本pct申请要求来自2015年12月15日在印度提交的印度临时专利申请第6498/che/2015号的优先权。
发明领域
本发明涉及结构式viii的新颖的胞壁酰二肽(mdp)衍生物化合物。
本发明还涉及用于制备这些新颖的化合物的工艺和用于制备这些新颖的化合物的新颖的中间体。本发明的新颖的化合物具有用于用作疫苗制剂中的佐剂的高度潜在的免疫调节性质。本发明还涉及这些新颖的化合物作为与疫苗抗原一起使用的佐剂的用途和在制备疫苗制剂中的用途。
发明背景
胞壁酰二肽(mdp，n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺)是由附接至l-ala-d-isogln的短氨基酸链的n-乙酰胞壁酸组成的合成的免疫反应性肽。它首先在细菌细胞壁肽聚糖中被确定为弗氏完全佐剂(fca)中的活性组分。在1974年，发现mdp是fca的效力所需的最小结构，fca是动物实验模型中最有效的和最广泛使用的佐剂中的一种。胞壁酰二肽由于其免疫调节性质而被熟知。胞壁酰二肽是细菌细胞壁的最小的生物活性组分。胞壁酰二肽衍生物已经被证明经由prr(模式识别受体(patternrecognitionreceptor))、核苷酸结合寡聚结构域2(nucleotide-bindingoligomerizationdomain2)(nod2)受体中的一种示出明显的免疫调节性质(girardins.等人，2003.jbiolchem.278(11):8869-72；f.coulombe等人，2012plosone,7(5):articleide36734)。胞壁酰二肽活化免疫系统的巨噬细胞和其他细胞以灭杀癌细胞(i.jakopin,2013.currentmedicinalchemistry,20(16):2068–2079；ogawa等人，2011.currbioactcompd.7(3):180-197)，然而，胞壁酰二肽还被报告在本质上是热原性的。为了降低它的热原效应，迄今为止以增加特定功能同时抑制热原性(pyrogenicity)为目的，已经设计、合成并测试了一系列mdp衍生物。存在与胞壁酰二肽及其衍生物的合成相关的许多已报道的发明或出版物(namba等人，1997.vaccine,15(4):405-13；wo1996001645；us4395399；us7173107b2)。
n-羟乙酰基胞壁酰二肽(n-glycolylmuramyldipeptide)gmdp(n-羟乙酰基葡萄糖胺基-n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺)是胞壁酰二肽衍生物的实例中的一个，其最初在20世纪70年代在莫斯科的shemyakin生物有机化学研究所(shemyakininstituteforbio-organicchemistry)被开发。gmdp已经被示出刺激先天性免疫应答和适应性免疫应答两者。gmdp还活化巨噬细胞并释放细胞因子和集落刺激因子(csf)，该细胞因子和集落刺激因子进而刺激造血细胞的分化以清除感染(australasianbiotechnology，第6卷第4期，1996年7月/8月，第223-229页)。相比于mdp，gmdp已经被示出具有较高的免疫佐剂活性和较小的热原效应。因此，mdp的若干其他n-酰基衍生物相对于mdp是更有免疫治疗性的(andronovat.m.等人，1991.review.immunology4,1)。因此，此分子已被广泛用于免疫治疗方法中，特别是用于治疗慢性感染、自身免疫疾病和癌症(l.i.rostovtseva等人，1981.russianjournalofbioorganicchemistry,7(12):1843–1858)。
基于mdp的化合物likopidtm是被引入临床实践的胞壁酰糖肽类型的第一种免疫治疗剂。likopidtm是被俄罗斯公司peptek开发并注册作为具有广泛适用性的免疫治疗剂，例如免疫刺激以及预防创伤后、手术后、化学治疗后和放射治疗后患病状态并发的感染。其他领域是感染性疾病如结核病、人类宫颈乳头瘤病毒(humancervicalpapilomavirus)、眼部疱疹感染(ophthalmicherpeticinfection)、银屑病的治疗以及溃疡和发炎过程的治疗(wo2007045192)。
下文示出的通式-x的结构表示化合物mdp的化学结构。
式-x：mdp的结构表示
存在与胞壁酰肽化合物及其衍生物相关的许多发明。尽管它们作为治疗剂的用途是已知的，但是到目前为止，使用mdp衍生物作为疫苗制剂中的佐剂尚未被文献证明或发现。
wo1996001645a1涉及胞壁酰肽化合物，特别是n-乙酰基-d-葡萄糖胺基-(β1-4)-n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(mdp)用于治疗炎症性皮肤病学状况例如银屑病的用途以及在治疗皮肤和粘膜的免疫相关疾病中的用途。
us7173107b2公开了糖肽及其制备，所述制备是使用所描述的三重正交保护方案(triplyorthogonalprotectionscheme)的糖肽的立体定向合成，特别是n-乙酰基葡萄糖胺基-β-[1,4]-n-乙酰基胞壁酰单肽及其衍生物的合成。糖肽可用于制备mdp以及具有葡萄糖胺基-β-[1,4]-n-乙酰基胞壁酸二糖芯的相关化合物。
wo2007045192涉及葡萄糖胺基胞壁酸(2-氨基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-n-乙酰基胞壁酸)衍生物、其合成方法以及其用于合成葡萄糖胺基胞壁酰糖肽即胞壁酰糖肽的二糖类似物的用途。us4395399公开了不同的糖肽及其制备。
