BTNL9和ERMAP作为用于免疫疗法的新的免疫系统抑制剂的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年11月25日提交的美国临时专利申请号62/084,124的权益，其内容通过引用并入本文。

政府支持的声明

本文发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号dk083076和dk007218提供的政府支持下完成。因此，美国政府在本发明中具有一定的权利。

发明背景

本文引用的所有出版物、专利、专利申请出版物和书籍的公开内容通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述本发明所属的技术。

癌症、自身免疫疾病、传染病和移植排斥是美国和其他国家的严重公共卫生问题。免疫系统，特别是t细胞，在这些疾病中起关键作用。

b7配体家族和cd28受体家族控制t细胞的活化和功能。ctla-4和pd-1二者都是cd28家族的成员，并且针对ctla-4的抗体(来自bristol-myerssquibb的yervoy)和针对pd-1的抗体(keytruda，merck)分别在2011年和2014年被fda批准为黑色素瘤的新药。pd-l1是b7家族的成员，pd-l1的抗体正在与癌症患者进行临床试验。另外，ctla-4-ig(orencia)被fda批准为成人类风湿性关节炎的新药。

现有技术通过阻断b7/cd28家族成员而起作用。嗜乳脂蛋白家族与b7家族有关，但它们在免疫系统中的表达和功能在很大程度上是未知的。

本发明解决对改进疗法的需要并提供了基于靶向btnl9或ermap的治疗。

发明概述

治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制btnl9并治疗肿瘤的量的结合btnl9的抗体或其结合btnl9的片段。

治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制ermap并治疗肿瘤的量的结合ermap的抗体或其结合ermap的片段。

治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制btnl2并治疗肿瘤的量的结合btnl2的抗体或其结合btnl2的片段。

治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性btnl9。

治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性ermap。

治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性btnl2。

分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl9。

分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的ermap。

分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl2。

分离的嵌合核酸，其编码编码如本文所述的分离的重组融合多肽。

组合物，其包含如本文所述的分离的重组融合多肽和载体。

附图简要说明

图1a-1b。小鼠组织和抗原呈递细胞中btn和btnl家族成员相对于参考基因oaz1的mrna转录物。(a)未接触过实验小鼠组织中的转录物。btn家族成员的转录物(上图)表明btn转录物在乳腺组织中最丰富。具有细胞内spry结构域(中图)和没有细胞内spry结构域(底部图)的btnl家族成员的转录物在小肠和大肠中最高。转录物在其他组织、特别是初级淋巴器官中通常也是可检测的；mog转录物在脑组织中最高。sp，脾；ln，汇集腹股沟和肱淋巴结；th，胸腺；bm，骨髓；mln，肠系膜淋巴结；br，脑；lu，肺；he，心脏；li，肝；st，胃；sm，小肠；lg，大肠；pa，胰腺；ki，肾；bl，膀胱；sv，精囊；pr，前列腺；ep，附睾；te，睾丸；ft，输卵管；va，阴道；ut，子宫；ov，卵巢；ma，乳腺。(b)静息和活化的抗原呈递细胞(apc)中的转录物。大多数基因的转录物可在所有三种专门的apc中检测到，在大多数情况下，巨噬细胞与树突状细胞和b细胞相比较低，并且在lps或pma+离子霉素激活时通常不强烈上调或下调。

图2a-2c。大多数重组btn和btnl家族成员抑制抗cd3激活的原代小鼠t细胞的功能。通过磁性细胞分离从小鼠脾脏和淋巴结中分离t细胞，并在4μg/ml平板结合的btn-和btnl-人ig重组融合蛋白存在下用2.5μg/ml平板结合的抗cd3活化。(a)所有btn和btnl融合蛋白(ermap和mog除外)在激活后3天降低cd4+t细胞的代谢活性。人ig(hig)、b7x-hig和b7.2-hig融合蛋白分别作为用于激活的基线、阴性和阳性对照。(b)btn和btnl融合蛋白减少活化的cd4+和cd8+t细胞的增殖。cd90.2+t细胞在激活前用cfse脉冲4天后，用针对cd4和cd8的荧光标记抗体进行染色。在btn、btn2、btnl1、btnl2(全长和部分长度)、btnl4、btnl6、btnl9和ermap存在下，cd4+t细胞(上图)显示出减少的增殖，而在btn、btn2、btnl1、btnl2(全长和部分长度)、btnl4、btnl6和btnl9的存在下，cd8+t细胞(图)显示出减少的增殖。cd4+和cd8+t细胞的分裂指数，即平均分裂数(实心条)和分裂百分数(空心条)显示在直方图的右侧。(c)与基线(hig)相比，在btn和btnl融合蛋白存在下，激活后2天cd4+t细胞分泌细胞因子ifn-γ、il-2、tnf-α和il-17a降低。

