一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及医疗器械领域，具体地说，涉及一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用。

背景技术：

近二十年来，冠脉支架被广泛用于治疗血管堵塞性疾病。然而支架内再狭窄以及术后长期服药降低了经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的手术获益。如何有效预防并控制再狭窄、改善PCI术后患者的生存质量是广大医务工作者面临的巨大挑战。

研究表明，血管内皮功能损伤和血管平滑肌细胞过度增殖/迁移是再狭窄发生的重要环节。因此，装载血管平滑肌细胞增殖抑制剂(雷帕霉素及其类似物、紫杉醇)的药物洗脱支架(drug-eluting stent，DES)是目前临床最常用的冠脉支架。尽管DES的应用有效降低了术后短期内的再狭窄发生率，但研究表明，DES引起的再狭窄进程特点是经历前6个月的稳定期后进入持续的内膜增生、新生动脉粥样硬化进展期，最终削弱了其抗再狭窄的远期疗效。这个过程可能与血管延迟修复、持续炎症反应有关。越来越多的研究发现，动脉粥样硬化斑块中不仅含有脂质，而且有大量炎症细胞浸润，提示了炎症在介导动脉粥样硬化发生、发展过程中可能起重要作用。越来越多的学者开始研究具有生物相容性的蛋白类药物涂层支架，包括装载TNF-α抗体、环状RGD多肽能抑制血管损伤后炎症反应类支架，加速血管内皮化进程的血管内皮生长因子(bFGF和VEGF)释放支架等。其中人E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)是美国哈佛大学医学院Gill于1998年克隆的小分子量分泌型糖蛋白，该实验室主要研究方向为CREG蛋白对肿瘤细胞分化的影响。前期研究表明CREG蛋白是成熟生物体内维持组织和细胞分化的重要分子，在肿瘤细胞诱导分化和抑制损伤血管VSMCs去分化具有积极的生物学功能。

CN 102309781 A公开了一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白，该发明所述冠脉支架在植入人体以后，通过支架载带的hCREG糖蛋白成分的持续释放来抑制血管平滑肌细胞增殖，并促进血管壁再内皮化，使损伤血管壁迅速愈合。但其其他的应用目前还未被方向，迄今为止，国内外有关CREG蛋白的研究工作非常有限。

技术实现要素：

基于上述已有技术，本发明的目的之一在于提供一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用，其通过抑制炎症反应从而抑制动脉粥样硬化。

为达上述目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种重组hCREG糖蛋白作为制备抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化的药物组合物中的用途。

发明人发现，目前为止，在现有技术中，并没有公开将重组hCREG糖蛋白应用于抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化中的案例。

本发明中，重组CREG表达可对抗TNF-α诱导的巨噬细胞炎症反应，而CREG表达下调则可以促进细胞炎症因子分泌。CREG蛋白通过激活自噬抑制TNF-α诱导的细胞炎症反应；CREG蛋白可能通过改变IGFIIR的定位调控溶酶体发生和溶酶体酶的成熟转运。外源性重组CREG蛋白可明显减轻动脉粥样硬化程度，激活自噬，抑制主动脉炎症反应。因此CREG过表达不仅可以抑制VSMCs的表达，促进内皮细胞的迁移和增殖，升高VEGF的表达，对内皮细胞的修复生长有促进作用，同时还能通过抑制炎症从而抑制动脉粥样硬化的进程。

因此，新型的重组人源性E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)生物蛋白洗脱支架通过抑制动脉粥样硬化降低支架内再狭窄。

优选地，所述重组hCREG糖蛋白为重组人源性CREG糖蛋白和/或其衍生物。

所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5’-aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物为：5’-gc gaattc Gcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’(SEQ ID NO.3)，其中。大写字母代表C/G突变的终止密码，构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG；

(2)重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度；

(3)蛋白提纯根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱脱盐；

(4)重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10％血清培养的VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定重组CREG蛋白的生物学活性。

优选地，所述重组hCREG糖蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

所述重组hCREG糖蛋白的氨基酸序列如下：

MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKLNITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&。

