本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种能够提高细胞自噬能力、清除自由基的石榴果皮提取物及复合物。
背景技术：
：皮肤是外在压力的恒定目标。事实上，由于皮肤会被其自身可改变的成分影响，如胞质蛋白和大分子等，这些解毒系统总会失效，且由于其逐渐积累，会出现过早疲劳和老化的迹象，化妆品行业一直很关注自身解毒系统。自由基对人体的伤害不可小觑。由于自由基含未配对的电子，所以极不稳定，因此它会从邻近的分子(包括脂肪、蛋白质和dna)上夺取电子，让自己处于稳定的状态。这样一来，邻近的分子又变成一个新的自由基，然后再去夺取电子。如此连锁反应的结果，让细胞的结构受到破坏，造成细胞功能丧失、基因突变、甚至死亡，因此研究如何抵御自由基的伤害是日化企业的一个重点研究方向。自噬是一个空泡的自我消化的过程，通过溶酶体消化存在时间长的蛋白和受损的细胞器，产生对细胞和机体可利用的一些小分子物质，如氨基酸等。轻链3(lc3)可以作为自噬标记物，最初被鉴定为微管相关蛋白1a和1b的亚基(称为map1lc3)，并且随后发现其与酵母蛋白apg8/aut7/cvt5有相似性。有三种人类同工型的lc3，lc3i，lc3ii和lc3iii在自噬期间进行翻译后修改。lc3在合成后立即在羧基末端裂解，得到胞质形式lc3i。在自噬期间，通过涉及apg7和apg3的泛素样系统通过脂质化使lc3i转化为lc3ii，其允许lc3与自噬小泡结合。因此，lc3存在于自噬体中，且lc3ii以较低迁移形式转化可以用作自噬的指示物。自噬机制能确保适当的细胞功能和机体机制，延缓组织衰老和保持皮肤的整体平衡。黑色素在表皮中决定了与种族皮肤多样性相关的肤色的变化。来源于高加索人皮肤的角质形成细胞显示比那些来自非洲裔美国人皮肤更高的自噬活性，且随着更高的自噬活动，来源于白种人皮肤的角质形成细胞对黑素体更敏感，表现增强的自噬活性。溶酶体抑制剂或与自噬相关的特异性小干扰rna会加速角质形成细胞中黑素瘤的积累。通过提高角质细胞自噬作用，可以促进其对黑色素的吞噬作用，从而达到美白的作用。因此，自噬通过调节角质形成细胞中的黑素体降解在确定皮肤颜色中具有关键作用。因此，研究如何提高细胞的自噬能力，对于提高细胞对有毒物质的清除力、延缓皮肤衰老和皮肤美白具有重要意义。石榴(学名：punicagranatuml.)是一种落叶乔木或灌木。单叶，通常对生或簇生，无托叶；花顶生或近顶生，单生或几朵簇生或组成聚伞花序，近钟形，裂片5-9，花瓣5-9，多皱褶，覆瓦状排列；胚珠多数。浆果球形，顶端有宿存花萼裂片，果皮厚；种子多数，浆果近球形，果熟期9-10月。石榴的外种皮肉质半透明，多汁；内种皮革质。石榴果实如一颗颗红色的宝石，果粒酸甜可口多汁，营养价值高，含糖类、优质蛋白质、易吸收脂肪等，可补充人体能量和热量，但不增加身体负担。石榴含有多种营养成分：含碳水化合物17％、水份79％、糖13-17％，而脂肪、蛋白质的含量较少，果实中所含的维生素c及b族维生素、有机酸、糖类、蛋白质、脂肪及钙、磷、钾等矿物质，能够补充人体所缺失的微量元素和营养成分，所含的各种酸类，如叶酸等对人体有保健功效。石榴不仅果实营养成分丰富，而且果皮和果实核都非常有利用价值。石榴具有多种功效：①《分类草药性》：治吐血，月经不调，红崩白带。汤火伤，研末，香油调涂。②《福建民间草药》：治齿痛，水煎代茶常服。③《野生药植图说》：治中耳发炎，防止流脓。也有报道，将石榴提取物用在化妆品中，作为保湿或美白的活性成分；因活性成分未能有效提取和分离，通常这种石榴提取物在化妆品中的用量比较高，可能对皮肤产生刺激。因此，需要对现有技术加以改进，有效提取石榴中的活性成分，开发石榴提取物更多的护肤功效。技术实现要素：本发明旨在提供一种石榴果皮提取物、含有石榴果皮提取物的复合物。