本发明属于生物和医药领域，具体地涉及低生物活性但具有强免疫原性的的肿瘤坏死因子α（TNF-α）疫苗的制法和用途。本发明制备到的抗原几乎不具有TNF-α毒性，但是在小鼠体内却具有强的免疫原性。
背景技术：
肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 作为一种重要的免疫调控分子，在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。TNF-α是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能。近年来研究发现，多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。抑制TNF-α的功能已被证实可有效治疗上述疾病。事实上，在过去10年-15年中，美国FDA已批准5种TNF-α抑制剂，用于治疗包括类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。这些抑制剂全部为单克隆抗体，包括Remicade、Humira、Simponi、Cimzia和Enbrel。这些药物是目前世界上最畅销的生物制剂。2014年，Humira、Remicade和Enbrel的销售额分别达到125.4亿美元、92.4亿美元和85.38亿美元。
单克隆抗体药物具有一些缺点，包括用药剂量大（100 mg），使用频繁（2-4次/月），费用昂贵，以及会产生抗药性抗体，因此在中国只有不到10%的患者能够长期使用。预防型疫苗是人类医疗史上最伟大的发明，在上个世纪挽救了上百万的生命。近年来针对针对自体蛋白的治疗型疫苗也迅速发展，到目前已有20多个针对高血脂、高血压、肥胖、自身免疫性疾病和肿瘤等慢性疾病的疫苗进入临床试验。与单克隆抗体相比，疫苗用药剂量少（100 ug），使用不频繁（2-3次/年），费用相对较低以及不产生抗药性抗体。因此研发靶向TNF-α的疫苗被认为在保持抗体药物治疗疾病的效果的同时，可有效解决单克隆抗体药物的各种缺点。
目前多种以TNF-α为靶点的疫苗已经进展到不同的阶段治疗。由于免疫耐受机制的存在，自体蛋白单独注射免疫并不能诱导产生抗体。为自体蛋白提供外源Th表位已被证实可有效帮助打破免疫耐受，赋予自体蛋白免疫原性。在mTNF-α分子中通过插入非天然的硝基酪氨酸从而引入外源的Th表位。结果证实该抗原可成功打破小鼠的免疫耐受，诱导产生针对mTNF-α的中和抗体。但是用该方法构建的抗原，TNF-α保留生物活性，因此免疫时会引起副作用。2006年Le Buanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet em℃yanin, KLH)上，通过甲醛可有效灭活TNF-α的活性。但是遗憾的是，该抗原在II期临床试验中并没能诱导产生的针对hTNF-α的中和抗体。因此开发新的针对TNF-α的疫苗具有重要意义，而这些疫苗的制备需要解决两个问题：（1）去除TNF-α的生物活性，降低抗原的毒副作用；（2）保留抗原的免疫原性，在体内能有效诱导产生中和TNF-α的抗体。
CRM197（cross-reacting materials 197）是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体[J. Biol. Chem. 1973. 248:3838-3844.]，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU[Nucleic Acids Research. 1984. Vol.12 No.10, P4063-4070.]。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，白喉毒素的A片段能与NAD结合而CRM197不能，这表明NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明CRM197与白喉毒素的差异在于52位的GLY突变为GLU，这就证明了52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点——同NAD:EF2 ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片段A不能EF2结合，不能对细胞起到毒性作用[Acta path microbiol immunol scand sect C. 1984,92:17-23.]。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其他抗原或半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但是都能使小孩产生较强的免疫记忆[J. Clin. Invest. 1985:52-59.]。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗（球菌表面多糖，PnPS）不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPS-CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用[Pediatr. Infect. Dis. J. 2000, 19(3):187-195.]。目前该产品也通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar[BIOPHARMA: Biophamaceutical Products in the U.S. Market]。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率，而且，不同的糖其交联率也存在差异，这说明交联率也与交联物相关[Biophysical Journal. 2004, 86(1 Pt 1):3-9.]。因此，本研究将hTNF-α偶联到CRM197突变体上，并检测该抗原在小鼠体内的免疫原性。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗，包括TNF-α抗原、CRM197以及液体佐剂。