然而，尽管在若干新开发的mdp衍生物中看出改进，但是仍然存在对于在疫苗制剂中的用于治疗用途或预防用途的目的的具有进一步降低的副作用和增加的佐剂活性的化合物的持续的需求。因此，在设计或合成新的化合物时，聚焦于效力和副作用之间的平衡是重要的。存在对于开发将降低与已知的mdp衍生物相关的副作用的更有效的且改进的mdp衍生物的需求。本发明描述了具有降低的热原性、同时保持作为疫苗佐剂的相当有效的功能的新颖的mdp衍生物。在本专利申请中，本发明人已经开发并从而公开了以前未知的新的mdp衍生物。
发明目的
本发明的主要目的是提供新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物。
本发明的另一个目的是提供用于制备新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物的工艺。
本发明的另一个目的是提供用于合成新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物的新颖的中间体化合物。
本发明的另外的目的是提供新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物作为用于药物制品和疫苗制剂的佐剂的安全用途。
又另外的目的是提供包含新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物的疫苗制剂。
发明概述
因此，本发明公开了具有降低的热原性、同时保持作为疫苗佐剂的相当有效的功能的结构式-viii的新颖的mdp衍生物化合物。
在一个方面中，本发明提供了如下文通式-viii中示出的新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物：
其中，r1或r2选自由以下组成的组：氢、具有或不具有杂原子如氧
原子的烷基(具有直链和支链两者)；芳基、苯基、被取代的苯基、杂
芳基、芳基烷基、多核芳族化合物如萘基、蒽基和菲咯啉基。
在一个优选的实施方案中，当r1＝r2＝氢(h)时，式-viii的化合物是在结构上如以下显示的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)：
[式-viii，当r1＝r2＝h时]
在另一个方面中，本发明提供了用于合成式-viii的新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物的工艺，所述工艺包括如在方案-a和方案-b中示出的反应步骤。
在本发明的另外的方面中，本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物被评估其活性。本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物的安全性通过细胞毒性测定和热原性测定来确定。
在另一个方面中，本发明提供了新颖的胞壁酰二肽衍生物(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸作为待用于药物制品和疫苗制剂中的佐剂的用途。
此外，在本发明的另外的实施方案中，当用作与多种疫苗抗原一起使用的佐剂时，本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物的体内免疫原性被示出为实现抗体效价的至少4倍增加，从而能够产生体液免疫应答和细胞介导的免疫应答两者。
在一般性实施方案中，本发明提供了胞壁酰二肽衍生物化合物-viii：
其中r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
典型的杂原子包括氧(o)、氮(n)、硫(s)等或类似杂原子。多核芳族化合物基团包括萘基、蒽基和菲咯啉基或类似基团。
在一个实施方案中，化合物是在结构上如以下结构中示出的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)。
化合物mdp-mn通过以下来表征：ir(以cm-1计的n)：3305,2941,1653,1533,1448,1251,1036。化合物mdp-mn还通过以下来表征：1h-nmr(300mhz,dmso-d6)：δ5.13(m,2h),4.98(m,1h),4.38(m,1h),4.23(m,1h),4.11(m,1h),2.36-2.10(m,2h),2.08-1.90(m,1h),1.77(m,1h),1.34(d,j＝6.504,3h),1.23(d,j＝6.201,3h)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备式-viii的胞壁酰二肽衍生物化合物的工艺
所述工艺包括以下步骤：
a.使式-i的化合物异头苄基化(anomericbenzylation)以获得式-ii的化合物；
b.对式-ii的化合物进行亚苄基保护以获得式-iii的化合物；
c.使式-iii的化合物脱酰基以获得式-iv的化合物；
d.在溶剂的存在下，用合适的有机酰化剂使式-iv的化合物再酰化，以获得式-v的化合物；
e.通过在溶剂的存在下用l-2-氯丙酸处理，使式-v的化合物o-烷基化，以获得式-vi的化合物；
f.通过在溶剂中用l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐(l-alanyl-d-isoglutaminebenzylestertrifluoroacetate)处理式-vi的化合物来偶联肽，以获得式-vii的化合物；
g.使式-vii的化合物脱保护以获得如通过式-viii表示的期望的化合物；
其中在上文的化合物中，r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
