的组合物包含以下或者由以下组成：(i)本发明的细菌混合物，(ii)包含凝胶(优选为芦荟凝胶或其衍生物)或者由其组成的混合物，和(iv)机体可接受的一种或多种食品级或药物级赋形剂和/或添加剂和/或助剂，所述组合物用于人类和动物的抗肿瘤化疗治疗、获得性免疫缺陷综合征治疗和白血病治疗。所述(ii)混合物包含凝胶(优选为芦荟凝胶或其衍生物)或者由其组成。所述芦荟产品或其衍生物优选为木立芦荟(aloearborescens)；其优选为冻干形式。木立芦荟优选是冻干形式并发挥抗炎作用。

此外，本申请人发现，本发明的组合物通过“双重生物刺激”来激活免疫系统(is)。所述“双重生物刺激”由第一生物刺激和第二生物刺激组成。由于在本发明的组合物中存在具有非常高的生物利用度的锌而获得第一生物刺激。此生物可用形式的锌刺激胸腺产生更大量(数量)的淋巴细胞。由胸腺“过度产生的”这种t-淋巴细胞产生诸如干扰素-γ和树突细胞等无毒的内源性细胞因子。

第二生物刺激与第一生物刺激结合，受到罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株和/或唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株的促进，其进而刺激因锌对胸腺的在先刺激而产生的目前更大量的淋巴细胞，从而产生更多的细胞因子(具体为inf-γ和树突细胞)。除此以外，其还具有因芦荟或其衍生物(优选为木立芦荟；优选为冻干形式)的存在而确保的基础抗炎作用。

锌的这种非常高的生物利用度源于以下事实：锌的形式为内化进入属于乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)物种的细菌菌株的灭活(tyndallized)的细菌细胞中的锌，本申请人选择的该菌株优选为于2005年12月23日在dsmz保藏的乳双歧杆菌bb1dsm17850细菌菌株，其为欧洲专利申请no.08789404的客体，将其作为参考并入本文。

基本上，本发明人发现，内化进入灭活细胞(失活的细胞)的高生物利用度的锌能够激活免疫系统(is)，具体而言，激活负责产生t-淋巴细胞的胸腺，其产生诸如干扰素-γ和树突细胞等无毒的内源性细胞因子。

在另一个实施方式中，作为本发明的客体，本发明的组合物包含以下或者由以下组成：(i)本发明的细菌混合物，(ii)包含凝胶(优选为芦荟凝胶或其衍生物)或者由其组成的混合物，(iii)高度可同化的且具有高生物利用度的锌源，其为内化进入属于乳双歧杆菌物种的细菌菌株的灭活细菌细胞中的锌的形式，所述菌株优选为乳双歧杆菌bb1dsm17850细菌菌株，和(iv)机体可接受的一种或多种食品级或药物级添加剂和/或助剂和/或制剂技术成分，所述组合物用于人类和动物的抗肿瘤化疗治疗、获得性免疫缺陷综合征治疗和白血病治疗。所述(iv)高度可同化的且具有高生物利用度的锌源是作为有机锌存在，其形式为乳双歧杆菌bb1dsm17850菌株(由biomans.r.l.公司(意大利)于2005年12月23日保藏于dsmz(德国微生物菌种保藏中心))的细菌灭活产物。动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)bb1dsm17850菌株的灭活细菌产物的量为10mg/g组合物～50mg/g组合物，优选为20mg/g组合物。

本发明的全部上述组合物都有效地适于用作抗肿瘤化疗治疗、获得性免疫缺陷综合征治疗和白血病治疗的辅助疗法。

最后，本发明的组合物包含允许制造粉末、颗粒、片剂或胶囊的药物形式的食品级或药物级赋形剂和/或添加剂和/或助剂。其还可以包含例如低聚果糖fos和/或绿茶和/或三氯蔗糖和/或麦芽糊精。

本发明的组合物包含1×10⁸～1×10¹²个活细菌细胞ufc/g组合物，优选为1×10⁹～1×10¹¹个活细菌细胞ufc/g组合物。推荐本发明的组合物优选以每日1～2次施用4周～12周。

