水溶性的促凝血药维生素K2固态复合物及其制备方法与流程

本发明属药物技术领域，具体涉及水溶性的促凝血药维生素K₂固态复合物及其制备方法。

背景技术：

维生素K₂(英文名menaquinone)的结构如下：

指的是一族2-甲基-1,4-萘醌的同系物，其第3位为含有4～13个异戊二烯单位的异戊烯侧链所取代，这些称为甲萘醌；后缀(-4)表示侧链上异二烯单位的数目。1934年，丹麦科学家首先发现维生素K，并证实其为脂溶性维生素。天然存在的有维生素K₁、K₂，维生素K₁广泛存在于绿色植物中，是食物中维生素K的重要来源；维生素K₂主要由肠道细菌合成。在动物体内具有生物活性的是维生素K₂，而维生素K₁和维生素K₃都要转化为维生素K₂才能起作用。三种维生素K的形式都在肝中转化成维生素K₂，并和胃肠微生物合成的维生素K₂一起被吸收利用。维生素K缺乏可引起这些凝血因子合成障碍或异常，临床可见出血倾向和凝血酶原时间延长。维生素K与血液凝固密切相关，缺乏时，可引起肝脏对多种凝血因子的合成障碍，引起机体凝血时间延长和出血倾向，及时补充维生素K可使凝血功能恢复。

维生素K₂具有多种功能，如：(1)治疗和预防骨质疏松症。维生素K₂生成骨蛋白质，再与钙共同生成骨质，增加骨密度，防止骨折。(2)预防肝硬化进展为肝癌。(3)治疗维生素K₂缺乏性出血症，如新生儿出血。维生素K₂促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间。(4)具有利尿、强化肝脏的解毒功能，并能降低血压。此外，维生素K₂还能选择性地诱导白血病细胞凋亡，对志愿者正常骨髓细胞只有微弱的抑制作用。(J.J.Dink,S.M.Planchon,C.Tagliarino.J.Biol.Chem.2000,275,5416.；M.Ynguchi,K.Miyazawa,M.Otawa.Leukemia.1998,12,1392.)

由此可见，维生素K₂具有较大的医用价值，因此自上市以来对其的研究方兴未艾，但其应用存在着明显的制肘：维生素K₂为油状物，几乎不溶于水(溶解度为0.054mg/mL)；维生素K₂注射液收载于《中国药典2000年版二部》中，所用增溶剂为吐温一80，由于吐温一80是聚氧乙烯失水山梨醇单油酸醋，该物质具有溶血作用，并且容易发生氧化，氧化产物会造成过敏；所制成的注射液在低温放置易发生浑浊，常温下难以恢复，需要加热，才能重新溶解；由于吐温一80中的聚氧乙烯以醚键方式与失水山梨醇结合，体内降解缓慢，抗凝血作用也缓慢，不利于应急治疗。这些特点限制了维生素K₂在临床上的使用。环糊精(Cyclodextrins,Cycloamyloses,通常简称为CD),是一类由D型吡喃葡萄糖单元以1,4苷键首尾相连的截锥状大环分子，具有疏水的空腔和亲水性的表面。因此，环糊精可选择性键合各种有机、无机以及生物分子形成超分子固态复合物。环糊精习惯上用一个希腊字母表示其葡萄糖单元数目，其中最常见的是α-、β-、γ-环糊精，分别拥有6、7和8个葡萄糖单元。含7个葡萄糖单元的β-环糊精可通过淀粉的酶促降解大量制备，价格低廉，而且性质稳定，无毒害。这些特性使其广泛应用于脂溶性药物载体、食品添加剂、化妆品填料等各个领域(刘育，尤长城，张衡益，《超分子化学-合成受体的分子识别与组装》，南开大学出版社，2001年)。使用环糊精作为母体构筑功能分子，可对药物分子的包结作用创造良好的条件(K.Uekama,F.Hirayama,T.Irie,Chem.Rev.1998,98,2045.)。很多研究表明，天然环糊精对药物分子的包结配位作用一般比较微弱，修饰环糊精在大部分情况下可以提高环糊精主体对客体分子的键合稳定常数。如Koizumi教授报道了维生素K₂与Glucosy1-β-环糊精在水溶液中通过1:1～1:3复合。加入Glucosy1-β-环糊精后，维生素K₂在水溶液中对光和热的稳定性都显著增强(Y.Okada,M.Tachibana,K.Koizumi,Chem.Pharm.Bull.1990,38,2047.)。遗憾的是，目前用修饰β-环糊精包结维生素K₂分子的固态复合物研究未见报道，尽管固态复合物具有便于携带、运输和贮存，稳定性好，制剂时不需要加入防腐剂的优点。