图3a-3b。激活3天的cd4+(a)和cd8+(b)t细胞表达btn和btnl蛋白的受体。通过平板结合的2.5μg/ml抗cd3激活总淋巴结细胞，并与生物素化的btn-、btnl-hig或hig-融合蛋白一起培养，用针对cd4和cd8的荧光标记抗体染色，并评估融合蛋白与荧光标记的链霉抗生物素蛋白结合。两个激活的t细胞亚群表达所有btn和btnl家族成员(mog除外)的受体，其与功能数据一致。

图4。人btnl2的igv1结构域结合人cd8t细胞、人b细胞和人nk细胞。在facs测定中显示了btnl2-igv1-ig蛋白(空心直方图)和对照ig(阴影直方图)。

图5。人btnl9的igv1结构域结合人cd8t细胞、人b细胞和人nk细胞。在facs测定中显示了btnl9-igv1-ig蛋白(空心直方图)和对照ig(阴影直方图)。

发明详述

本发明提供了第一个公开内容，即嗜乳脂蛋白样9(btnl9)和成红细胞膜相关蛋白(ermap)(嗜乳脂蛋白家族的两个成员)抑制t细胞功能。短形式的btnl2也强烈抑制。特别地，提供了btnl9和ermap的重组蛋白抑制t细胞的细胞增殖和细胞因子产生以及活化的t细胞具有btnl9和ermap受体的证据。由于btnl9和ermap由免疫细胞或其他细胞表达，包括靶向这两种分子以增强免疫(例如癌症免疫疗法)或降低免疫力(例如自身免疫疾病的治疗)的应用。此外，包括使用btnl2、特别是短或“部分”形式的应用。

btnl9是免疫系统的抑制剂。因此，用阻断剂(例如btnl9的单克隆抗体)阻断btnl9介导的免疫抑制可用于治疗人类癌症和传染病，而用可溶性蛋白质(例如btnl9-ig)增强btnl9介导的免疫抑制作用可用于治疗自身免疫疾病和移植。

ermap是免疫系统的抑制剂。因此，用阻断剂(例如ermap的单克隆抗体)阻断ermap介导的免疫抑制可用于治疗人类癌症和传染病，并且用可溶性蛋白质(例如ermap-ig)增强ermap介导的免疫抑制作用可用于治疗自身免疫疾病和移植。

提供了治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制btnl9并治疗肿瘤的量的结合btnl9的抗体或其结合btnl9的片段。

还提供了治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制ermap并治疗肿瘤的量的结合ermap的抗体或其结合ermap的片段。

还提供了治疗受试者肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以抑制btnl2并治疗肿瘤的量的结合btnl2的抗体或其结合btnl2的片段。

在实施方案中，btnl9是人btnl9。在实施方案中，ermap是人ermap。在实施方案中，btnl2是人btnl2。

在该方法的实施方案中，肿瘤是乳腺肿瘤、肺肿瘤、甲状腺肿瘤、黑素瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、膀胱肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、肾肿瘤、食道肿瘤，或是血液肿瘤，或其中肿瘤是淋巴器官肿瘤。

在该方法的实施方案中，抗体作为肿瘤的另外的抗癌疗法的辅助物施用。

在该方法的实施方案中，施用一定量的结合btnl9的抗体。在该方法的实施方案中，结合btnl9的抗体结合人btnl9的igv1结构域。

在该方法的实施方案中，施用一定量的结合ermap的抗体。

在该方法的实施方案中，施用一定量的结合btnl2的抗体。在该方法的实施方案中，结合btnl2的抗体结合人btnl2的igv1结构域。

在该方法的实施方案中，施用抗体的片段。

在该方法的实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在本发明的实施方案中，btnl9是人btnl9。在实施方案中，人btnl9蛋白具有以下序列：

mvdlsvspdslkpvsltsslvflmhllllqpgepssevkvlgpeypilalvgeevefpchlwpqldaqqmeirwfrsqtfnvvhlyqeqqelpgrqmpafrnrtklvkddiaygsvvlqlhsiipsdkgtygcrfhsdnfsgealwelevaglgsdphlslegfkeggiqlrlrssgwypkpkvqwrdhqgqclppefeaivwdaqdlfsletsvvvragalsnvsvsiqnlllsqkkelvvqiadvfvpgasawksafvatlplllvlaalalgvlrkqrrsreklrkqaekrqekltaeleklqteldwrraegqaewraaqkyavdvtldpasahpslevsedgksvssrgappgpapghpqrfseqtcalslerfsagrhywevhvgrrsrwflgaclaavpragparlspaagywvlglwngceyfvlaphrvaltlrvpprrlgvfldyeagelsffnvsdgshiftfhdtfsgalcayfrprahdggehpdplticplpvrgtgvpeendsdtwlqpyepadpaldww(seqidno:1)。