相对于组合物的重量，本发明的组合物包含1重量％～25重量％的量的所述芦荟(有利地为冻干的木立芦荟)；相对于组合物的重量，优选包含5重量％～15重量％。本发明的组合物可以包含例如1.5克/剂的冻干木立芦荟(alagel^tm)。

根据其整体作用机制，本发明的组合物能够在患有肿瘤疾病的个体中使化疗治疗的副作用更加耐受。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含本发明的(i)混合物(细菌细胞浓度为1×10⁸ufc/g混合物～1×10¹²ufc/g混合物，优选为1×10⁹ufc/g混合物～1×10¹¹ufc/g混合物)，所述(i)混合物包含以下或者由以下组成：

-罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株，或

-唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株，或

-重量比为1:5～5:1、优选为1:3～3:1、更优选为1:2～2:1或1:1的罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株和唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株，和/或低聚果糖fos和/或绿茶和/或三氯蔗糖和/或麦芽糊精。

事实上，罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879菌株能够显著刺激干扰素-γ(ifn-γ)的内源性生成。罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879菌株诱导免疫系统的原发细胞释放细胞因子(特别是干扰素-γ(inf-γ))的能力通过以下方法来定量：将其与从健康成年个体的外周血中分离出的pbmc(外周血单个核细胞)共温育。结果显示出浓度为480pg/ml的ifn-γ分泌的刺激，是对照的47倍。相对于未刺激条件(基线)，经过5天的刺激后，对培养上清液中ifn-γ的产生进行了评估。干扰素-γ(ifn-γ)可阻碍病毒和细菌感染(与其他干扰素类似)和非生理性细胞增殖(这通过细胞骨架和细胞膜变化、癌基因产物表达的调节和细胞分化过程的调控来介导(在正常和肿瘤细胞中延长有丝分裂的几乎所有阶段))。通过刺激机体免疫应答中的特化细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)和非特化细胞(诸如血小板、内皮细胞和上皮细胞、成纤维细胞和实质细胞)的活性，ifn-γ还显示出关键的和特征性的免疫调节作用。

本发明的组合物保证了适合的量(2毫克/剂)的被微生物乳双歧杆菌bb1内化的高度可同化的锌。具有高生物利用度的(内化的)锌是灭活(失活)细胞的形式。这种形式的锌具有非常高的生物利用度，因此更容易被生物体同化。对生物体而言具有生物利用度且容易同化的锌离子对负责刺激/产生淋巴细胞的胸腺具有重要的功能和直接的作用，这产生更多的细胞因子。

乳双歧杆菌bb1dsm17850细菌菌株由biomans.r.l.公司(意大利)于2005年12月23日保藏于dsmz。事实上，乳双歧杆菌bb1dsm17850细菌菌株能够在其在液体培养基中生长的过程中在细胞内积累锌。如在transwell系统中用caco-2细胞进行的体外研究显示，累集在细胞内的膳食锌的同化性是葡萄糖酸锌的17倍、是硫酸锌的31.5倍。微量元素锌的高可同化性允许甚至在非常低的剂量时也能够有效地弥补缺陷状况。此外，已知锌在免疫系统中发挥重要作用，特别是在产生t-淋巴细胞的器官胸腺中，当t-淋巴细胞分化为cd4+t-淋巴细胞(辅助t-淋巴细胞)时，会分泌一系列诸如il-12和ifn-γ等细胞因子。锌的这种作用机制与罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879菌株的作用机制一起协同作用。

鉴于其整体作用机制，作为本发明客体的组合物有效地适于用作具有肿瘤疾病且经历化疗的个体的辅助疗法、以及患有获得性免疫缺陷综合征(aids)和白血病的个体的抗逆转录病毒治疗中的辅助疗法。