步骤(d)中的酰化剂可以选自1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸、n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)或两者的组合。在一个实施方案中，酰化剂优选地是1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸和n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)的组合。
步骤(d)中的溶剂可以选自干燥的吡啶、二异丙基乙胺、三乙胺和n,n-二甲基氨基吡啶(dmap)或其混合物。在一个实施方案中，使用的溶剂是dmap。
步骤(e)中的溶剂是干燥的二氧六环。步骤(f)中的溶剂可以选自三氟乙酸(tfa)和四氢呋喃(thf)或其混合物。
步骤(f)中的偶联在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和羟基苯并三唑(hobt)的存在下进行。
步骤(g)中的脱保护用冰乙酸进行。
在一个实施方案中，当式-viii中的r1和r2两者均是氢(h)时，上文的工艺提供新颖的mdp衍生物化合物mdp-mn。
在一个实施方案中，本发明提供式-v的化合物：
其中r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了式-vi的化合物：
其中r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
在另外的实施方案中，本发明提供了式-vii的化合物：
其中r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物乙基((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺，该化合物通过以下来表征：1hnmr：7.48-6.97(m,10h),5.45(s,1h),4.82(d,1h),4.75(s,2h),4.64-4.45(m,1h),3.89(t,1h),3.85-3.72(m,2h),3.56(m,4h),1.83-1.65(m,10h)；esi-ms-526(m++1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸，该化合物通过以下来表征：1hnmr：7.47-6.95(m,10h),5.45(s,1h),5.2-5.0(d,1h),4.75(d,1h),4.64-4.52(m,2h),4.49-4.23(m,2h),4.25-3.41(m,2h),3.89(t,1h),3.85-3.72(m,2h),3.56(m,4h),1.64-0.95(s,10h)；esi-ms-598(m++1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯((4r)-benzyl-5-amino-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(benzyloxy)-2-phenyl-7-(1,4-dioxaspiro[4.5]decane-2-carboxamido)hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxin-8-yloxy)propanamido)propanamido)-5-oxopentanoate)，该化合物通过以下来表征：1hnmr：8.42-7.95(m,6h),7.65(d,2h),7.45-6.85(m,7h),6.05(s,1h),5.5(s,1h),4.85(d,1h),4.75-4.45(m,6h),4.42-3.41(m,5h),2.25-1.95(m,5h),1.45-0.95(m,18h)；esi-ms-882(m++1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)使2-乙酰基d-葡萄糖胺(i)异头苄基化以获得苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷(ii)；
(b)对苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷(ii)进行亚苄基保护以获得苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷(iii)；
(c)使苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷(iii)脱酰基以获得苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖苷(iv)；
(d)在溶剂4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(dmap)的存在下，用有机酰化剂使苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖苷(iv)再酰化，以获得乙基-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺(v)，所述有机酰化剂是1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-羧酸和n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)的组合；
(e)在溶剂干燥的二氧六环的存在下，用l-2-氯丙酸使乙基-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺(v)o-烷基化，以获得(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸(vi)；