本发明还将上述石榴果皮提取物及复合物用作皮肤外用剂中清除自由基、提高细胞自噬能力、美白及抗衰老的活性成分。本发明的技术方案为：一种含石榴果皮提取物的复合物，包括石榴果皮提取物以及冰川水；石榴果皮提取物与冰川水的比例为2～100g/l，优选为8～80g/l；更优选为12～60g/l。优选的，石榴果皮提取物使用产自四川丹巴的石榴果皮作为原料。所述的石榴果皮提取物通过以下方法制备：(1)将石榴果皮用50％～75％乙醇溶液回流提取1～3次，每次1～3小时；(2)取滤液浓缩，醇沉；(3)取滤液浓缩至浸膏或干粉，再加入水稀释，用大孔吸附树脂富集；依次用水和70％～80％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱部位，浓缩干燥。优选的，石榴果皮提取物的制备方法包括以下步骤：(1)干燥粉碎的石榴果皮粗粉用50％～75％体积浓度乙醇溶液回流提取1～3次，每次1～3小时；石榴果皮与乙醇溶液的固液比为1kg：2～20l；(2)合并滤液浓缩(可采用减压浓缩)至1/5～4/5体积，再加入浓缩液2～6倍体积的80％～95％乙醇溶液(体积浓度)，醇沉8～24小时；(3)取滤液浓缩(可采用减压浓缩)至浸膏或干粉，再加入水稀释至原料(石榴果皮)投料量2～8倍，用大孔吸附树脂富集；依次用水和70％～80％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱部位，浓缩干燥。优选的，步骤(1)中，将石榴果皮干燥至含水量低于10％(更优选为低于5％)，粉碎成粒径25～200目的粗粉。优选的，步骤(1)中，用60％～70％体积浓度乙醇溶液回流提取。优选的，步骤(1)中，在60～85℃下回流提取。优选的，步骤(3)中，所述的大孔树脂为ab-8树脂或d101树脂。优选的，步骤(3)中，水以及乙醇溶液的用量分别为1～5bv，优选为1.5～3bv；优选的，用72％～78％乙醇溶液洗脱。更优选的，用75％乙醇溶液洗脱。优选的，步骤(3)中，在-50～-30℃下冷冻干燥。优选的，所述冰川水的ph值为7.1～7.9，其中的氘含量为130-140ppm，且所述冰川水中不含溴酸盐。优选的，ph值为7.2～7.6，更优选为7.4。更优选的，所述冰川水含有下述组分：sr2+0.2～0.5mg/l、k+0.5～10.0mg/l、na+1.0～5.0mg/l、ca2+14.0～30.0mg/l以及mg2+2.0～10.0mg/l；所述冰川水中的溶解性总固体含量为60～150mg/l。上述含石榴果皮提取物的复合物具有清除自由基的能力和提高细胞自噬能力，达到增强肌肤抗氧化能力、清除皮肤代谢废物从而延缓衰老和美白的功效，可作为功效添加剂加入化妆品中使用。上述含石榴果皮提取物的复合物(石榴精粹复合物)在含量为0.001wt％时即具有显著的清除自由基的功效；含量为0.0001wt％时，即可以提高细胞的自噬能力。因此，这种含石榴果皮提取物的复合物可以用作皮肤外用剂中美白的活性成分、清除自由基的活性成分、提高细胞自噬能力的活性成分或抗衰老的活性成分。上述含石榴果皮提取物的复合物可用于制备具有美白功能、清除自由基功能、提高细胞自噬能力、延缓衰老(抗衰老)功效的皮肤外用剂。优选的，上述皮肤外用剂为化妆品。所述的皮肤外用剂可以是化妆水、精华液、乳液、乳霜等。在皮肤外用剂中，含石榴果皮提取物的复合物的添加量为0.0001wt％～90wt％。作为皮肤外用剂中清除自由基的活性成分时，复合物添加量为0.001wt％～90wt％。作为皮肤外用剂中提高细胞自噬能力的活性成分时，复合物可提高lc3ii表达量。本发明所提供的含石榴果皮提取物的复合物(石榴精粹复合物)提取制备工艺方便，而且具有良好的清除自由基功能，可有效提高细胞的自噬能力，达到增强肌肤抗氧化能力、清除皮肤代谢废物从而延缓衰老和美白的功效，可作为功效添加剂加入化妆品中使用。