优选地，所述药物组合物还包括药物活性组分。

优选地，所述药物活性组分包括免疫抑制剂、抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物或细胞间基质调节剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述抗增殖药物包括西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、放线菌素、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮或普罗布可中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的用途的重组hCREG糖蛋白制备的冠脉支架，所述冠脉支架表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白。

优选地，所述冠脉支架包括药物涂层。

优选地，所述药物涂层的药物包括雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、肝素、他克莫司或艾罗莫司中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白直接分布在所述冠脉支架表面或所述冠脉支架表面的纳米孔中。

优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层层结构或在所述冠脉支架外管腔和所述冠脉支架内管腔两个不同表面分别分布药物层和糖蛋白层。

优选地，所述冠脉支架的重组hCREG糖蛋白和药物涂层不含聚合物载体。

优选地，所述冠脉支架的金属材料为钛、钴、钽、镍钛合金、镍钛锘合金、医用不锈钢或聚合物材料中的任意一种或至少两种的混合物。

优选地，所述聚合物材料包括可降解和/或不可降解材料。

优选地，所述可降解材料为PCL和/或PLGA。

优选地，所述冠脉支架表面均匀分布100-800nm的微孔，例如可以是100nm、101nm、102nm、105nm、108nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、250nm、260nm、280nm、300nm、320nm、350nm、380nm、400nm、420nm、450nm、460nm、480nm、500nm、520nm、550nm、580nm、600nm、620nm、650nm、680nm、700nm、720nm、750nm、780nm或800nm。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的冠脉支架的制备方法，包括如下步骤：

将重组hCREG糖蛋白和/或药物溶于单一溶剂或混合溶剂中，通过直接喷涂和/或浸涂的方法涂覆于支架表面。

优选地，所述喷涂和/或浸涂的方法为静电喷涂、阳极化方法喷涂或阳极化方法浸涂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述重组hCREG糖蛋白的溶剂为蒸馏水、生理盐水、pH值为3.0-9.0的硼酸盐缓冲溶液、pH值为8.0-10.0碳酸盐缓冲溶液、pH值为3.0-9.0醋酸盐缓冲溶液、浓度为1-20％的乙醇溶液或pH值为3.0-9.0磷酸盐缓冲溶液中的任意一种或至少两种的混合。

优选地，所述重组hCREG糖蛋白的浓度为0.001-1mg/mL，例如可以是0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL、0.008mg/mL、0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL。

优选地，所述药物的溶剂为链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，可以优选丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷中的任意一种或至少两种的混合。

第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的冠脉支架在抑制动脉粥样硬化、促进内皮修复生长、加速血管再内皮化或减少服用抗血栓和血小板药物的时间的用途。

与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明发现重组hCREG糖蛋白有抑制动脉粥样硬化、促进内皮细胞修复生长，减少术后服用抗血栓和血小板药物的时间的功能；

(2)本发明将hCREG与各种药物联合应用，提高了治疗效果，本发明不仅能保持现有药物洗脱支架的优势，还能抑制动脉粥样硬化的发展，促进血管再内皮化，对解决现有冠脉支架新生动脉粥样硬化引起的再狭窄及术后需长期服用抗血栓和血小板药物有重要的临床意义。

附图说明

图1为本发明支架电镜图；图1(A)为纳米微孔裸支架电镜图，图1(B)为CREG糖蛋白洗脱支架电镜图；

图2(A)为本发明实施例5小鼠动脉大体油红O染色观察图，图2(B)为CREG蛋白对高脂喂养的ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化程度的影响；

图3(A)为本发明实施例5小鼠主动脉瓣水平切片HE染色图，图3(B)为CREG蛋白对高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化程度的影响；

图4(A)为本发明实施例5小鼠主动脉组织匀浆ELISA，图4(B)为小鼠主动脉免疫组织化学染色检测，图4(C)为CREG蛋白对高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉炎症的影响；

图5为HE染色显示4周时裸金属支架组内膜明显增厚。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1重组hCREG糖蛋白的制备