单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精是一种低毒性且水溶性极高的药物载体，其合成方法为已有技术(例如可见：I.Tabushi,N.Shimizu,T.Sugimoto,M.Shiozuka,K.Yamamura,J.Am.Chem.Soc.1977,99,7100；I.Tabushi,N.Shimizu,Jpn.Kodai Tokkyo Koho 78 102 985,1978[Chem.Abstr.,1979,90,39196b])。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种水溶性的促凝血药维生素K₂固态复合物及其制备方法。

本发明水溶性的促凝血药维生素K₂固态复合物是单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的固态复合物，单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的复合比为2:1。

本发明单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的固态复合物的制备方法如下：

1)将维生素K₂溶入丙酮中，再将维生素K₂丙酮溶液加入单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精水溶液中，搅拌，将溶液密封，35-40℃下搅拌4～6天；

2)蒸发除去溶剂丙酮，抽滤除去未参与包结的维生素K₂，将所得的滤液蒸干，即得棕红色的晶体，真空干燥，可得单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精和维生素K₂(20)固态复合物。

优化的制备方法如下：

1)室温下将2.9～3.1份重量的单-(6-氧-6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精加入到28～32份重量的的蒸馏提纯后的二乙烯三胺中，氮气保护下搅拌至溶解后升温到74～76℃反应7.8～8.2小时，然后减压蒸馏掉不少于50％的二乙烯三胺，把剩余的液体加入到4.8～5.2倍体积的丙酮中，抽滤收集沉淀，重复次操作3～4次，再把丙酮换成无水乙醇进行此操作一次，得粗产物。

2)将上面所得的粗产物溶于水，使用Sephadex G-25凝胶柱分离，以二次蒸馏水为洗脱剂，得到单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精。

3)将1份重量的维生素K₂放入153～166份重量的丙酮中使其溶解，再将该维生素K₂丙酮溶液加入单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精370～380份重量的水溶液中，搅拌，将溶液密封，35-40℃下搅拌4.5～5.5天，维生素K₂与单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的重量比为1:5.4～5.6，最佳为1:5.5。

4)蒸发除去溶剂丙酮，抽滤除去未参与包结的维生素K₂，将所得的滤液蒸干，即得棕红色的晶体，真空干燥，可得单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精和维生素K₂固态复合物。

本发明方法所得固体产物经过氢谱(¹H NMR)、扫描电子显微镜(SEM)、X射线粉末衍射(XRD)、热重-差热分析(TG-TDA)、红外光谱(IR)等手段证明。

本发明的有益效果：单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精作为一种低毒性且易溶于水的药物载体，在对促凝血药物维生素K₂包结后，大大提高了该药物在水中的溶解度。本发明采用超分子方法制备并分离得到单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的固态复合物，溶解度从原有0.054mg/mL提高到5.8mg/mL，增溶110倍。所得固态复合物可以作为维生素K₂的替代品应用于临床，为维生素K₂的临床试用提供了新的水溶性缓释固态复合物。

附图说明

图1为实施例中单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂固态复合物的¹H NMR谱图。

图2为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的扫描电子显微镜照片。

图3为实施例维生素K₂的扫描电子显微镜照片。

图4为实施例固态复合物的扫描电子显微镜照片。

图5为实施例维生素K₂的X射线粉末衍射图。

图6为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的X射线粉末衍射图。

图7为实施例固态复合物的X射线粉末衍射图。

图8为实施例维生素K₂的热重-差热分析联用图。

图9为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的热重-差热分析联用图。

图10为实施例固态复合物的热重-差热分析联用图。

图11为实施例维生素K₂的红外光谱图。

图12为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的红外光谱图。

图13为实施例固态复合物的红外光谱图。

图14为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的合成路线图。

图15为实施例通过Job实验确定VK₂与单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的复合比。

具体实施方式

实施例

所涉及的单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精和维生素K₂固态复合物按下述方法合成：

1)单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精2的合成单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的合成路线见图14(按照文献合成，I.Tabushi,N.Shimizu,T.Sugimoto,M.Shiozuka,K.Yamamura,J.Am.Chem.Soc.1977,99,7100；I.Tabushi,N.Shimizu,Jpn.Kodai Tokkyo Koho78 102 985,1978[Chem.Abstr.,1979,90,39196b])。

在100mL干燥圆底烧瓶中先加入蒸馏提纯过的二乙烯三胺40mL，搅拌中加入单-(6-氧-6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精5.0g，氮气保护，溶解后升温至76℃左右反应7小时，然后减压蒸馏掉大部分二乙烯三胺，把剩余的液体加入到丙酮中，抽滤收集沉淀，重复次操作一次，在把丙酮换成无水乙醇进行次操作一次，得粗产物。将上面所得的产品溶于水，使用Sephadex G-25凝胶柱分离，以二次蒸馏水为洗脱剂，得到单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精(2)。最后产率为31％。化合物2的¹H NMR表征数据为：¹H NMR(D₂O，TMS，ppm)δ2.70-2.9 0(m，8H)，δ3.50-4.00(m，42H)，δ3.05-3.10(m，4H)，5.10(s，7H)。