在本发明的实施方案中，ermap是人ermap。在实施方案中，人ermap蛋白具有以下序列：

memassagswlsgcliplvflrlsvhvsghagdagkfhvallggtaellcplslwpgtvpkevrwlrspfpqrsqavhifrdgkdqdedlmpeykgrtvlvrdaqegsvtlqildvrledqgsyrcliqvgnlskedtvilqvaapsvgslspsavalavilpvlvllimvclcliwkqrrakekllyehvtevdnllsdhakekgklhkavkklrselklkraaansgwrrarlhfvavtldpdtahpklilsedqrcvrlgdrrqpvpdnpqrfdfvvsilgseyfttgchywevyvgdktkwilgvcsesvsrkgkvtaspanghwllrqsrgneyealtspqtsfrlkepprcvgifldyeagvisfynvtnkshiftfthnfsgplrpffepclhdggkntaplvicselhkseesivprpegkghangdvslkvnssllppkapelkdiilslppdlgpalqelkapsf(seqidno:2)。

在本发明的实施方案中，btnl2是人btnl2。在实施方案中，人ermap蛋白具有以下序列：

mvdcpryslsgvaasflfvlltikhpddfrvvgpnlpilakvgedalltcqllpkrttahmevrwyrsdpampvimyrdgavvtglpmegyggraewmedsteegsvalkirqvqpsddgqywcrfqegdywretsvllqvaalgsspnihveglgegevqlvctsrgwfpepevhwegiwgeklmsfsenhvpgedglfyvedtlmvrndsvetiscfiyshglretqeatialserlqtelvsvsvighsqpspvqvgenieltchlspqtdaqnlevrwlrsryypavhvyangthvageqmveykgrtslvtdaihegkltlqihnartsdegqyrclfgkdgvyqearvdvqvtavgstpritrevlkdggmqlrctsdgwfprphvqwrdrdgktmpsfseafqqgsqelfqvetlllvtngsmvnvtcsislplgqektarfplsdski(seqidno:3)。

在本发明的实施方案中，短形式的btnl2是短形式的人btnl2。在实施方案中，短形式的人btnl2具有以下序列：

mvdcpryslsgvaasflfvlltikhpddfrvvgpnlpilakvgedalltcqllpkrttahmevrwyrsdpampvimyrdgavvtglpmegyggraewmedsteegsvalkirqvqpsddgqywcrfqegdywretsvllqvaalgsspnihveglgegevqlvctsrgwfpepevhwegiwgeklmsfsenhvpgedglfyvedtlmvrndsvetiscfiyshglretqeatialserlqtelvsvsvighsqpspvqvg(seqidno:4)。

人btnl2的igv1结构域的蛋白质序列：

kqsedfrvigpahpilagvgedalltcqllpkrttmhvevrwyrsepstpvfvhrdgvevtemqmeeyrgwvewiengiakgnvalkihniqpsdngqywchfqdgnycgetslllkvaglgsapsihm.(seqidno:5)

人btnl9的igv1结构域的蛋白质序列：

evkvlgpeypilalvgeevefpchlwpqldaqqmeirwfrsqtfnvvhlyqeqqelpgrqmpafrnrtklvkddiaygsvvlqlhsiipsdkgtygcrfhsdnfsgealwelevaglgsdphls.(seqidno:6)

在该方法的实施方案中，肿瘤是乳腺肿瘤、肺肿瘤、甲状腺肿瘤、黑素瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、膀胱肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、肾肿瘤、食道肿瘤或是血液肿瘤。在该方法的实施方案中，肿瘤是血液肿瘤，并且是白血病或淋巴瘤。在该方法的实施方案中，肿瘤是乳腺肿瘤，并且是三阴性乳腺癌。在该方法的实施方案中，肿瘤是淋巴器官肿瘤。