实验部分

如下所述，本申请人测试了罗伊氏乳杆菌lre03(id1777)dsm23879细菌菌株的免疫调节性质。

具体而言，在不同次数的刺激之后进行了该研究，以分析参与先天免疫的细胞因子和负责获得性免疫的细胞因子。

a)细菌培养和生长条件

首先，在特定的生长条件下制备罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株的细菌培养物。在37℃的恒温浴中在manrogosasharpe(mrs)培养基中培养菌株。对于免疫调节实验，在大约16小时的生长期后，在上述条件下传代培养细菌6小时，以达到指数生长期。然后，用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.2)清洗细胞2次；使用bectondickinson公司销售的商品化试剂盒“带液珠的细胞活力试剂盒”、按照制造商的使用说明用细胞荧光测定技术确定细胞的生理状况和数量。由此使细胞达到在初步实验中建立的最佳浓度，并在后续测试中使用。

b)分离外周血单个核细胞

接下来，分离外周血单个核细胞。通过密度梯度离心来分离外周血单个核细胞(pbmc)。为此目的，在每个实验中使用20ml来自ospedalediborgomanero(意大利)的免疫输血服务中心的健康供体的“血沉棕黄层”，从而获得200×10⁶个pbmc/血沉棕黄层的平均产率。使用允许区分单个核细胞和多形核细胞的turk氏染料，在burker计数板中进行细胞计数，从而确定分离的细胞的量。在补充有10％热灭活的胎牛血清(fcs，gibco)、1％谷氨酰胺和25mmhepes的rpmi-1640生长培养基(invitrogen)中，使细胞达到2×10⁶个细胞/毫升的浓度。

c)pbmc刺激

接下来，用细菌菌株刺激外周血单个核细胞(pbmc)。分离后，用细菌菌株刺激pbmc1天和5天。每个实验的内部对照如下：

阴性对照：仅pbmc

1天对照：用1μg/ml脂多糖(lps；大肠杆菌，血清型055:b5，sigmachemicalsco.，st.louis，mo)刺激的pbmc。

5天对照：用1μg/ml植物血球凝集素(pha-p；sigmachemicalsco.，st.louis，mo)刺激的pbmc。

在分析中的不同时刻，以1500rpm离心培养物10分钟。取出上清液并在-20℃保存，直至进行分析。所述细胞用于后续测试。

d)细胞增殖分析

然后，进行细胞增殖分析。使用溴脱氧尿苷(brdu)核标记策略，利用细胞荧光测定技术来评估细胞增殖。此方法是作为更传统的使用氚标记胸苷的放射性示踪标记体系的替代方法而开发的。具体而言，向细胞培养物中添加5-溴-2’-脱氧尿苷(brdu)和2’-脱氧胞苷(dc)的混合物，两者的终浓度均为20μm，接下来在37℃、5％co2的潮湿气氛下温育16小时，通过细胞荧光测定技术分析细胞增殖。收集培养上清液并在-20℃保存，直至进行分析。在进行固定和细胞壁穿孔后，用fitc偶联的抗brdu单克隆抗体(mab)(bectondickinson)对细胞dna进行标记。使用来自bectondikinson公司的细胞荧光测定仪facscalibur和分析程序cellquest在其制备后24小时内对细胞进行分析。

结果以细胞增殖指数(p.i.)表示，其通过存在刺激时增殖细胞的百分比与无刺激时增殖细胞的百分比之间的比率来计算。p.i.值大于2被认为是可接受的(截止阈值)。在全部实验中，用有丝分裂原(pha)作为对照进行的刺激总是导致大于截止阈值，从而确认了pbmc是有活力的且具有增殖能力。

e)分析表征个体细胞亚群的分子

接下来，对表征个体细胞亚群的分子进行分析。对于免疫表型表征，将细胞与cd3、cd4、cd8、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56、hla-dr的单克隆抗体(mab)的不同组合在黑暗中一起温育30分钟，这些抗体还与异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)或多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)偶联。温育后，清洗样品，将样品用含有1％多聚甲醛的溶液固定并在4℃储存。在制备后24小时内，使用细胞荧光测定仪facscalibur分析样品，从分析中选择细胞以排除掉污染性细胞碎片。

f)细胞因子的剂量

接下来，确定细胞因子的剂量。通过elisa测定(酶联免疫吸附测定)来确定培养上清液中细胞因子的浓度。具体而言，对于细胞因子(il-4、il-10、ifn-γ和il-12p70)的剂量，使用购自ebioscence公司(sandiegoca)的“人elisaready-set-go”试剂盒。

g)统计学分析

使用配对学生t检验进行统计学分析，p值<0.05认为具有显著性。

结果

i)确定了罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株所诱导的增殖响应。细胞增殖的体外分析是研究免疫系统功能性的非常有用的生物学参数。为了分析所测试的细菌菌株是否可以影响对淋巴细胞增殖的诱导，用罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株刺激了外周血单个核细胞(pbmc)。使用能够诱发t-淋巴细胞多克隆增殖的促有丝分裂刺激物——植物血球凝集素(pha)作为阳性对照。从来自ospedales.s.trinità，borgomanero(novara)输血中服务中心的平均年龄为40岁(在21岁～52岁之间)的4名健康男性供体的外周静脉血样品中分离出pbmc。