复合物的活性高，在含量极低的情况下即可发挥效果，不刺激皮肤，天然、安全且有效，可用于制备具有清除自由基功能、提高细胞自噬能力、延缓衰老功效的皮肤外用剂尤其是化妆品。附图说明图1为实施例3中石榴果皮提取物复合物清除dpph效率结果图2为实施例4中石榴果皮提取物复合物影响细胞活性的实验结果图3为实施例5中石榴果皮提取物复合物影响lc3ii蛋白免疫荧光表达的结果具体实施方式以下通过具体实施例对本发明加以说明，但并不因此限制本发明的保护范围。未注明具体操作方法和条件的实验方法，按照常规的操作方法和实验条件，或者商品说明书进行选择。实施例1石榴果皮提取物的生产取四川丹巴产的石榴果皮，干燥至含水量低于5％，并粉碎成粒径25～200目的粗粉。取1kg上述粗粉用乙醇溶液回流提取两次：加入8l65％(v/v)乙醇，在65～75℃下回流提取2小时；过滤后取固体再加入8l65％乙醇，继续回流提取1.5小时。用滤布过滤残渣，合并滤液，减压浓缩至1/3体积。加入4倍体积85％的乙醇，醇沉过夜(12小时)，第二天使用滤纸进行过滤,取滤液，继续通过减压浓缩的方式进行浓缩,得到浸膏。加水将浸膏稀释到5l，用ab-8大孔树脂上样吸附富集，先用水洗脱(2bv),再用75％的乙醇洗脱(2bv)。收集醇洗脱段，通过减压浓缩的方式再次浓缩为浸膏，使用冷冻干燥机于-40℃冻干30min，最后将产品于粉碎机粉碎，过80目筛即得石榴果皮提取物。实施例2制备含石榴果皮提取物的复合物取实施例1的石榴果皮提取物0.18g溶解于10ml蒸馏水。取10μl上述溶液，与10μl冰川水混合，再稀释到10ml，即得到浓度0.10％的含石榴果皮提取物的复合物(石榴精粹复合物)溶液；其中石榴果皮提取物与冰川水的比例为18g/l。再次稀释，使石榴精粹复合物的浓度最终为0.001％和0.0001％，用于后续实验。所使用的冰川水取自喜马拉雅山的多吉曲登尼玛泉(海拔5128米)，冰川水中的氘含量为134ppm，ph＝7.4，不含溴酸盐，含有下述组分：sr2+0.2～0.5mg/l、k+0.5～10.0mg/l、na+1.0～5.0mg/l、ca2+14.0～30.0mg/l以及mg2+2.0～10.0mg/l；并且冰川水中的溶解性总固体含量为60～150mg/l。实施例3石榴精粹复合物清除自由基的实验1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，dpph)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，约在517nm左右有强吸收，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使dpph吸收减弱。dpph乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈定量关系，借此可评价抗氧化剂清除自由基能力或抗氧化能力大小。dpph乙醇溶液的配制：准确称量6mgdpph，用95％乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，超声辅助溶解。使用时再用95％乙醇稀释四倍，得到浓度为3mg/100ml，避光保存(0～4℃)；待测样品预处理：将水溶性样品原液用蒸馏水稀释到适合的浓度备用。实验步骤：将待测样品溶液2ml加入试管中，之后加入2mldpph乙醇溶液，混匀。室温下避光在黑暗处反应30min，在525nm处测定吸光度；除样品组外，分别设样品溶剂对照组，空白对照组和溶剂对照组(dpph的溶剂)；以vc(1.5ug/ml)为清除dpph自由基实验的阳性对照。在清除自由基的试验中，设样品组吸光值为t，样品溶剂对照组吸光值为t0，空白对照组吸光值为c，溶剂对照组吸光值为c0；清除率i(％)＝[1-(t-t0)/(c-c0)]×100％按照上面公式计算清除率，清除率越大抗氧化能力越强，通常清除率≥10％，认为具有抗氧化作用。