(f)使(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸(vi)与l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐进行肽偶联，以获得(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯(vii)；
(g)在冰乙酸的存在下，使(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯(vii)脱保护，以获得(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)。
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物viii或mdp-mn作为在具有抗原的疫苗制剂中的佐剂的用途，其中抗原可以选自减毒活疫苗抗原(liveattenuatedvaccineantigen)、灭活疫苗抗原、亚单位疫苗抗原、结合疫苗抗原(conjugatevaccineantigen)和重组疫苗抗原或其任何组合。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含作为佐剂的式viii的化合物的疫苗制剂。
其中r1和r2两者均是氢；或r1是氢并且r2是烷基或芳基；或r1是烷基或芳基并且r2是氢；或r1和r2两者均是烷基或芳基(相同或不同的基团)；其中烷基基团构成具有或不具有杂原子的c1-c6烷基或更高级的烷基(直链的和支链的两者)；并且芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基和多核芳族化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含作为佐剂的、在结构上如以下结构中示出的化合物(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)。
其中疫苗制剂选自细菌疫苗、病毒疫苗或针对哺乳动物的任何潜在的
感染性病原体。
附图简述
图1：该图呈现mdp-mn的剂量应答曲线。x-轴代表以对数标度计的浓度，且y-轴代表％应答。通过把最小值或低吸收度当作0％并把最大值或高吸收度当作100％来归一化y-轴值。此图指示ec50为1.341μg/ml，其是佐剂示出半数最大应答(halfmaximalresponse)的浓度。每个数据集点以平均值±sd来表示，其是从一式两份地进行的三个独立实验获得的。
图2：呈现mdp-mn的细胞毒性。x-轴代表以对数标度计的浓度，且y-轴代表％毒性。此图指示ic50为99.22μg/ml。发现导致细胞死亡所需的浓度是99.22μg/ml。每个数据集点以平均值±sd来表示，其是从一式两份地进行的三个独立实验获得的。
图3：mdp-mn类似物对脾细胞增殖的效果。
图4：在施用了mdp-mn+ova、mdp+ova、以及单独的ova和单独的pbs的小鼠中的延迟型超敏反应。
图5a：此图示出了在存在和不存在mdp-mn的情况下的乙型肝炎特异性终点效价。括号中的数字指示对于连同hbsag接种疫苗所给出的mdp-mn的浓度。y轴代表elisa中测试的血清稀释度。
图5b：此图呈现在存在和不存在mdp-mn的情况下获得的th1极化(th1polarization)和th2极化。括号中的数字指示对于连同hbsag接种疫苗所给出的mdp-mn的浓度。
图5c：此图示出了在存在和不存在mdp-mn的情况下的rpvrii的抗体终点效价。括号中的数字指示对于连同rpvrii接种疫苗所给出的mdp-mn的浓度。y轴代表elisa中测试的血清稀释度。
发明详述
本发明提供了通式-viii的新颖的胞壁酰二肽(mdp)衍生物化合物、用于合成的工艺、在合成中使用的新颖的中间体化合物、以及其作为免疫原性制品中的佐剂的用途。
其中，r1或r2选自由以下组成的组：氢、具有或不具有杂原子如氧原子的烷基(具有直链和支链两者)；芳基、苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基、多核芳族化合物如萘基、蒽基和菲咯啉基。
烷基可以是具有任何合适碳长度的直链或支链。在一个实施方案中，烷基是直链烷基。在另一个实施方案中，烷基是支链烷基。非限制性示例性直链烷基可以选自甲基、乙基、丙基、丁基等。烷基可以具有或不具有杂原子。在一个实施方案中，烷基包含杂原子。在另一个实施方案中，烷基不具有杂原子。典型的杂原子包括氧(o)、氮(n)、硫(s)等。多核芳族化合物基团包括萘基、蒽基和菲咯啉基或类似基团。
式-viii的r1和r2可以独立地选择，其中r1和r2如上文所定义。在一个实施方案中，r1＝r2＝h。在另一个实施方案中，r1＝h并且r2＝烷基或芳基。在另一个实施方案中，r1＝烷基或芳基并且r2＝h。在另一个实施方案中，r1＝r2＝烷基或芳基。在这些实施方案中，烷基或芳基如上文所定义。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了式-viii的mdp衍生物化合物，其中r1是氢(h)并且r2是氢(h)。当r1＝r2＝氢(h)时，本发明的式-viii的新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物是在结构上如以下显示的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)：
[式-viii，当r1＝r2＝h时]
通过分别在方案-a和方案-b中提及的下文示出的反应步骤来顺序地合成通式-viii的新颖的胞壁酰二肽衍生物化合物(其中r1和r2如上文所定义)，所述化合物包括式-viii(当r1＝r2＝h时)的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸。