还提供了分离的融合蛋白，其包含btnl9的可溶性部分和免疫球蛋白g的fc部分。

还提供了分离的融合蛋白，其包含ermap的可溶性部分和免疫球蛋白g的fc部分。

提供分离的嵌合核酸，其编码如本文所述的分离的融合蛋白。

提供组合物，其包含如本文所述的分离的融合蛋白和载体。

在实施方案中，组合物是药物组合物，载体是药物载体。

还提供了治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性btnl9。。

还提供了治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性ermap。

还提供了治疗受试者自身免疫疾病的方法，其包括向受试者施用治疗自身免疫疾病的量的分离的血浆可溶性btnl2。

在实施方案中，btnl-2包含seqidno：4但不包含seqidno：3。

在实施方案中，血浆可溶性btnl9或血浆可溶性ermap分别包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl9或与免疫球蛋白多肽融合的ermap。

在实施方案中，血浆可溶性btnl2包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl2。

在实施方案中，免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白g的fc部分

还提供了分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl9。还提供了分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的人btnl9的igv1结构域。在实施方案中，人btnl9的igv1结构域包含seqidno：6。

还提供了分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的ermap。

还提供了分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的btnl2。在实施方案中，btnl-2包含seqidno：4但不包含seqidno：3。还提供了分离的重组融合多肽，其包含与免疫球蛋白多肽融合的人btnl2的igv1结构域。在实施方案中，人btnl2的igv1结构域包含seqidno：5。

还提供了分离的嵌合核酸，其编码如本文所述的分离的重组融合多肽。

还提供了组合物，其包含如本文所述的分离的重组融合多肽和载体。在实施方案中，组合物是药物组合物，并且包含药物载体。

本文所用的术语“ermap-ig”融合蛋白是指由免疫球蛋白的一部分和ermap的活性部分构建的融合蛋白或与其具有相同序列的蛋白质。在优选的实施方案中，ermap的活性部分是ermap的可溶部分。在实施方案中，ermap具有人ermap的序列。在实施方案中，免疫球蛋白的部分是igg或igm的一部分。在实施方案中，其作为igg的一部分。融合蛋白的igg部分可以是例如igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3或igg4或其一部分中的任一种。在实施方案中，该部分是fc区。在实施方案中，融合蛋白包含与人igg1、人igg2、人igg2a、人igg2b、人igg3或人igg4的fc部分相同的序列。在实施方案中，融合蛋白包含与人igg1的fc部分相同的序列。本文中使用的术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区，包括天然序列fc区和变体fc区。虽然免疫球蛋白重链的fc区的边界可能变化，但人igg重链fc区通常定义为从cys226位置或从pro230的氨基酸残基延伸到其羧基末端。fc区的c末端赖氨酸可以被除去，例如通过重组工程化编码融合蛋白的核酸。

本文所用的术语“btnl9-ig”融合蛋白是指由免疫球蛋白的一部分和btnl9的活性部分构建的融合蛋白或与其具有相同序列的蛋白质。在实施方案中，btnl9的活性部分是btnl9的可溶部分。在实施方案中，btnl9具有人btnl9的序列。

本文所用的术语“btnl2-ig”融合蛋白是指由免疫球蛋白的一部分和btnl2的活性部分构成的融合蛋白或与其具有相同序列的蛋白质。在实施方案中，btnl2的活性部分是btnl2的可溶部分。在实施方案中，btnl2具有人btnl2的序列。在实施方案中，btnl-2包含seqidno：4但不包含seqidno：3。

在实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白的部分是igg或igm的一部分。在实施方案中，其作为igg的一部分。融合蛋白的igg部分可以是例如igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3或igg4或其一部分中的任一种。在实施方案中，该部分是fc区。在实施方案中，融合蛋白包含与人igg1、人igg2、人igg2a、人igg2b、人igg3或人igg4的fc部分相同的序列。在实施方案中，融合蛋白包含与人igg1的fc部分相同的序列。本文中使用的术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区，包括天然序列fc区和变体fc区。虽然免疫球蛋白重链的fc区的边界可能变化，但人igg重链fc区通常定义为从cys226位置或从pro230的氨基酸残基延伸到其羧基末端。fc区的c末端赖氨酸可以被除去，例如通过重组工程化编码融合蛋白的核酸。