如图1所示，其中报告了细胞增殖指数(p.i.，参见上述方法)，在全部刺激条件下的pbmc增殖响应的结果都显著高于未刺激的情况(基线)。

在图1中，显示了4次独立实验的平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。使用学生t检验计算了统计学显著性，与基线(未刺激的pbmc)相比，p值<0.05认为具有统计学显著性。

ii)评估了罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株对不同细胞亚群的影响。为了检测出哪些细胞亚群在用测试益生菌株刺激后会被诱导发生增殖，进行了多参数流式细胞分析。随后的图(图2和图3)显示了参与自然免疫应答和获得性免疫应答的主要细胞亚群的百分比。

iia)自然免疫。1天后，用罗伊氏乳杆菌lre03(dsm23879)细菌菌株进行的刺激引起了总树突细胞(谱系-/hla-dr+)百分比的变化。

在图2中，显示了4次独立实验的增殖响应平均值±s.e.m.。使用学生t检验计算了统计学显著性，与基线(未刺激的pbmc)相比，p值<0.05认为具有统计学显著性。

iib)获得性免疫。5天后，用罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株进行的刺激引起了辅助t-淋巴细胞(cd3+/cd4)百分比的显著增加。

在图3中，显示了12次独立实验的平均值±s.e.m.。使用学生t检验计算了统计学显著性，与基线条件(未刺激的pbmc)相比，p值<0.05认为具有统计学显著性。

iii)细胞因子分泌。参与免疫应答的细胞亚群所分泌的不同细胞因子谱在选择用于应答特定抗原刺激物的效应器系统时起着重要作用。t-淋巴细胞代表了细胞介导的免疫的主要效应器和调节细胞。在对抗原或病原体进行应答时，t-细胞合成并分泌多种生长和分化所需的细胞因子以及作为其他免疫活性细胞的激活因子的细胞因子。为了研究所测试的细菌菌株是否会诱导pbmc的不同细胞因子分泌，将所述细胞激活1天和5天。通过elisa测定来测量在培养上清液中释放的细胞因子(il-12p70、ifn-γ和il-4)的量。

iv)具有突出的促炎作用的细胞因子。评估了作为具有突出的促炎作用的细胞因子的主要代表性细胞因子il-12p70和ifn-γ的诱导作用。如图4所示，相对于基线条件，罗伊氏乳杆菌lre03(dsm23879)细菌菌株能够诱导这两种受测试的细胞因子的显著增加。

v)具有突出的免疫调节作用的细胞因子。评估了作为具有突出的免疫调节作用的细胞因子的主要代表性细胞因子il-4的诱导作用。如图4所示，相对于基线条件，所测试的罗伊氏乳杆菌lre03(dsm23879)细菌菌株显示出能够诱导细胞因子il-4分泌的减少。

在图4中，显示了4次独立实验的平均值±s.e.m.。使用学生t检验计算了统计学显著性。与基线(未刺激的pbmc)相比，p值<0.05认为具有统计学显著性。在1天的刺激后，评估培养上清液中细胞因子il-12p70的产生。在5天的刺激后，评估培养上清液中ifn-γ和il-4的产生。

用罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株进行刺激后，相对于由pbmc分泌的细胞因子的剂量的数据凸显了该菌株自身的显著增加促炎性细胞因子的能力。具体而言，相对于未刺激条件(基线，图5)，罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株将细胞因子il-12p70和细胞因子ifn-γ的分泌分别增加到了6倍和47倍。

考虑到罗伊氏乳杆菌lre03dsm23879细菌菌株刺激细胞因子ifn-γ分泌的显著能力，将本研究的结果与从用其他细菌菌株(全部属于probioticals.p.a.收集库)进行的实验得到的结果进行了比较，具体而言，比较了相对于基线的增加，即，相对于未刺激条件(基线)，ifn-γ量的倍数变化。