包括如上文示出的mdp-mn(式-viii，当r1＝r2＝h时)的具有结构通式-viii的新颖的mdp衍生物化合物是根据方案-b中描述的工艺来合成的。另外，在如下文方案-b中示出的包括mdp-mn的具有结构式-viii的新颖的mdp衍生物化合物的合成中使用的起始化合物l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯是根据下文示出的方案-a(起始二肽的合成)来合成的。其后，包括mdp-mn的新颖的mdp衍生物化合物根据方案-b中提到的逐步反应获得。
用于合成结构式-viii的胞壁酰肽衍生物的方案-b在下文被描述：
其中r1和r2如上文所定义或是如下
r1＝h并且r2＝h；或
r1＝h并且r2＝烷基或芳基；或
r1＝烷基或芳基并且r2＝h；或
r1＝r2＝烷基或芳基(相同或不同的基团)
其中，烷基基团构成具有或不具有杂原子如氧原子的c1-c6烷基或更
高级的烷基(直链的和支链的两者)；
芳基基团构成苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基、多核芳族化
合物如萘基、蒽基、菲咯啉基。
当r1＝r2＝h时，式-viii是mdp-mn。
方案-b
用于合成新颖的胞壁酰二肽化合物的l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯的方案-a在下文被描述：
用于合成二肤的方案
试剂和条件：a)bnoh，bf3.et2o，室温，15h，94％；b)nahco3，(boc)2o，thf，h2o，室温，12h，96％；c)clcooet，et3n，nh4oh，thf，0℃至-15℃，1.5h，90％；d)i.tfa:ch2cl2，然后，ii.boc-ala，edci，hobt，dipea，thf，0℃至室温，6h，87％
方案-a
在另一个方面中，本发明提供了如上文方案-b中示出的通式v、通式vi和通式vii的新颖的中间体化合物，其用于合成上文通式-viii的新颖的mdp衍生物化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了具有如下文显示的结构式-v的中间体化合物：
在一个实施方案中，本发明提供了具有如下文显示的结构式-vi的中间体化合物：
在一个实施方案中，本发明提供了具有如下文显示的结构式-vii的中间体化合物：
通式-v、通式-vi和通式-vii的任一个中的r1和r2如上文关于通式-viii所定义或可以是如下
-r1或r2(独立地)选自由以下组成的组：氢、具有或不具有杂原子如氧原子的烷基(具有直链和支链两者)；芳基、苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基、多核芳族化合物如萘基、蒽基和菲咯啉基。
在一个实施方案中，
-上文式-v的中间体化合物是乙基((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基-六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺；
-上文式-vi的中间体化合物是(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸；并且
-上文式-vii的中间体化合物是(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯。
在另一个方面中，本发明提供了用于合成式-viii的新颖的mdp衍生物化合物的工艺，如包括如上文方案-a(l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯的合成)和方案-b(式-viii的新颖的mdp衍生物的合成)中描述的反应步骤。
通过提供悬浮在苄醇和三氟化硼(bf3)中的d-谷氨酸[化合物1]和无水硫酸钠(na2so4)的混合物来合成化合物2。向此混合物添加乙醚，并将悬浮液在室温(rt)搅拌，随后用无水thf稀释并借助于炭过滤。用三乙胺进一步处理，浓缩，沉淀，随后洗涤，这提供了(r)-2-氨基-5-(苄氧基)-5-氧代戊酸[化合物2]。
通过提供化合物2的溶液，在低温例如0℃添加在二氧六环和水中的二碳酸二叔丁酯(boc2o)并搅拌过夜来制备化合物3。然后，在减压下除去溶剂，并且将残余物用水稀释、用碳酸钠(na2co3)碱化并用乙酸乙酯(etoac)洗涤、用hcl水溶液调节至ph2-3并用etoac萃取、随后进一步处理以得到(r)-5-(苄氧基)-2-(叔丁氧基羰基)-5-氧代戊酸[化合物3]。
通过提供在四氢呋喃(thf)中的化合物3，在低温例如0℃添加氯甲酸乙酯和三乙胺来合成化合物4。将反应混合物在低温搅拌，并且然后冷却至低温(例如-15℃)，随后添加氨的甲醇溶液，并进一步冷却至负温(minustemperature)并添加乙酸乙酯。在用水洗涤有机相，随后用盐水溶液洗涤，干燥，在真空中除去溶剂并纯化之后，获得(r)-5-氨基-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物4]。
将叔丁氧基羰基-d-异谷氨酰胺苄酯[化合物4]溶解在冷的三氟乙酸中，并将所得到的溶液在rt搅拌，并然后除去三氟乙酸，并且将残余物用乙醚(et2o)研磨以获得油状的d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐。向在干燥的thf中的叔丁氧基羰基-l-丙氨酸分别添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和羟基苯并三唑(hobt)并在rt搅拌。向此溶液添加d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐(溶解在thf中)，随后是n,n-二异丙基乙胺(dipea)。在搅拌并浓缩后，将残余物用etoac萃取，洗涤并干燥以获得残余物。在进一步洗涤并重结晶后，这提供了(r)-5-氨基-4-((s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物5]。