具体的，人TNF-α是重组表达获得的重组蛋白，CRM197作为载体蛋白，液体佐剂是氢氧化铝佐剂。
本发明的另一个目的是提供生产含佐剂的抗TNF-α的蛋白质疫苗的制备方法，步骤包括基因重组获得抗人TNF-α，用化学偶联剂将人TNF-α与细菌毒素化学偶联，对抗原灭活，最后添加液体佐剂。
具体地，化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛，偶联的细菌毒素是用于制作白喉毒素疫苗的CRM197，其安全性是可靠的。
本发明还有一个目的是提供一种增强抗TNF-α疫苗的免疫原性的方法，包括步骤：（1）采用TNF-α全蛋白，富含线性和非线性B细胞表位；（2）引入CRM197，作为载体蛋白，可有效递送抗原到MHC类分子上；（3）引入佐剂氢氧化铝，其是成熟的人体用佐剂，安全性是可靠的。
本发明还提供这种含佐剂的抗TNF-α疫苗的用途。
相比与现有技术，本发明将人TNF-α与完整的CRM197偶联，并对抗原进行灭活，最后添加安全的佐剂氢氧化铝。在不引起毒副作用的基础上，疫苗可诱发机体产生有效的免疫反应，从而为TNF-α相关疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病和强直性脊柱炎等提供治疗基础。上述疫苗可能显著提高疫苗的免疫原性，激发强烈的免疫反应，从而延长病人的生存期，改善生活质量。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，发现将人TNF-α蛋白与完整CRM197化学偶联，经甲醛灭活后，抗原保留有免疫原性，可以有效激发小鼠产生针对人TNF-α的抗体。在此基础上完成了本发明。
代表性蛋白
肿瘤坏死因子α(TNF-α)
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha) 主要由被激活的单核细胞或巨噬细胞分泌，在参与系统性炎症的同时也是引起急性期反应的细胞因子之一。
单个TNF-α分子由两个β折叠片层组成，其中每一个均为外侧亲水氨基酸丰富而内侧疏水氨基酸丰富。三个单体TNF-α组成三聚体，其中间形成了疏水氨基酸孔道，显著区别于两端极性氨基酸。单体分子的N端和C端在三聚体底部，在三聚体顶部出现单体分子的内部二硫键。三聚体形式是其生物活性的基础。
人TNF-α氨基酸序列（CAD20719）如下所示：
1 MVRSSSRTPS DKPVAHVVAN PQAEGQLQWL NRRANALLAN
41 GVELRDNQLV VPSEGLYLIY SQVLFNNFTV SFWLRVPKVS
81 ASHLEVSYQT KVNLLSAIKS PCQRETPEGA EAKPWYEPIY
121 LGGVFQLEKG DRLSAEINRP DYLDFAESGQ VYFGIIAL
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的人TNF-α蛋白与CRM197化学偶联产物 hTNF-CRM197，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一个突变位点或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多个突变位点或多种单突变位点蛋白组合或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、 栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明hTNF-CRM197。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约 0.001 毫克/千克至 1000 毫克/千克，较佳地约 0.01 毫克/千克至 100 毫克/千克体重的突变蛋白。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的hTNF-CRM197)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚 乙 醇 酸 等 。 这 些 载 体 是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明hTNF-CRM197)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等； (2)水包油型乳剂配方， 例如：(a) MF59(参见 WO 90/14837)， (b) SAF，
和(c) RibiTM佐剂系统(RAS) (Ribi Immun℃hem, Hamilton, MT) (3) 皂素佐剂；(4) Freund 完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5) 细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素 LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲物质等可存在于这类运载体中。更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗， 包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(iii)给药途径和剂量
