具有改善和防治肥胖症作用的腺萼落新妇提取物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种具有改善和防治肥胖症作用的天然药物提取物，尤其涉及一种具有改善和防治肥胖症作用的腺萼落新妇提取物及其应用。

背景技术：

肥胖是一种慢性代谢性疾病，是由特定生化因子引起一系列进食调控和能量代谢紊乱，从而使体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，能量摄人多于消耗而以脂肪形式储存于体内，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。肥胖病的危害不仅对肥胖患者带来生活不便和身心障碍，更严重的是肥胖导致许多疾病，如糖尿病、高血压、冠心病和高血脂症等。目前在全球范围内正式获准临床应用的抗肥胖药物有两个去甲肾上腺素能药物盐酸芬特明和盐酸安非拉酮及一个脂酶抑制剂奥利司他这三个药物。不过，盐酸芬特明的常见副反应包括应激性、神经过敏、不宁静、口干、失眠、便秘和头痛；盐酸安非拉酮的最常见副反应有口干和失眠；奥利司他的副反应会影响到15～30％的患者且被某些患者认为是令人厌恶和不能接受的，具体症状包括皮脂溢、肠胃胀气、便急、便失禁和油样便等，疗效有限及有一定的不良反应，因此需要有一个更有效和更安全的治疗肥胖的药物。

技术实现要素：

鉴于上述的现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有改善和防治肥胖症作用的天然药物来源的制剂-腺萼落新妇提取物。该提取物具有良好的改善和防治肥胖症的功效，无不良反应，是一种安全和有效的治疗肥胖的药物。

本发明的技术方案如下：

一种具有改善和防治肥胖症作用的腺萼落新妇提取物，按如下方法制备得到：

(1)腺萼落新妇干燥叶子，用浓度为60～80％的乙醇作为溶剂，在70～80℃下回流提取，过滤，收集提取液；

(2)提取液在40～50℃下减压浓缩，浓缩物在-40～-50℃下冷冻干燥，得腺萼落新妇提取物。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中，在步骤(1)中，腺萼落新妇干燥叶子和溶剂的质量体积比g/mL为1:5～20，优选为1:10。

本发明还提供所述的腺萼落新妇提取物在制备改善和防治肥胖症药物中的应用。

进一步地，所述的肥胖症为单纯型肥胖症、中心型肥胖症。

进一步地，所述的药物包括腺萼落新妇提取物和在药学上可接受的辅料。本领域技术人员可以按照常规加入适当辅料，按照常规方法制备得到适当剂型的制剂，所述制剂剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂等。本发明的腺萼落新妇提取物还可以与化学合成药或天然药物配伍制备成改善和防治肥胖症的药物。

本发明的有益效果：

本发明提供一种具有改善和防治肥胖症作用的腺萼落新妇提取物。该提取物具有良好的改善和防治肥胖症的作用，无不良反应，是一种安全和有效的治疗肥胖症的药物。

附图说明

图1为腺萼落新妇提取物对3T3-L1前脂肪细胞的毒性作用；

图2为腺萼落新妇提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化的作用；

图3为腺萼落新妇提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化相关基因表达的影响；

图4为腺萼落新妇提取物对高脂膳食诱导的肥胖小鼠体重的影响；

图5为腺萼落新妇提取物对附睾丸脂肪细胞大小的影响；

图6为腺萼落新妇提取物对高脂膳食诱导肥胖小鼠的附睾丸脂肪细胞分化相关基因表达的影响。

具体实施方式

下属非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1

一种具有改善和防治肥胖症作用的腺萼落新妇提取物，用如下方法制备得到：

(1)取腺萼落新妇干燥叶子，粉碎，加入其质量10倍量的70％乙醇在70～80℃下回流提取，提取3次，每次1h，合并提取液；

(2)将提取液在40℃下减压浓缩至含水量10％以下，浓缩物在-40～-50℃冷冻干燥，得粉末状腺萼落新妇提取物。

在下述实施例中，粉末状腺萼落新妇提取物中加入适量蒸馏水，配置成适当的浓度，检测其在在预防和治疗肥胖症中的作用。

实施例2

腺萼落新妇提取物(AE)对3T3-L1前脂肪细胞的毒性作用：

将3T3-L1前脂肪细胞置于以5×10⁴个/孔密度接种于96孔培养板，用不同浓度的腺萼落新妇提取物(0、5、10、20、40、80、160和300μg/mL)处理细胞24、48、72、96h，并用MTS实验检测细胞存活率。结果显示：在5-300μg/mL浓度范围内，3T3-L1前脂肪细胞的相对存活率没有明显变化(图1)。