化合物5还可以根据上文方案-a中描述的试剂和条件来制备。
在另一个方面中，本发明提供了用于制备式-viii的胞壁酰二肽衍生物化合物的工艺，其中r1和r2如上文所定义或是如下。
其中，r1或r2选自由以下组成的组：氢、具有或不具有杂原子如氧原子的烷基(具有直链和支链两者)；芳基、苯基、被取代的苯基、杂芳基、芳基烷基、多核芳族化合物如萘基、蒽基和菲咯啉基(当r1＝r2＝h时，式-viii是mdp-mn)。
该工艺包括以下5个步骤(a)至(g)：
步骤-a：n-乙酰基d-葡萄糖胺(i)的异头苄基化：
步骤(a)包括使式i的化合物异头苄基化以获得如下文示意地显示的式-ii的化合物：
异头苄基化通过在搅拌下用苄醇处理式-i的化合物来进行。反应可以在离子交换树脂例如amberlite或其他树脂的存在下进行。反应可以在约70℃至90℃的温度进行。优选地，在一个实施方案中，搅拌在80℃进行并且蒸发在90℃进行。
在将混合物过滤后，将残余物摄取在热的醇溶剂中并过滤。优选地，使用的醇溶剂是异丙醇。进一步结晶提供白色结晶固体。获得的固体可以用醇溶剂例如异丙醇并且随后是醚来洗涤。
步骤-b：亚苄基保护
步骤(b)包括对式ii的化合物进行亚苄基保护以获得如下文示意地显示的式-iii的化合物；
此亚苄基保护通过用干燥的苯甲醛处理具有结构式-ii的化合物来进行。反应可以在金属氯化物的存在下进行。在一个实施方案中，使用的金属氯化物是氯化锌。
将混合物在室温搅拌持续18小时至22小时，优选地持续20小时，并然后在35℃至45℃、优选地40℃搅拌持续3小时至5小时以溶解少量的剩余的固体，随后在室温搅拌持续16小时至20小时，优选地18小时。
在适当搅拌后，将反应溶液用溶剂稀释，搅拌并储存。在一个实施方案中，将反应溶液用石油醚、无水乙醇和水(h2o)稀释，随后在rt进一步搅拌持续1-2天，并在0℃储存持续8天至12天。
将形成的沉淀物洗涤并再悬浮于溶剂中。在一个实施方案中，洗涤溶剂是无水etoh并且再悬浮于乙醚中。在干燥后，获得苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物iii]。干燥可以在真空中在室温经五氧化二磷(p2o5)进行。
步骤-c：脱酰基
步骤(c)包括使式iii的化合物脱酰基以获得如下文示意地显示的式-iv的化合物；
使式iii脱酰基是通过在碱的存在下用醇例如无水乙醇处理、随后回流来进行。碱可以是氢氧化钾(koh)、氢氧化钠(naoh)、氢氧化锂(lioh)、氢氧化钙(caoh)等。在一个实施方案中，使用的碱是氢氧化钾(koh)。
回流在氮气(n2)下进行，持续8-12小时，优选地10小时，并且然后倒入热水中。
将悬浮液在低温(例如-5℃)搅拌过夜持续14小时至18小时，优选地16小时。
将获得的产物过滤并重结晶。重结晶可以从诸如水、醇(例如乙醇)、四氢呋喃(thf)、二异丙醚或其混合物的溶剂中进行。在一个实施方案中，产物从etoh-水中重结晶，随后从四氢呋喃和二异丙醚(thf和i-pr2o)中重结晶。
步骤-d：酰化-
步骤(d)包括在碱性溶剂的存在下用合适的酰化剂使式-iv的化合物再酰化，以获得如下文示意地显示的式-v的化合物；
合适的酰化剂是有机酰化剂或剂的组合。在一个实施方案中，步骤(d)中使用的有机酰化剂是1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸。
酰化步骤(d)是在另一种活化剂的存在下进行的。在一个实施方案中，使用的活化剂是n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)。
在一个实施方案中，有机酰化剂是1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-羧酸和n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)的组合。
酰化步骤(d)中的碱性溶剂可以选自干燥的吡啶、二异丙基乙胺、三乙胺和n,n-二甲基氨基吡啶(dmap)或其混合物。在一个优选的实施方案中，步骤(d)中使用的溶剂是4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(dmap)。
在一个实施方案中，步骤(d)在另外的合适的有机溶剂的存在下进行。在一个实施方案中，步骤(d)中使用的另外的有机溶剂是二氯甲烷。
酰化剂、溶剂和活化剂同时地或顺序地添加。在一个实施方案中，顺序地添加1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸、4-(n,n-二甲基氨基)吡啶、n,n-二环己基碳二亚胺。
因此在一个优选的实施方案中，式iv的化合物是在溶剂二氯甲烷中的4-(n,n-二甲基氨基)吡啶的存在下用1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸和n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)来处理。
然后，将反应混合物在室温搅拌，过滤，洗涤，过滤并蒸发至干燥。
在一个实施方案中，将所得到的反应混合物用二氯甲烷稀释，并用含水乙酸、饱和的含水碳酸氢钠和水连续地洗涤，干燥(mgso4)，过滤，并将滤液蒸发至干燥，以给出式-v的化合物。可以进行色谱法纯化，例如在硅胶上的快速色谱法。
步骤-e：o-烷基化
步骤(e)包括通过在溶剂的存在下用l-2-氯丙酸处理，使式-v的化合物o-烷基化，以获得式-vi的化合物；
