本发明涉及一种抗禽腺病毒疫苗组合物及其制备方法和应用，属于生物医药领域。
背景技术：
：禽腺病毒感染症(Fowladenovirus，FADV)的疾病是因I群家禽腺病毒(FADV)发病的传染病。FADV属于腺病毒科(FamilyAdenoviridae)，基因组(gemone)由没有分节的线形双链(double-stranded)DNA构成。禽腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，线状双股DNA与核心蛋白形成直径为60～65nm的髓芯,被包裹于衣壳内。衣壳呈二十面体对称,由252个直径8～10nm的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,每边6个,其中240个为六邻体(非顶点壳粒，),另12个为五邻体基底(顶点壳粒，penton蛋白)。每个五邻体基底上结合着2根长9～77.5nm的纤维突起(fiber-1蛋白和fiber-2蛋白)。近年来，禽腺病毒引起的疾病发病率突然提高，3～5周龄肉鸡发病尤为危害，严重时死亡率突然上升至80％以上。疫苗免疫可有效预防该病，然而在现有技术中，由于禽腺病毒不易培养，难以获得高滴度的病毒，尤其是不同分离株差异较大，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果，且全病毒疫苗还存在灭活不完全造成的生物安全方面的风险。现有技术中的亚单位疫苗其抗原成分为构成病毒衣壳主要成分的六邻体(240/252)，然而一直以来，免疫效力低下，未开发成产品。因此，临床上急需要开发出免疫效果好的疫苗组合物，能够有效防止该病的流行。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽腺病毒免疫原性蛋白、及其制备的疫苗及其制备方法以及应用，该疫苗能够有效预防禽腺病毒的感染。本发明涉及一种禽腺病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的禽腺病毒抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述禽腺病毒抗原包括亚单位抗原或含有重组所述禽腺病毒免疫原性蛋白基因的活载体。本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：步骤(1)克隆本发明所述禽腺病毒蛋白基因；步骤(2)转化重组所述步骤(1)中克隆的蛋白基因；步骤(3)表达所述重组的禽腺病毒蛋白；步骤(4)分离纯化所述重组的禽腺病毒蛋白，使用非离子表面活性剂处理所述纯化的重组的禽腺病毒蛋白；步骤(5)将所述禽腺病毒蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。本发明还涉及本发明所述的疫苗组合物在制备预防和治疗禽腺病毒感染的药物中的应用。本发明选取的禽腺病毒蛋白基因，高效表达后，首次采用禽腺病毒fiber-2蛋白制备的疫苗组合物，可预防和/或治疗禽腺病毒疫情蔓延，并且含有该蛋白的疫苗组合物免疫动物后能使动物机体快速产生抗体，对当前流行的禽腺病毒单独或混合感染有良好的预防和控制效果，生物安全性好。本发明首次采用禽腺病毒fiber-2蛋白制备疫苗组合物，其免疫原性好，能对鸡产生完全保护，在临床应用上能对多种基因型禽腺病毒的感染进行预防。具体实施方式以下，对本发明的实施方式进行说明。术语“禽腺病毒”(Fowladenovirus，FADV)属于腺病毒科，基因组由没有分节的线形双链DNA构成，所引发的临床症状包括病鸡萎顿，蹲伏，羽毛蓬松，冠髯和面部皮肤苍白，生长不良。病理变化以卡他性气管炎和心包积液综合征为特征。本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的禽腺病毒fiber-2蛋白或免疫量的含有重组禽腺病毒fiber-2蛋白基因的活载体，以及药学上可接受的载体。本发明的禽腺病毒fiber-2基因还可以应用于表达载体、活载体、核酸疫苗、诊断试剂开发以及其他预防和/或治疗禽腺病毒相关药物开发。本发明涉及一种重组载体，所述重组载体能表达本发明所述的核苷酸序列编码的fiber-2蛋白。本发明首次发现，在禽腺病毒壳粒表面含量极少的fiber-2蛋白具有良好的免疫原性，其制备的亚单位抗原或含有其重组基因的活载体均能在免疫后产生良好的免疫效力，对鸡提供100％的保护。本发明的含有禽腺病毒fiber-2蛋白重组基因的活载体可以是本领域中常见的活载体形式，如新城疫病毒、痘病毒、沙门氏菌弱毒疫苗株。本发明涉及一种转化子，所述转化子包含有导入的本发明所述的重组载体。本发明还涉及一种禽腺病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的禽腺病毒抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述禽腺病毒抗原包括亚单位抗原。本发明所用术语“疫苗组合物”指含有禽腺病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽腺病毒的免疫反应。术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。术语“禽腺病毒抗原”是指至少含有一种禽腺病毒抗原形式的任何组合物，所述禽腺病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗禽腺病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。作为本发明的一种实施方式，所述禽腺病毒fiber-2蛋白为SEQ.IDNO.1编码的蛋白。作为本发明的一种实施方式，所述禽腺病毒fiber-2蛋白含量为AGP效价≥1:2。作为本发明的一种优选实施方式，所述禽腺病毒fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽腺病毒抗原之外的其他所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechIncorporation,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticalsIncorporation，BirminghamAL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(EuropeanPharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoidoil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《Thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》(Ed.byDESStewart-Tull,JohnWileyandSons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用PowellM和NewmanM编写的《Vaccinedesign,theSubunitandadiuvantapproach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphaticradical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenicallyunsaturatedgroup)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(RibiIncorporation)、Blockco-polymer(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100；优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；优选地，所述佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂；所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的fiber-2蛋白或其功能性变异体以及兽医学上可接受的载体。