在实施方案中，ig的fc部分用于如本文所述的融合蛋白中。fc结构域的存在显著增加了所连接蛋白质的血浆半衰期，其延长了治疗活性。此外，fc结构域还使融合蛋白与fc受体相互作用。在实施方案中，ermap-ig包含连接到fc结构域的ermap部分。在实施方案中，ermap部分通过肽键直接结合到fc结构域。在实施方案中，ermap部分通过接头连接到fc结构域。在实施方案中，btnl9-ig包含与fc结构域连接的btnl9部分。在实施方案中，btnl9部分通过肽键直接结合到fc结构域。在实施方案中，btnl9部分通过接头与fc结构域连接。

在实施方案中，融合蛋白(或融合多肽)通过允许柔性的肽接头连接。在实施方案中，接头是刚性的。在实施方案中，接头是可切割的。本发明范围内的柔性接头的非限制性实例是gn和ggggs和(ggggs)n，其中n＝2、3、4或5(seqidno：7)。本发明范围内的刚性接头的非限制性实例是(eaaak)n(seqidno：8)、(xp)n。在本发明范围内的可切割接头的非限制性实例包括二硫键连接和蛋白酶可切割接头。在优选的实施方案中，接头是肽接头。

在实施方案中，fc结构域与人igg1fc结构域具有相同的序列或95％或更高的序列相似性。在实施方案中，fc结构域与人igg2fc结构域具有相同的序列或95％或更高的序列相似性。在实施方案中，fc结构域与人igg3fc结构域具有相同的序列或95％或更高的序列相似性。在实施方案中，fc结构域与人igg4fc结构域具有相同的序列或95％或更高的序列相似性。在实施方案中，fc结构域不被突变。在实施方案中，fc结构域在ch2-ch3结构域界面处突变以增加igg在酸性但不是中性ph下对fcrn的亲和力(dall'acqua等人，2006；yeung等人，2009)。

在实施方案中，重组产生本文所述的融合蛋白。在实施方案中，融合蛋白在真核表达系统中产生。在实施方案中，在真核表达系统中产生的融合蛋白包括对应于asn297的fc部分上的残基处的糖基化。

在实施方案中，融合蛋白是同二聚体。在实施方案中，融合蛋白是单体的。在实施方案中，融合蛋白是多体的。

在实施方案中，通过将具有与btnl9的人细胞外结构域相同的序列的btnl9的细胞外结构域的编码区融合到具有与人igg1fc相同的序列的多肽，来制备btnl9-ig。这可以本领域已知的任何方式进行，包括通过用编码所述融合蛋白的重组核酸转染合适的细胞类型。与本文提及的其它融合蛋白一样，btnl2-ig融合蛋白可以类似的方式制备。

在实施方案中，通过将具有与ermap的人细胞外结构域相同的序列的ermap的细胞外结构域的编码区融合到具有与人igg1fc相同的序列的多肽，来制备ermap-ig。这可以本领域已知的任何方式进行，包括通过用编码所述融合蛋白的重组核酸转染合适的细胞类型。

在实施方案中，在本文描述的引用受试者的本发明的所有方面中，受试者是人

可由本发明治疗的癌症(包括肿瘤)包括鼻咽癌、咽癌、肺癌、骨癌、脑癌、涎腺癌、胃癌、食管癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、肝癌、小肠癌、阑尾(appendix)、结肠癌、直肠癌、胆囊癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、或是胶质瘤。在实施方案中，所治疗的癌症是转移性黑色素瘤。

本发明还提供包含如本文所述的融合蛋白的组合物。在实施方案中，组合物是药物组合物。在实施方案中，包含一种或多种本文所述的融合蛋白的组合物或药物组合物对于融合蛋白基本上是纯的。在组合物或药物组合物的样品的至少约60至75％表现出单一种类融合蛋白的情况下，包含一种或多种本文所述的融合蛋白质的组合物或药物组合物对于抗体或片段是“基本上纯的”。包含一种或多种本文所述的融合蛋白质的基本上纯的组合物或药物组合物在其为融合蛋白的部分中可以包含60％、70％、80％或90％更通常约95％、并且优选超过99％的单一种类的融合蛋白。融合蛋白纯度或均一性可以通过本领域众所周知的多种方法进行测试，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或hplc。

本发明还包括包含所述融合蛋白和载体的组合物。载体可以包含一种或多种药学上可接受的载体组分。这种药学上可接受的载体组分在本领域中是广为人知的。

在实施方案中，通过本文方法治疗癌症的受试者也用化疗药物例如细胞毒性剂治疗。在实施方案中，细胞毒性剂是多柔比星。在实施方案中，细胞毒性剂是美登木素生物碱。在实施方案中，细胞毒剂是烷化剂、抗代谢物、植物生物碱或萜类化合物或细胞毒性抗生素。在实施方案中，细胞毒性剂是环磷酰胺、博来霉素、依托泊苷、铂剂(顺铂)、氟尿嘧啶、长春花新碱、氨甲蝶呤、紫杉醇、表柔比星、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)或伊立替康。