如表1所示，相对于相同物种的菌株和不同物种的菌株(全部属于乳杆菌属)，罗伊氏乳杆菌lre03(dsm23879)细菌菌株是最佳的ifn-γ诱导剂。

在表1中，显示了用不同的乳杆菌和双歧杆菌进行的刺激所诱发的细胞因子ifn-γ相对于基线的增加。

实验部分

如下文所述，本申请人测试了唾液乳杆菌ls06dsm26037细菌菌株的免疫调节性质。

具体而言，评估了唾液乳杆菌ls06dsm26037益生菌株(之前已从微生物和分子角度对其进行了表征)对总循环树突细胞的免疫调节性质。特别是，在24小时的刺激后，选择来自健康成年供体的外周血单个核细胞中的dc来进行多参数流式细胞分析。

a)细菌培养和生长条件

在37℃的恒温浴中在manrogosasharpe(mrs)培养基中培养菌株。对于免疫调节实验，在约16小时的生长期后，在上述条件下传代培养细菌6小时，以达到指数生长期。然后，用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.2)清洗细胞2次；使用bectondickinson公司销售的商品化试剂盒“带液珠的细胞活力试剂盒”、按照制造商的使用说明用细胞荧光测定技术确定细胞的生理状况和数量。而后使细胞达到在初步实验中建立的最佳浓度，并在后续测试中使用。

b)分离外周血单个核细胞

通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(pbmc)。为此目的，在每个实验中使用20ml来自ospedalediborgomanero的免疫输血服务中心的健康供体的“血沉棕黄层”，从而获得200×10⁶个pbmc/血沉棕黄层的平均产率。使用允许区分单核细胞和多形核细胞的turk氏染料，在burker计数板中进行细胞计数以确定分离的细胞的量。在补充有10％热灭活的胎牛血清(fcs，gibco)、1％谷氨酰胺和25mmhepes的rpmi-1640生长培养基(invitrogen)中，使细胞达到2×10⁶个细胞/毫升的浓度。

c)pbmc刺激

分离后，用细菌菌株刺激pbmc24小时。每个实验的内部对照如下：阴性对照：仅pbmc；1天对照：用1μg/ml的脂多糖(lps；大肠杆菌，血清型055:b5，sigmachemicalsco.，st.louis，mo)刺激的pbmc。

在刺激后，将培养物以1500rpm离心10分钟。然后弃掉上清液，并且使用细胞进行后续测试。

d)总树突细胞分析

对于免疫表型表征，将细胞与cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56和hla-dr的单克隆抗体(mab)的不同组合在黑暗中一起温育30分钟，这些抗体还与异硫氰酸荧光素(fitc)或多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)偶联。温育后，清洗样品，将样品用含有1％多聚甲醛的溶液固定并在4℃储存。在制备后24小时内，使用细胞荧光测定仪facscalibur分析样品，从分析中选择细胞已排除掉污染性细胞碎片。

e)统计学分析

使用配对学生t检验进行统计学分析。p值<0.05认为具有显著性。

结果：细菌菌株对树突细胞的影响

为了确定所测试的益生菌株对树突细胞调节的影响，进行多参数流式细胞分析。

如图6a所示，24小时后，菌株ls06的刺激诱导了总树突细胞(谱系-/hla-dr+)百分比的显著增加。

具体而言，相对于未刺激条件(基线，图6b)，唾液乳杆菌ls06(dsm26037)细菌菌株将总树突细胞的比例增加到了7倍。

在图6b中，显示了12次独立实验的平均值±s.e.m.。使用学生t检验计算了统计学显著性。与基线(未刺激的pbmc)相比，p值<0.05认为具有统计学显著性。

在表2中，显示了用不同的乳杆菌和双歧杆菌进行刺激所诱发的树突细胞相对于基线的增加。

结论

数据证明，相对于标准基线条件，唾液乳杆菌ls06细菌菌株诱导了总dc比例的显著增加。具体地，细菌ls06将总dc的比例增加到了7倍。

能够调节树突细胞的细菌(例如在本研究中表征的唾液乳杆菌ls06菌株)对肠道的定殖是以免疫失衡为特征的疾病中非常重要的因素。

表1

表2