作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的fiber-2蛋白，其实质上由序列表SEQIDNO.1编码，以及药学上可接受的载体。本发明的fiber-2蛋白可以通过本领域内任何已知的方法制备，例如可以通过重组表达fiber-2基因制备fiber-2蛋白，表达系统可以使用任何已知的表达系统，例如：真核表达系统、原核表达系统。或者直接合成fiber-2蛋白序列。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价≥1:2的fiber-2蛋白抗原或其功能性变异体。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价≥1:2的fiber-2蛋白抗原，其实质上由序列表SEQIDNO.1编码。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价1:2～1:16的fiber-2蛋白抗原或其功能性变异体。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价1:2～1:16的fiber-2蛋白抗原，其实质上由序列表SEQIDNO.1编码。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价1:4的fiber-2蛋白抗原或其功能性变异体。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括AGP效价1:4的fiber-2蛋白抗原，其实质上由序列表SEQIDNO.1编码。作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步包括一种或多种其他抗原，所述其他抗原包括鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物进一步包括一种或多种其他抗原，所述其他抗原为鸡新城疫病毒灭活抗原、禽流感病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白、减蛋综合征病毒灭活抗原。作为本发明的一种优选实施方式，所述鸡新城疫病毒抗原为N7a株灭活抗原、禽流感病毒抗原为SZ株灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原为M41株灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原为VP2蛋白、减蛋综合征病毒抗原为AV-127株灭活抗原。作为本发明的一种实施方式，所述禽腺病毒fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16，所述鸡新城疫病毒抗原含量为灭活前108.0～109.0EID50/0.1ml，所述禽流感病毒含量为灭活前106.5～108.5EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒含量为灭活前106.0～107.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述减蛋综合征病毒抗原含量为灭活前107.0～108.0EID50/0.1ml。作为本发明的一种优选实施方式，所述禽腺病毒fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16，所述鸡新城疫病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述禽流感病毒含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒含量为灭活前106.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述减蛋综合征病毒抗原含量为灭活前107.0EID50/0.1ml。作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括禽腺病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。术语“联合疫苗”指本发明的禽腺病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的禽腺病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的禽腺病毒可与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒和/或大肠杆菌、副鸡禽杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体混合或组合。本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：步骤(1)克隆所述禽腺病毒fiber-2蛋白基因；步骤(2)转化重组所述步骤(1)中克隆的fiber-2蛋白基因，获得重组fiber-2蛋白的大肠杆菌；步骤(3)表达所述重组的禽腺病毒fiber-2蛋白；步骤(4)分离纯化所述重组的禽腺病毒fiber-2蛋白，使用非离子表面活性剂处理所述纯化的重组的禽腺病毒fiber-2蛋白；步骤(5)将所述处理的禽腺病毒fiber-2蛋白抗原与佐剂混合，乳化。本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和治疗禽腺病毒感染的药物中的应用。术语“预防和/或治疗”在涉及禽腺病毒感染时是指抑制禽腺病毒的复制、抑制禽腺病毒的传播或防止禽腺病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽腺病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1pET28a_FADV_fiber-2表达载体的构建1FADV病毒DNA的提取质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNALigase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物,其他试剂均为分析纯。按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml感染禽腺病毒FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strainFAV-HN)，保藏号为：CCTCCNO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日。)鸡的肝脏悬液于无菌1.5ml离心管中，加0.4mlVB于样品液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45mlADbuffer于样品液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4mlW1buffer，14000g离心30秒，加0.6mlWashbuffer于VB柱，14000g离心30秒，空离3分钟，加入50ulRNasefreewater置膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，离心的液体即为DNA基因组。