o-烷基化步骤(e)中的溶剂是干燥的二氧六环。还可以使用任何其他类似的惰性高沸点溶剂。
反应可以在诸如氢化钠、氢化钾、氢化钙等的金属氢化物的存在下进行。在一个优选的实施方案中，步骤(e)中使用的金属氢化物是氢化钠。
初始地，在90℃至100℃添加金属氢化物。优选地，在95℃添加金属氢化物例如氢化钠。
在一定时间例如1小时至2小时后，在搅拌下将温度降低至约50℃至75℃持续过夜，并然后用水冷却。在一个实施方案中，将温度降低至65℃。在进一步后处理(workup)、萃取和干燥后，获得期望的式-vi的化合物。
含水的化合物混合物可以用诸如乙醚、氯仿或其组合的溶剂萃取。
步骤-f：肽偶联
步骤(f)包括通过用l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐处理式vi的化合物来偶联肽，以获得如下文示意地显示的式-vii的化合物。
如通过方案-a中示出的工艺获得的肽化合物5与式-vi的化合物偶联。将化合物5(叔丁氧基羰基-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯)溶解在溶剂中并将产生的溶液在室温搅拌持续几分钟。然后，除去溶剂并且残余物用et2o研磨以获得l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐。
偶联在标准碳二亚胺偶联条件下，例如在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和羟基苯并三唑(hobt)的存在下进行。
步骤(f)中的溶剂可以选自三氟乙酸(tfa)和四氢呋喃(thf)或其混合物。在一个实施方案中，步骤(f)中使用的溶剂是冷的三氟乙酸(tfa)。在另一个实施方案中，步骤(f)中使用的溶剂是thf。在另一个实施方案中，步骤(f)中的溶剂包括tfa和thf两者。
步骤(f)可以在碱的存在下进行。在一个实施方案中，碱是n,n-二异丙基乙胺(dipea)。
将反应混合物在rt搅拌持续12小时至18小时，优选地15小时。在浓缩后，残余物可以用有机溶剂例如氯仿来萃取，并将有机层洗涤、干燥并蒸发。获得的残余物可以在硅胶柱上通过用诸如氯仿、醇(例如甲醇、乙醇等)或其混合物的溶剂洗脱来纯化。在一个实施方案中，氯仿-甲醇混合物被用于洗脱。
步骤-g：脱保护
步骤(g)包括使式-vii的化合物脱保护以获得如由式-viii表示的期望的化合物，如下文示意地显示的；
脱保护通过使用用于除去保护基的酸处理式-vii的化合物来进行，以获得如由结构式-viii表示的期望的化合物，其中r1和r2如上文所定义。当r1＝r2＝h时，式-viii的化合物是mdp-mn。在一个实施方案中，步骤(g)中用于脱保护的酸是冰乙酸。
脱保护可以在催化剂的存在下进行。在一个实施方案中，步骤(g)中使用的催化剂是钯黑。
向溶解在酸中的式-vii的化合物的溶液添加催化剂，并以通常的方式使化合物氢解持续3天至5天。
将催化剂滤出，并且在添加水后将滤液在减压下蒸发。残余物可以被柱纯化。在一个实施方案中，将残余物溶解在小体积的乙酸中，并然后应用至sephadexlh-20的柱。纯化的级分可以被冻干。可以选择任何其他合适的柱。
在一个优选的实施方案中，上文描述的工艺提供式-viii的胞壁酰二肽衍生物化合物，当r1和r2是氢时，该化合物是在结构上如下文显示的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(mdp-mn)。
[式-viii，当r1＝r2＝h时]
在另一个方面中，本发明提供了用于制备(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)使2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖(i)异头苄基化以获得苄基2-
乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷(ii)；
(b)使苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷(ii)进行亚苄基保护以获得苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷(iii)；
(c)使苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷(iii)脱酰基以获得苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-吡喃甘露糖苷(iv)；
(d)在溶剂4-(n,n-二甲基氨基)吡啶的存在下，用有机酰化剂使苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖苷(iv)再酰化，以获得乙基-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺(v)，所述有机酰化剂是1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-羧酸和n,n-二环己基碳二亚胺的组合；
(e)在溶剂干燥的二氧六环的存在下，用l-2-氯丙酸使乙基-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺(v)o-烷基化，以获得(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸(vi)；
(f)使(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸(vi)与l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐进行肽偶联，以获得(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯(vii)；