一旦配制成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的突变蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予突变蛋白疫苗，即突变蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于)：类风湿性关节炎、银屑病、炎症性肠炎等。
在各疫苗剂份中所选用的抗原蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约 1μg-1000mg，较佳地为 1μg-100mg，更佳地 10μg-50mg 蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的第一方面，提供了一种强化抗TNF-α的蛋白质疫苗的免疫原性的方法。该方法的原理是：（1）使用完整的人TNF-α蛋白作为抗原组分，具有更多的B细胞表位；（2）引入CRM197作为载体蛋白，可有效递呈抗原到MHC类分子上，帮助打破机体免疫耐受，增强抗原的免疫原性；（3）氢氧化铝是人体内广泛使用的免疫佐剂，可增强Th2免疫反应，诱导产生抗体，其安全性可靠。
本发明的第二方面，提供了一种抗TNF-α的蛋白质疫苗。该疫苗采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在疫苗分子中，人TNF-α含有多个B细胞表位，为了叙述方便，在实施例中，本发明将人TNF-α用“hTNF-α”表示；CRM197是白喉杆菌产生的外毒素，为了叙述方便，在实施例中，本发明中将其用“CRM197”表示；将偶联后的蛋白质抗原表示为“hTNF-CRM197”。
本发明的第三方面，提供了一种生产抗TNF-α的蛋白质疫苗的方法，其制造方法如下：
1 hTNF-α模板构建：根据hTNF-α的cDNA序列（基因序列号E01647），在hTNF-α基因前端加入SUMO蛋白基因序列（基因序列号AF510519）并由上海捷瑞生物工程有限公司按照PCR合成法进行合成，通过BamH I和Nde I内切酶的酶切位点构建至pET28a载体中，得到pET28a-SUMO-TNF-α质粒。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
2 PCR扩增：用合成的pET28a-SUMO-TNF-α质粒为模板（10μmol/L，0.5μL），加入T7-F（10μmol/L，1.5μL），T7-R（10μmol/L，1.5μL），KOD-Plus 1μL，10 KOD-Plus Buffer 5μL，MgSO4（25 mmol/L，2μL），dNTPs（2 mmol/L，5μL）ddH2O补齐至反应体系为50 μL进行重叠延伸PCR反应，首先94℃预变性时间2min；随后35个反应循环：94℃变性时间15s，55℃退火时间30s，68℃延伸时间120s；最后在68℃延伸反应10min。PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，25 min），然后将目的基因片段所处的琼脂糖凝胶割下，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。
本发明所用的各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（如下表）：
引物名称 序列5’- 3’
T7-F TAATACGACTCACTATAGGG
T7-R GCTAGTTATTGCTCAGCGG
4 载体线性化：将pET28a空质粒（10μmol/L，5μL），加入FAST内切酶BamH I 1μL和Nde I各1μL，10 FastDigest Buffer 5μL，ddH2O补齐至反应体系50 μL进行载体线性化，条件为37℃，4 h。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，25 min），然后将目的片段所处的琼脂糖凝胶切下，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。
5 同源重组：方法3中获得的基因片段，其上下游引物两端含有和pET28a载体相同序列的同源臂，故通过同源重组法将其整合至线性化质粒pET28a的BamH I及Nde I酶切位点之间。反应体系20 μL，含2 μL ExnaseTm II、4 μL 5 CE II buffer、方法4中制备的线性化质粒60 ng，方法3中获得的基因片段120 ng，反应体系不足20 μL以ddH2O补足，所有组分轻柔混匀，37℃孵育30 min，然后立即置于冰上5 min备用。转化步骤：取5 μL反应产物加入到100 μL E. Coli DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，之后42℃热激90 s并立即置于冰上5 min，然后加入300 μL LB无抗性培养基，在37℃、180 r/min振摇复苏1 h，取300 μL于LB固体平板（Kan 50 μg/mL）涂布均匀，37℃倒置培养15h并挑取单克隆培养。按照Axygen质粒抽提试剂盒标准操作回收抽提菌液中质粒。