2fiber-2基因扩增根据fiber-2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。表1fiber-2基因引物fiber2-fCTCCGGGCCCCTAAAAGfiber2-rCGGGACGGAGGCCGC将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对fiber-2基因进行密码子优化，优化后的fiber-2基因序列如序列表SEQIDNO.1所示。3表达载体构建优化后fiber-2基因送由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，并分别连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆既为pET28a_FADV_fiber-2表达菌株。实施例2fiber-2蛋白的制备将含有实施例1中制备的pET28a_FADV_fiber-2/E.ColiBL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4-0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4,定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，fiber-2蛋白的AGP效价达到1：64，内毒素含量为0.48×105EU/ml。实施例3大肠杆菌表达fiber-2蛋白内毒素清除1.5ml离心管中加入0.5ml待处理溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(TritonX-114)(5μl)，涡旋振荡。样品在冰上放置5分钟。涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的形状残留在离心管底部。整个操作循环3次。经测定，fiber-2蛋白的AGP效价达到1：64，内毒素含量为0.008×105EU/ml。结果表明TritonX-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对fiber-2蛋白免疫原性没有影响。实施例4禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备将按实施例3的方法纯化后的fiber-2蛋白缓缓加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表2。表2禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗配比组分疫苗1疫苗2疫苗3fiber-2蛋白(AGP效价)1：21:41:16白油佐剂(V/V％)66％66％66％实施例5禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验取21日龄的SPF鸡60只，每组15只，第1组～第3组分别经颈部皮下注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗3，免疫剂量为0.6ml，第4组皮下注射0.6ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察3周临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周各解剖5只，观察接种部位是否形成肉眼病变。结果显示(见表3、表4)，疫苗1～疫苗3接种组中未看到临床症状和死亡，此外接种组和对照组的增重率未表现出明显的差异，也未见有肉芽肿形成，表明本发明制备的禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗用于免疫鸡是安全的。表3禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验临床症状和死亡情况表4禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验鸡只体重变化和肉芽肿形成情况实施例6禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，每组10只，第5组～第7组分别经颈部皮下注射注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗3，免疫剂量为0.3ml，第8组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表5。表5禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果结果显示，第8组对照组全部发病死亡，而第5组～第7组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果，免疫效果良好。表明以AGP效价不低于1:2的禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗，即可对鸡群提供有效的免疫保护。实施例7禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗交叉保护试验取21日龄的SPF鸡100只，分成10组，每组10只，第9组～第13组分别经颈部皮下注射免疫实施例4制备的疫苗1，免疫剂量为0.3ml，第14组～第18组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用异型血清型(血清型2、3、5、8、11)病毒液分别通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表6。表6禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗交叉保护试验结果结果显示，第14组～第18组对照组不同程度发病死亡，而第9组～第13组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果，免疫效果良好。表明以AGP效价不低于1:2的禽腺病毒fiber-2蛋白亚单位疫苗，即可对鸡群不同血清型腺病毒攻击提供有效的免疫保护。实施例8鸡新城疫抗原的制备取新城疫病毒株(基因Ⅶ型)，N7a株(NewcastleDiseaseVirus(genotypeⅦ),strainN7a)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-4或10-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为108.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。实施例9禽流感抗原的制备取H9亚型禽流感病毒SZ株(公开于中国专利申请CN103789272A)毒种，用无菌生理盐水稀释至10-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依此再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml(含105EID50)。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活24h，灭活完全后备用。实施例10鸡传染性支气管炎抗原的制备取鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-2或10-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为106.