2)将34.0mg(约0.03mmol)单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精溶于9mL二次蒸馏水中，将40.0mg(约0.09mmol)维生素K₂溶于少量丙酮中，35-40℃下搅拌5天，旋转蒸发除去反应液中的丙酮，过滤除去没反应的维生素K₂，再减压蒸干滤液，得粉红色固体粉，真空干燥后可得单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的固态复合物，产率51.7％。¹H NMR(500MHz,D₂O,TMS):δ0.98-3.20(s和m,>35H,VK₂(20)侧链上的部分H及3边臂上的H)，3.30-4.00(m，>80H,3的H-2～6以及VK₂(20)侧链上亚甲基氢)，4.48-5.10，(t,18H,3的H-1和VK₂(20)侧链上的四个双键H)，7.10-7.80(m,4H,苯环上的H)。

单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂固态复合物的复合比通过JOB曲线确定。

采用UV-Vis，通过Job实验确定单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与VK₂的包结配位的计量比。从图15可看出，曲线在摩尔分数在0.33处有最大值，说明单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与客体VK₂形成的固态复合物的复合比为2:1。

3)单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精与维生素K₂的固态复合物的表征该固态复合物可通过以下方法表征：

¹H NMR(瑞士Bruker DRX-500核磁共振氢谱仪)

此固态复合物的¹H NMR谱图如图1所示，由图可知，化学位移为7-8ppm处质子峰可归属于维生素K₂苯环上的4个氢原子；且由于维生素K₂极低的溶解度，它自身并不能在D₂O溶剂中得到¹H NMR谱图。

扫描电子显微镜(荷兰Philips XL30ESEM-TPM扫描电子显微镜)

由图2和图3可知：单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精(图2)和维生素K₂(图3)的表面形态信息。形成固态复合物后，维生素K₂由原来的片层结晶状变为表面密实的大块状结构(图4)，且表面有年轮状裂纹；单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的表面形貌也发生了明显改变。由图2-4可见，三种物质的结构形态完全不同，表明所得的固态复合物固体粉末并非1和2的简单混合，而是环糊精2对维生素K₂键合生成的固态复合物。

X-射线粉末衍射(德国D8ADVANCE X-射线粉末衍射仪)

图5、图6和图7分别为维生素K₂、单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精和本发明所得的固态复合物的X-射线粉末衍射图。众所周知，两种物质的简单物理混合物的X-射线粉末衍射仅是两物质衍射峰的简单叠加。而固态复合物并非如此：可观察到维生素K₂存在14-19^O(2θ)区域的峰，固态复合物的基本消失，而在11-12^O(2θ)区域出现了一个强度较大的尖峰，这可归因于维生素K₂被包结后形态的改变。这些也说明环糊精空腔对维生素K₂的包结作用。

热重-差热(TG-DTA)分析联用(高温差热分析仪CRY-2P)

为了比较维生素K₂(称为化合物1)、单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精(称为化合物2)和本发明所得的固态复合物的热稳定性，我们对它们进行了热重和差热分析研究：化合物1(图8)的分解温度在250℃附近，化合物2(图9)和固态复合物(图10)的分解温度分别在260℃左右；而化合物1、2和固态复合物在250℃到500℃之间的失重率分别是92％、65％和66％说明了包合物的形成，同时维生素K₂被包合后热稳定性有所提高。

红外光谱(德国Bruker FL-IR红外光谱仪)

图11为实施例维生素K₂的红外光谱图。图12为实施例单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精的红外光谱图。图13为实施例固态复合物的红外光谱图。

化合物1、2和固态复合物的红外光谱图分别如图11-13所示。单-[6-(二乙烯三胺基)-6-脱氧]-β-环糊精2的红外光谱(图12)在3300-3500cm^-1以及2800-3000cm^-1区域内的特征吸收可分别归属于参与形成氢键的羟基以及-CH和-CH₂基团的振动。维生素K₂的谱图(图11)在2800-3020，1650-1700和1280-1300cm^-1三个区域表现出很强的吸收带。从对应的三张谱图的比较可以看出，包合物的谱图不是主-客体的谱图的简单加和。维生素K₂的谱图中的特征峰在固态复合物(图13)中部分消失，部分强度减弱并伴随微小位移，说明包合物已形成。

溶解度

制备维生素K₂固态复合物的目的之一就是提高其在水中的溶解度。将一定量的维生素K₂和固态复合物分别溶于5mL水中，超声振荡一段时间至不再有固体溶解，过滤，将所得固体干燥称重，可大约得知维生素K₂和本固态复合物的溶解度值。结果是维生素K₂固态复合物将维生素K₂几乎为零的水溶性，提高到5.8mg/mL。