实施例3

腺萼落新妇对3T3-L1前脂肪细胞分化的作用：

1)细胞培养及药物干预

将3T3-L1前脂肪细胞置于含10％Calf serum的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2～3天换液一次，直至细胞单层融合至80％以上进行传代培养。以5×10⁴个/孔密度接种于96孔培养板，用含10％FBS的DMEM培养基继续培养，待细胞生长融合后2天，换用含0.5μM IBMX、1μM地塞米松及10μg/ml胰岛素的DMEM培养基和不同浓度的腺萼落新妇提取物；2天换液一次，干预诱导细胞分化4天后，换用含10μg/ml胰岛素的培养2天，再换用10％FBS培养基继续培养，诱导分化后8天左右，3T3-L1前脂肪细胞呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

2)油红O染色鉴定3T3-L1脂肪细胞的分化

前脂肪细胞为纤维细胞，分化成熟的脂肪细胞形态为近圆形和圆形。二者最重要的区别是分化成熟的脂肪细胞能够合成甘油三酯，进行脂质贮存。细胞质中出现多个小脂滴或者单独一个大脂滴，将胞核挤在旁边。油红O可以与脂滴结合呈红色，因此油红O染色可以直观反应脂肪细胞的分化程度。油红O染料经异丙醇溶解后过滤,置4℃备用。取第0、2、4、8天的细胞，先用预冷的PBS洗3遍，加入2～3ml中性3.6％甲醛室温下固定1小时，再用三蒸水洗净弃去上清液，加入油红O染液室温下染色1小时，三蒸水洗至背景透明。显微镜下观察，可见胞浆中脂滴呈圆形亮红色。

用不同浓度的腺萼落新妇提取物干预3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，随着浓度的升高，抑制作用逐渐加强，相对于空白组，脂肪滴的数量明显减少。图2A为细胞染色的效果，可以直观地看到红色区域不同程度地减少，提示腺萼落新妇具有抑制前脂肪细胞分化的作用。油红O染色后，用异丙醇溶液将油红O溶解，经酶标仪在550nm处测定光密度值，结果与显微镜下直观观察效果相吻合(图2B)，提示腺萼落新妇提取物具有抑制前脂肪细胞分化的作用。

实施例4

腺萼落新妇对3T3-L1前脂肪细胞分化相关基因表达影响：

(1)按照实施例3的1)的方法培养及药物干预3T3-L1前脂肪细胞8天后，将处理好的细胞用4℃预冷的PBS清洗3遍，吸干水分。向各培养皿中分别加入含有10％蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(RIPA)70μL，裂解细胞10min后，刮铲刮取细胞碎片，收集于1.5mL离心管中。冷冻离心(4℃，15000rpm)20min，取上清液。采用BCA法测蛋白浓度，对样品进行不同程度稀释，以使各样品浓度一致。分别向稀释后各样品中加入上样缓冲液，95℃反应10min，冷却混匀，测定脂肪细胞分化时被活性物质抑制的脂质合成转录调控因子(PPAR-γ、C/ebpα、SREBP1)含量和下游因子(FAS、SCD-1)等含量。利用Western Blot的方法测定上述蛋白的表达(图3A)。

(2)上述培养及药物干预8天的分化细胞，用Trizol一步法提取总RNA，经电泳显示28S、18S和5S清晰3条带，测定A260/A280比值大于1.8。定量后取总RNA 1μg，以Oligo(dT)15为引物进行逆转录反应，反应体系20μL。以上步骤得到的cDNA为模板，分别加入相应的上下游引物和SYBR Green荧光染料反应混合液进行荧光实时定量，空白对照管中以等量的DEPC水代替模板。根据实际情况进行必要的修改，荧光定量PCR反应条件为：94℃，1min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环。利用Real-Time PCR的方法测定脂质合成转录调控因子(PPAR-γ、C/ebpα、SREBP1)含量和下游因子(FAS、SCD-1)等基因的表达(图3B)。图3的结果显示，用不同浓度的腺萼落新妇提取物干预3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，随着浓度的升高，抑制脂质合成转录调控因子(PPAR-γ、C/ebpα、SREBP1、FAS、SCD-1)含量。

所述基因的引物序列信息如表1.