结果如表2和图1所示，此石榴提取物在浓度为0.001％时具有清除dpph自由基的功效，且效果明显，清除率达52％，具有明显的抗氧化作用。表2dpph自由基清除效率(％)样品名终浓度清除率(％)vc(阳性对照)1.5ug/ml42石榴精粹复合物0.001％52石榴精粹复合物0.0001％4实施例4细胞毒性测试由于角质细胞主要位于皮肤表皮层，其生长代谢状况是反应皮肤状态的重要代表，因此为了验证石榴果皮提取物的对提高细胞自噬的功效，我们从样品处理后的角质细胞的细胞活性及细胞内自噬相关的lc3ii蛋白的表达量两个方面进行分析。首先进行细胞毒性测试。一、细胞培养及加样处理细胞培养：采用完全培养基，在37℃的5％co2细胞培养箱培养人角质细胞，至90％铺板率时，消化后种在细胞爬片和96孔板上，设置对照，正常培养4天后加入不同浓度的石榴精粹复合物进行培养，再培养2天后进行后续试验。细胞与混合物共培养2天后，移除培养基，加入mtt0.5mg/ml，3小时后小心吸去上清，加入二甲亚砜(dmso)，于550nm下进行检测；以未处理的作为参照，定义样品孔为t，未处理孔为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为无细胞毒性，比值＜90％视为有细胞毒性。二、实验结果石榴精粹复合物在浓度为0.001％和0.0001％时不会对细胞造成细胞毒性。表3细胞活性样品细胞活性(％)cv未处理100±11.18％石榴精粹复合物0.0001％102.02±5.19％石榴精粹复合物物0.001％95.08±15.51％检测结果如表3和图2所示。与对照未处理(nt)相比，石榴精粹复合物在终浓度为0.001％和0.0001％时没有细胞毒性，因此该石榴提取混合物不会对细胞造成伤害，可使用该浓度继续进行后续实验。实施例5lc3ii的荧光表达如果添加石榴精粹复合物后，角质细胞的细胞活性没有受到伤害，可认为其不会对细胞的正常生长造成损伤，即可进行后续实验。可通过免疫荧光染色的方式检测角质细胞内的lc3ii蛋白的荧光表达量，如果相对于未添加石榴果皮混合物的对照组其表达量上升，即可反映石榴果皮提取物对提高细胞的自噬能力具有作用。细胞培养方法同上，通过石榴精粹复合物处理2天后，吸去培养基，用2ml的pbs清洗细胞爬片2次，每次5min；用冰甲醇于4℃固定10min，再用pbs清洗两次，每次5min。加入0.5％tritonx-100处理15min；再用pbs清洗2次，每次5min；加入lc3ii抗体100μl，于4℃避光过夜。第二天用pbs清洗3次，每次5min；加入荧光染剂和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)于室温下处理1h，用pbs清洗两次后即可封片观察。在测定荧光表达的试验中，如果相对于未添加提取物的细胞组，lc3ii的荧光表达量明显升高，可推断石榴精粹复合物可以诱导自噬相关的lc3ii的表达，提高细胞的自噬能力。结果如图3和表4所示。表4lc3ii荧光表达样品细胞荧光强度(％)未处理100石榴精粹复合物0.0001％114石榴精粹复合物物0.001％132由图3和表4可知，lc3ii在角质细胞内的免疫荧光表达量随着石榴果皮提取物的浓度的上升而上调，且高于对照未处理的细胞组，由此可见，含石榴果皮提取物的复合物对提高细胞的自噬能力具有一定作用，进而可达到清除皮肤的代谢废物和延缓衰老的功效，同时对皮肤美白也具有一定功效。以上为本发明较佳实施例，用于说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项目技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12