除非另有说明，否则本文所用的施用可以是耳、口腔、结膜、皮肤、皮下、子宫颈内、鼻窦内、气管内、肠内、硬膜外、通过血液透析、间质、腹内、羊膜内、动脉内、关节内、胆管内、支气管内、黏液囊内、心内、胸膜内、马尾内、海绵体内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠状动脉内、皮内、椎间盘内、导管内、表皮内、食道内、胃内、阴道内、齿龈内、回肠内、腔内、病灶内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心外膜内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、心室内、膀胱内、玻璃体内、喉、鼻、鼻饲、眼、口服、口咽、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、直肠、吸入性、眼球后、蛛网膜下、结膜下、舌下、粘膜下、局部(topically)、经皮、经粘膜、经胎盘、经气管、输尿管、尿道和阴道。

在实施方案中，本发明的融合蛋白在本文所述的方法中全身施用。在实施方案中，本发明的融合蛋白在本文所述的方法中局部施用。在实施方案中，本发明的融合蛋白在本文所述的方法中直接施用于肿瘤，例如通过注射或插管。

在实施方案中，本发明的抗体或抗体片段在本文所述的方法中全身施用。在实施方案中，本发明的抗体或抗体片段在本文所述的方法中局部施用。在实施方案中，本发明的抗体或抗体片段在本文所述的方法中直接施用于肿瘤，例如通过注射或插管。

在实施方案中，如本文所使用的“确定”是指实验测定。

本文的各种元件的所有组合都在本发明的范围内，除非本文另有说明或以其他方式明确地与上下文相矛盾。

从下面的实验细节将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易地理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是在随后的权利要求中更全面地描述的本发明的说明。

实验详述

关于b7/cd28家族成员的基于t细胞的免疫疗法的现有技术通过阻断b7/cd28家族成员而起作用。相比之下，btnl9和ermap(嗜乳脂蛋白家族的两个成员)的表达模式和功能不同于ctla-4和pd-1及其配体，因此，btnl9途径和ermap途径在不同的时间和位置调节免疫系统。

实施例1

组织和抗原呈递细胞中btnl9、ermap和嗜乳脂蛋白家族的其他成员的mrna表达：嗜乳脂蛋白家族与b7家族有关，但它们在免疫系统中的表达和功能在很大程度上是未知的。使用实时rt-pcr，确定btnl9和ermap以及其他家族成员一起在许多组织和抗原呈递细胞中广泛表达(图1)。

实施例2

btnl9、ermap和嗜乳脂蛋白家族的一些其他成员抑制t细胞功能：使用以前的研究修改的系统(pnas，110：9879-9884，2013)，检测了btnl9、ermap和嗜乳脂蛋白家族的其他成员是否能够调节t细胞功能。在该系统中，用针对cd3的平板结合的mab活化纯化的t细胞，在第3天测定t细胞的活化，在第2天测定t细胞来源的细胞因子。确定btnl9抑制cd4和cd8两种t细胞增殖和细胞因子产生，而ermap抑制cd4而不是cd8t细胞增殖(图2)。

实施例3

活化的t细胞具有btnl9、ermap和嗜乳脂蛋白家族的一些其他成员的受体：因为btnl9和ermap抑制了t细胞功能，所以检查了活化的t细胞是否表达这些分子的受体。确定了btnl9-ig、btnl9、ermap-ig和嗜乳脂蛋白家族的一些成员的其他ig融合蛋白与活化三天的活化cd4和cd8t细胞结合(图3)。

实施例4

人btnl2的igv1结构域是功能结构域。如图4所示，人btnl2的igv1结构域结合人cd8t细胞、人b细胞和人nk细胞。在facs测定中显示了btnl2-igv1-ig蛋白(空心直方图)和对照ig(阴影直方图)。所示的序列是seqidno：5。

实施例5

人btnl9的igv1结构域是功能结构域。如图5所示，人btnl9的igv1结构域结合人cd8t细胞、人b细胞和人nk细胞。在facs测定中显示了btnl9-igv1-ig蛋白(空心直方图)和对照ig(阴影直方图)。所示序列是seqidno：6。