所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5’-aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物为：5’-gc gaattc Gcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’(SEQ ID NO.3)，其中。大写字母代表C/G突变的终止密码，构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG，所述重组hCREG糖蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：

MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKLNITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&(SEQ ID NO.1)；

(2)重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱(美国Invitrogen公司)纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度；

(3)蛋白提纯根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱(GEHealthcare Bio-SciencesAB)脱盐；

(4)重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10％血清培养的VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定重组CREG蛋白的生物学活性。

实施例2重组hCREG糖蛋白冠脉支架的制备

采用乐普(北京)医疗器械股份有限公司的纳米微孔金属裸支架，该支架将316L不锈钢金属裸支架采用38％的盐酸腐蚀12小时后在电场的作用下用28％的盐酸腐蚀5分钟，在支架表面制备出100-800nm的纳米孔。

采用实施例1制备得到的CREG蛋白，用pH为9.6(0.05mol/L)的碳酸钠缓冲溶液将CREG蛋白制备成1.6mg/mL的包被缓冲液，将纳米微孔金属裸支架放入配制好的包被缓冲液，浸泡48小时后取出，-55℃真空干燥机中冻干，4℃保存。

制备得到的重组hCREG糖蛋白冠脉支架的扫描电镜图如图1所示，可见支架表面吸附了大量的CREG蛋白。

实施例3药物蛋白联合支架的制备

按照实施例2的方法制备纳米微孔金属裸支架。

用丙酮溶液配置浓度为1％的雷帕霉素药物。用球囊保护支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素药物。

采用pH为9.6(0.05mol/L)的碳酸钠缓冲溶液将CREG糖蛋白制备成1.6mg/mL的包被缓冲液，将纳米微孔金属裸支架放入配制好的包被缓冲液，浸泡48小时后取出，-55℃真空干燥机中冻干，4℃保存。

实施例4双药物蛋白联合支架的制备

本实施例的冠脉支架表面均匀分布有重组hCREG糖蛋白、雷帕霉素和紫杉醇药物。雷帕霉素和紫杉醇药物分布在支架外表面，支架内管腔分布重组hCREG糖蛋白。

按照实施例2的方法制备纳米微孔金属裸支架。

制备双药物支架：保护支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素和紫杉醇药物，药物浓度为1％，药物溶剂采用四氢呋喃，雷帕霉素和紫杉醇药物之间的比值1：1。

采用pH为9.6(0.05mol/L)的碳酸钠缓冲溶液将CREG糖蛋白制备成1.6mg/mL的包被缓冲液，将制备好的双药物支架放入配制好的包被缓冲液，浸泡48小时后取出，-55℃真空干燥机中冻干，4℃保存。

实施例5重组hCREG糖蛋白抑制动脉粥样硬化的实验研究

采用实施例1制备的CREG蛋白，给高脂喂养小鼠4周后皮下植入蛋白质注射泵，按照30μg/kg泵入CREG蛋白，重组CREG蛋白可明显减轻高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化程度，激活自噬，抑制主动脉炎症反应。

结果如图2-4所示，从图2(A)-(B)显示了主动脉大体油红O染色观察CREG蛋白对高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化程度的影响，结果发现CREG蛋白可减少动脉粥样硬化斑块的形成。图3(A)-(B)显示了主动脉瓣水平切片HE染色观察CREG蛋白对高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化程度的影响，结果发现CREG蛋白过表达可以显著减少斑块面积。图4(A)-(B)显示主动脉组织匀浆ELISA及主动脉免疫组织化学染色检测CREG蛋白对高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉炎症的影响，结果发现CREG可以减少炎症标志物CD68和MCP-1的表达，抑制粥样斑块炎症的发生。图5(A)-(C)将CREG洗脱支架(CREG)，雷帕霉素药物洗脱支架(SRL)及裸金属支架(Metal)植入猪冠脉模型后的结果显示，CREG蛋白洗脱支架对粥样硬化有显著的抑制作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。