6质粒鉴定：加入T7-F（10μmol/L，1.5μL），T7-R（10μmol/L，1.5μL），KOD-Plus 1μL，10 KOD-Plus Buffer 5μL ，MgSO4（25 mmol/L，2μL），dNTPs（2 mmol/L，5μL）ddH2O补齐至反应体系为50 μL，首先94℃预变性时间2min；随后35个反应循环：94℃变性时间15s，55℃退火时间30s，68℃延伸时间120s；最后在68℃延伸反应10min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，25 min），用凝胶成像仪拍照。将出现目的条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
7 hTNF-α蛋白诱导表达：取上述测序正确的菌种对应质粒1μL，热激法转化50 μL E. Coli BL21感受态细胞，取300 μL于LB固体平板（Kan 50 μg/mL）涂布均匀，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆接种于 25 mL LB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、180 r/min振摇培养过夜。将过夜菌按1:500（v:v）转接至 2L TB培养基（Kan 50 μg/mL），37℃、200 r/min振摇培养4-5h，当OD600nm达到0.6时加入1mL的1 mol/L IPTG，25℃、180 r/min振摇培养20-24 h。室温8000 r/min离心5 min收集菌体并称重。
8 破菌并纯化：每1 g菌体充分重悬于20 mL上样缓冲液（500 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）进行超声裂解。超声条件设置：超声3s，停5s，功率1%，时间10 min。超声液4℃，12000 r/min 离心40 min后取上清液备用。将Ni-IDA亲和层析柱用平衡液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 8.0）冲洗10个柱体积以上直至基线冲平。上清液以2 mL/min流速上样，然后用洗杂液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，50 mmol/L Imidazole，pH 8.0）冲洗20个柱体积至紫外峰稳定且低于20mAU，用洗脱液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，500 mmol/L Imidazole，pH 8.0）洗脱蛋白，当紫外峰上升至50mAU时开始收集，并于再次下降到50mAU时停止收集。
9 hTNF-α蛋白酶切与目的蛋白获得：将SUMO蛋白酶（2mg/mL）与蛋白洗脱液按体积比1:100充分混匀后，于透析袋中（3.5 kDa孔径，购自Thermo公司），将透析袋置于4L PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）中4℃透析。每隔12小时更换一次PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）溶液，重复2次。最后一次更换溶液后第12小时检测酶切是否充分。取透析样40 μL，加入10μL 5 变性还原缓冲液，充分混匀后再进行沸水浴五分钟，进行12% SDS-PAGE蛋白电泳，上样10μL，浓缩胶90 V电压电泳, 之后电压120 V，总时间约90min，蛋白胶的制备及Running buffer配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后确定蛋白酶切完全，再次准备过Ni-IDA亲和层析柱，AKTA连接方法与试剂配制按照方法8。以2 mL/min流速上样，当紫外峰上升至40mAU时开始收集，并于再次下降到40mAU时停止收集。
10 hTNF-α蛋白纯度和浓度鉴定：取流穿峰40 μL并加入10 μL 5 变性还原缓冲液充分混匀，进行沸水浴5 min。将上述处理后样本进行SDS-PAGE电泳检测，上样10μL、分离胶浓度12%，前20min电压90 V，之后电压120 V，总时间约90min，蛋白胶的制备及变性还原缓冲液配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后用凝胶成像系统内置软件分析蛋白纯度。使用BCA定量法，采用3kD孔径的超滤管进行浓缩。直至将目的蛋白浓度调节至为0.5-1mg/mL。在超净台中，将制备好的蛋白溶液每管1mL分装到1.5mL EP管中冻存在-70℃冰箱中以备后续实验使用。
11 hTNF-CRM197抗原制备：采用双功能偶联剂戊二醛进行偶联。上述重组表达的hTNF-α和商品化的CRM197（购自Enzo Life Sciences, Inc.）溶解于PBS后，在偶联瓶中混匀，向混合液中缓慢的滴加0.25%戊二醛溶液，于4 ℃反应4小时，然后反应液于4 ℃对PBS透析，获得化学偶联的hTNF-CRM197。
12 甲醛灭活：以在至少60mM至少10天（240小时）到至少120mM至少6天（144小时）范围的浓度/反应时间的条件添加甲醛。之后通过添加淬灭化合物阻断与甲醛的反应，所述淬灭化合物选自（i）还原剂和（ii）选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的氨基酸。
13 收集抗原：使用截断值至少100 kDa（优选300 kDa）的滤膜进行切向流过滤，使得分子量小于100 kDa（优选300 kDa）的物质从所述产品中去除。