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。实施例11法氏囊抗原的制备1.VP2cDNA制备按病毒RNA提取试剂盒操作从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表7，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。表7法氏囊病毒VP2基因引物VP2-EcoR1-fCCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACVP2-Sal1-rACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT2.pColdⅢ_VP2/E.ColiBL21(DE3)菌株的构建取上述制备的VP2cDNA，进行双酶切，并将酶切后的片段连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为为pColdⅢ_VP2/E.ColiBL21(DE3)菌株。3.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种pColdⅢ_VP2/E.ColiBL21(DE3)菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。培养结束后，离心收集菌体，重悬，超声波破碎，离心收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液。实施例12减蛋综合征抗原的制备将鸡减蛋综合征AV-127株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水比例稀释，尿囊腔接种10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸭胚弃去，此后每6～8小时照蛋1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，取出全部鸭胚，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。实施例13禽腺病毒联合疫苗的制备将实施例3纯化后的禽腺病毒fiber-2蛋白抗原分别和实施例8制备的鸡新城疫抗原、实施例9制备的禽流感抗原、实施例10制备的鸡传染性支气管炎抗原、实施例11制备的传染性法氏囊抗原、实施例12制备的减蛋综合征抗原按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表8、9、10、11。表8禽腺病毒二联疫苗配比表9禽腺病毒三联疫苗配比组分疫苗9疫苗10疫苗11疫苗12fiber-2蛋白(AGP效价)1：41：81：161：2N7a株抗原(EID50/0.1ml)108.0108.0108.0108.0SZ株抗原(EID50/0.1ml)108.0———M41株抗原(EID50/0.1ml)—106.0——VP2蛋白(AGP效价)——1：16—AV-127株抗原(EID50/0.1ml)———107.0白油佐剂(V/V％)66％66％66％66％表10禽腺病毒四联疫苗配比表11禽腺病毒五联疫苗配比组分疫苗18疫苗19fiber-2蛋白(AGP效价)1：81：16N7a株抗原(EID50/0.1ml)108.0108.0SZ株抗原(EID50/0.1ml)108.0108.0M41株抗原(EID50/0.1ml)106.0106.0VP2蛋白(AGP效价)1：16—AV-127株抗原(EID50/0.1ml)—107.0白油佐剂(V/V％)66％66％实施例14禽腺病毒联合疫苗免疫原性试验1.禽腺病毒部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡170只，分成17组，每组10只，第19组～第34组分别经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗4～疫苗19，0.3ml/只；第35组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表12。表12禽腺病毒联合疫苗禽腺病毒部分免疫原性试验结果结果显示，疫苗4～疫苗19免疫组在免疫后21天均能产生较好的免疫保护。表明本发明提供的禽腺病毒fiber-2蛋白，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。2.新城疫病毒部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡130只，分成13组，每组10只，第36组～第47组分别经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗4、疫苗9～疫苗19，20μl/只；第48组皮下注射20μl生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第36组～第47组免疫鸡，连同第48组对照鸡，采血并分离血清。检测新城疫病毒HI抗体，同时用新城疫强毒HN1101株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表13。表13禽腺病毒联合疫苗新城疫病毒部分免疫原性试验结果注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。结果显示，疫苗4、疫苗9～疫苗19免疫组在免疫后21天均能产生较高的新城疫抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明以本发明提供的N7a株新城疫病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。3.禽流感部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡90只，分成9组，每组10只，第49组～第56组分别经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗5、疫苗9、疫苗13、疫苗16～疫苗19，0.3ml/只；第57组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第49组～第56组免疫鸡，连同第57组对照鸡，采血并分离血清。检测H9亚型禽流感HI抗体效价，同时用SZ株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含107.0EID50)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表14。表14禽腺病毒联合疫苗禽流感部分免疫原性试验结果注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。结果显示，疫苗5、疫苗9、疫苗13、疫苗16～疫苗19在免疫后21天均能产生较高的禽流感抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的H9亚型禽流感病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。4.鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第58组～第64组各点眼、滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)。接种后21日，连同第65组对照鸡，采血并分离血清。