表1.

实施例5

腺萼落新妇提取物对高脂膳食诱导的肥胖小鼠体重的影响：

50只雄性ICR小鼠，4周龄，体重约20g，适应性喂养7天后，随机分成正常对照组、高脂组、低剂量组、高剂量组、阳性对照组，每组10只，自由进食及饮水，每天灌喂养1次，每周测2次体重，每天测摄食量和饮水量，饲养9周。饲养条件：室温为(24±2℃)，光照周期为12L/12D。

其中各组处理情况如下：

正常对照组(RD)：普通饲料+自来水；

高脂组(HFD)：高脂饮食+自来水；

低剂量组(AE100)：高脂饮食+自来水+腺萼落新妇提取物100mg/kg；

高剂量组(AE200)：高脂饮食+自来水+腺萼落新妇提取物200mg/kg；

阳性对照组(Oristat)：高脂饮食+自来水+奥利司他(Orlistat)30mg/kg。

与正常对照组相比，未经腺萼落新妇处理的高脂组小鼠体重明显增加。与高脂组相比，腺萼落新妇处理组小鼠体重明显下降，这说明腺萼落新妇能显著抑制高脂膳食诱导的小鼠体重的增加(图4)。

实施例6

腺萼落新妇提取物对血清指标的影响：

在实施例5中，灌喂实验结束后，小鼠禁食不禁水12h以上，用氯仿麻醉，心脏取血，血液在1200g离心15min以分离血清。摘取肝脏和附睾丸脂肪并称量，血清和肝脏放在-80℃保存待分析。血清中血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇及LDL浓度分别用试剂盒测定。高脂组血清中血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇及LDL水平较空白组明显升高。与高脂组相比，腺萼落新妇使得升高的血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇及LDL水平显著下降了(结果如表2)。

表2.腺萼落新妇提取物对血清指标的影响

实施例7

腺萼落新妇提取物对附睾丸脂肪细胞大小影响：

在实施例5中，灌喂实验结束后，分离出的附睾丸脂肪(白色脂肪组织)组织将浸泡于10％甲醛溶液固定过夜，脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为5μm，进行苏木素&伊红(H&E)染色，中性树胶进行封片。通过H&E染色实验观察到，腺萼落新妇灌胃组的附睾丸脂肪细胞大小明显减小(图5)。

实施例8

腺萼落新妇对高脂膳食诱导肥胖小鼠的附睾丸脂肪细胞分化相关基因表达影响：

在实施例5中，灌喂实验结束后，将分离出的附睾丸脂肪放入含有10％蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(RIPA)1mL用粉碎机粉碎后，收集于1.5mL离心管中。冷冻离心(4℃，15000rpm/min)20min，取上清液。采用BCA法测蛋白浓度，对样品进行不同程度稀释，以使各样品浓度一致。分别向稀释后各样品中加入上样缓冲液，95℃反应10min，冷却混匀，测定脂肪细胞分化时被活性物质抑制的PPAR-γ、C/ebpα、SREBP1含量和FAS、SCD-1含量，利用Western Blot的方法测定上述蛋白的表达(图6A)。Trizol-步法提取离出的附睾丸脂肪的总RNA，经电泳显示28S、18S和5S清晰3条带，测定A260/A280比值大于1.8。定量后取总RNA 1μg，以Oligo(dT)15为引物进行逆转录反应，反应体系20μL。以上步得到的cDNA为模板，分别加入相应的上下游引物和SYBR Green荧光染料反应混合液进行荧光实时定量，空白对照管中以等量的DEPC水代替模板。根据实际情况进行必要的修改，荧光定量PCR反应条件为：94℃，1min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环。利用Real-Time PCR的方法测定脂质合成转录调控因子含量和下游因子等基因的表达(图6B)。灌胃不同浓度的腺萼落新妇提取物小组，随着浓度的升高，抑制脂质合成转录调控因子含量越明显。