14 用L929细胞检测hTNF-α生物活性：小鼠成纤维细胞L929购自中国科学院细胞库（目录号：GNM28），采用RPMI-1640培养基于5 % CO2、37℃恒温培养箱中培养。在培养至对数生长期的小鼠成纤维细胞L929中加入5mL的PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）洗涤1次；加入0.5mL的胰酶于37℃消化2-4min，每隔1min显微镜观察是否消化完全，及时加入血清终止；以1000r/min离心5min后，吸去上清液。加入5mL的RPMI 1640培养基重悬，1000r/min离心5min后再次加入5mL的RPMI 1640培养基重悬，以彻底去除胰酶；用血球计数法计数后，在超净台中以RPMI 1640培养液调整L929细胞浓度至2 105个/mL，于96孔细胞培养板内加100μL L929细胞悬浮液每孔（96孔板最外围的一圈孔槽中加入PBS防止液体吸干）。置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜，至细胞贴壁率达95%以上。当上述96孔板的细胞贴壁率达95%以上后，将野生型的TNF-α及其突变蛋白用培养基分别稀释为1000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL、0.1 ng/mL、0.01 ng/mL、0.001 ng/mL、0.0001 ng/mL，加入100μL上述稀释液于对应各孔（阴性对照加100μL PBS）中，再加入终浓度为1μg/mL的放线菌素D，每个稀释度设置3个重复孔。在37℃、5% CO2培养20小时后每孔加入20μL CCK-8染料（Cell Counting Kit，基于 WST-8（化学名:2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐的试剂盒），37℃、5% CO2继续培养4小时，酶标仪测定OD450nm值。 用GraphPad Prism 5.0软件进行深入分析。依据各样品OD450nm值，用下列公式计算hTNF-CRM197针对L929细胞的杀伤率：
L929细胞杀伤率（%）=(1-实验组OD450/阴性对照OD450)×100% （1）
以L929细胞杀伤率为纵坐标，而试验中所用TNF-α浓度作为横坐标作图。使用GraphPad Prism 5.0软件的“log(agonist) vs. response”方程来拟合结果得到作用曲线和半数有效浓度值（EC50）。依据所得hTNF-α及其点突变蛋白的EC50，进而求得hTNF-CRM197的相对生物活性：
hTNF-TT蛋白相对生物活性（%）=(hTNF-α EC50（ng/mL）)/(点突变TNF-α EC50（ng/mL） )×100% （2）
15 动物免疫：雌性6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠购自维通利华北京公司，并按照AAALAC指南要求进行饲养。免疫前，以PBS（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，pH 7.4）将hTNF-CRM197稀释至0.5 mg/mL， 再与氢氧化铝佐剂按体积比1:1进行混合至蛋白终浓度250 μg/mL。30只小鼠，随机分为3组，每组10只，分别用PBS和hTNF-CRM197/氢氧化铝免疫接种。接种方法和剂量为：小鼠腋下淋巴结部位选取4个点进行皮下注射，每次每只小鼠200μL。每两周加强免疫一次，在第三次免疫7天后，从各小鼠眼眶取血，室温静置2 h，4000 r/min离心10 min后，弃沉淀并取上部血清-20℃备用。
16 免疫反应检测：用包被缓冲液（50 mmol/L 碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）将野生型hTNF-α蛋白稀释至浓度为100 ng/100 µL，然后转移到聚苯乙烯96孔板上（每孔加 100 µL）4℃孵育过夜。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。再加入300 µL含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST），37℃孵育2小时进行封闭。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟，然后用含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST）将方法14中收集的抗血清稀释100倍，之后每孔加100 µL，37℃孵育1小时，用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。将二抗（羊抗鼠- IgG-辣根过氧化物酶交联物）用含5%（m/v）脱脂奶粉的封闭液（溶于PBST）稀释8000倍，向每孔加入100μL稀释后的二抗，37℃孵育1小时。用PBST（0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，0.137mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.15%(v:v) Tween-20，pH 7.4）每孔300µL洗板6次，每次5分钟。每孔加100μL底物溶液TMB（购自碧云天公司生物技术），37℃中放置15min，然后加入25 µL 2 mol/L的H2SO4终止反应。用酶标仪测定OD450nm值。
从结果可知，以野生型hTNF-α蛋白作为包被抗原，将各突变蛋白免疫组的小鼠抗血清作为一抗孵育时，hTNF-CRM197抗血清中的抗体能识别野生型hTNF-α蛋白，说明该抗原保留了免疫原性。