同时，第58组～第64组各组经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗6、疫苗10、疫苗13、疫苗14、疫苗15、疫苗18、疫苗19，0.3ml/只。接种后28日，连同第65组对照鸡分别采血并分离血清；第58～第64组免疫鸡在活苗首免后21日、灭活苗免后28日两次采集的血清(第65组对照鸡同样时间采集血清)测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价几何平均值不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值不高于1:8(微量法)。同时用鸡传染性支气管炎M41强毒每羽滴鼻攻毒103.0EID50，作攻毒实验。结果见表15。表15禽腺病毒联合疫苗鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验结果结果显示，疫苗6、疫苗10、疫苗13、疫苗14、疫苗15、疫苗18、疫苗19二免血清HI抗体效价几何平均值均不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，攻毒后全部免疫鸡的气管内未分离出病毒，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。5.法氏囊部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第66组～第70组分别经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗16、疫苗18，0.3ml/只；第71组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第66组～第71组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCCAV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表16。表16禽腺病毒联合疫苗法氏囊部分免疫原性试验结果结果显示，疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗16、疫苗18在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。6.减蛋综合征部分免疫原性试验取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第72组～第76组分别经颈部皮下注射免疫实施例13制备的疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19，0.3ml/只；第77组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第72组～第77组采血，测定减蛋综合征HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体效价应≤2log2。结果见表17。表17禽腺病毒联合疫苗减蛋综合征部分免疫原性试验结果注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。结果显示，疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19在免疫后21天均能产生较高的减蛋综合征抗体，可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。证明了本发明提供的禽腺病毒联合疫苗能够抵抗相关病原的侵袭，显示出良好的免疫原性，可有效控制我国禽腺病毒相关疾病的流行。以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。SEQUENCELISTING<110>普莱柯生物工程股份有限公司<120>一种疫苗组合物及其制备方法和应用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1440<212>DNA<213>禽腺病毒<400>1atgctgcgtgctccgaaacgtcgtcactctgaaaacggtcagccggaaactgaagctggt60ccgtctccggctccgatcaaacgtgctaaacgtatggttcgtgcttctcagctggacctg120gtttacccgttcgactacgttgctgacccggttggtggtctgaacccgccgttcctgggt180ggttctggtccgctggttgaccagggtggtcagctgaccctgaacgttaccgacccgatc240atcatcaaaaaccgttctgttgacctggctcacgacccgtctctggacgttaacgctcag300ggtcagctggctgttgctgttgacccggaaggtgctctggacatcaccccggacggtctg360gacgttaaagttgacggtgttaccgttatggttaacgacgactgggaactggctgttaaa420gttgacccgtctggtggtctggactctaccgctggtggtctgggtgtttctgttgacgac480accctgctggttgaccagggtgaactgggtgttcacctgaaccagcagggtccgatcacc540gctgactcttctggtatcgacctggaaatcaacccgaacatgttcaccgttaacacctct600accggttctggtgttctggaactgaacctgaaagctcagggtggtatccaggctggttct660tctggtgttggtgtttctgttgacgaatctctggaaatcgttaacaacaccctggaagtt720aaaccggacccgtctggcccactgaccgtaagcgctaacggtctgggtctgaaatacgac780tctaacaccctggctgttaccgctggtgctctgaccgttgttggtggtggttctgtttct840accccgatcgctaccttcgtttctggttctccgtctctgaacacctacaacgctaccatc900gttaactcttcttctcacccgttctcttgcgcttactacctgcagcagtggaacgttcag960ggtctgctgttcacctctctgtacgttaaactggactctaccaccatgggtacccgtccg1020ggtgacaactcttctgctaacgctaaatggttcaccttctgggtttctgcttacctgcag1080cagtgcaacccgagcggtatccaggcgggtaccgtaagcccgtctaccgctgctctggct1140gacttcgaaccgatggctaaccgttctgtttcttctccgtggacctactctgctaacgct1200tactaccagccgtcttcgggtgagttccaggtcttcaccccggtcgttaccggtgcttgg1260aacccgggtaacatcggtatccgtgttctgccggttccggttaccgcttctggtgaccgt1320tacaccctgctgtgctactctctgcagtgcaccaactcttctatcttcaacccggctaac1380tctggtaccatgatcgttggtccggttctgtactcttgcccggctgcttctgttccgtaa1440当前第1页1 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