(g)在冰乙酸的存在下，使(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯(vii)脱保护，以获得(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(式-viii(mdp-mn)，当r1＝r2＝h时)。
通过如下文提供的实施例的方式进一步解释上文的工艺。
包括mdp-mn的通式-viii的新颖的mdp衍生物化合物具有高度潜在的免疫调节性质。
在另一个方面中，本发明提供了包括mdp-mn的通式-viii的新颖的mdp衍生物化合物作为免疫原性制品和疫苗制剂中的佐剂的用途。
在另外的方面中，本发明提供了疫苗制剂，所述疫苗制剂包含作为佐剂的通式-viii的新颖的mdp衍生物化合物。
在本发明的另外的方面中，本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物被评估其活性。本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物的安全性通过细胞毒性测定和热原性测定来确定。
此外，在本发明的另外的实施方案中，当用作与多种疫苗抗原一起使用的佐剂时，本发明的新颖的胞壁酰二肽衍生物的体内免疫原性被示出为实现抗体效价的至少4倍增加，从而能够产生体液免疫应答和细胞介导的免疫应答两者。
疫苗制剂包含抗原，所述抗原可以选自减毒活疫苗抗原、灭活疫苗抗原、亚单位疫苗抗原、结合疫苗抗原和重组疫苗抗原或其任何组合。
任选地，制剂可以包含或可以不包含如配制疫苗制剂可能需要的药学上可接受的赋形剂、稀释剂和其他添加剂中的一种或更多种。
非限制性地，上文的疫苗制剂可以是细菌疫苗、病毒疫苗或针对哺乳动物的任何潜在的感染性病原体。
实施例：
通过下文非限制性实施例的方式进一步解释和说明了新颖的mdp衍生物、其合成和用于合成的新颖的中间体以及这些新颖的mdp衍生物作为佐剂的评估。
上文方案-a中示出的反应步骤在下文实验实施例中被进一步描述：
实施例1.1：方案-a：用于合成l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯的实验程序：
如在本发明中描述和公开的新颖的mdp衍生物包含l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺二肽实体。对于根据本发明的新颖的胞壁酰二肽化合物的最终制备所需的l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯通过如下文反应方案-a中示出的方法来合成：
实施例-1.1.1：(步骤-a)：(r)-2-氨基-5-(苄氧基)-5-氧代戊酸[化合物2]的制备
将d-谷氨酸[化合物1](4.0g,27.2mmol)和无水硫酸钠(na2so4，4.0g的量)的混合物悬浮在苄醇(50ml,484mmol)和三氟化硼(bf3)中。借助于注射器，向此混合物添加乙醚(et2o，7.4ml，54.4mmol的当量)。将悬浮液在室温(rt)搅拌持续15小时。将混合物用无水thf(150ml)稀释并借助于炭来过滤。澄清的滤液用三乙胺(et3n，8.2ml，59.2mmol的量)处理并在真空下浓缩，直到形成粘稠的残余物。此粘稠的残余物用乙酸乙酯(etoac，200ml的量)研磨，并通过抽吸分离沉淀的固体并用另外的溶剂洗涤，以得到作为白色固体的化合物2(6.04g，94％，相对于起始材料)。
实施例-1.1.2(步骤-b)：(r)-5-(苄氧基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-氧代戊酸[化合物3]的制备
在0℃，向化合物2(6.0g，25.3mmol)的溶液添加在二氧六环和水(1:1,40ml)中的二碳酸二叔丁酯(boc2o，6.62g，30.36mmol的量)并将混合物搅拌过夜(16小时)。在减压下除去溶剂，并且将残余物用水(30ml)稀释，用碳酸钠(na2co3)碱化并用乙酸乙酯(etoac)(3×100ml)洗涤。水层用5mhcl水溶液调节至ph2-3并用etoac(4×100ml)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且在减压下除去溶剂，以得到具有以下nmr特性的作为粘稠的无色油状物的(r)-5-(苄氧基)-2-(叔丁氧基羰基)-5-氧代戊酸[化合物3](8.19g，96％)。
1hnmr(cdcl3):7.38-7.31(m,5h),5.13(s,1h),2.61-2.41(m,2h),2.23-1.99(m,2h),1.43(s,9h)。esims:
实施例-1.1.3(步骤-c)：(r)-5-氨基-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物4]的制备
制备上文的酸化合物3(7.0g，20.8mmol)在四氢呋喃(thf，15ml的量)中的溶液，并在0℃添加氯甲酸乙酯(2.7ml，28.36mmol)和三乙胺(4.21ml，30.25mmol)。将反应混合物在0℃搅拌持续0.5小时，然后冷却至-15℃，随后添加氨的甲醇溶液(25ml,4.0m)。然后，将反应混合物在-15℃搅拌持续另外的1.5小时，并用乙酸乙酯(200ml)稀释。将有机相首先用水洗涤三次(100ml×3)，并且然后用盐水溶液(100ml)洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并且将残余物通过快速色谱法纯化，以提供作为白色固体并具有以下nmr特性的期望的化合物4(6.63g，收率95％)。
1hnmr(300mhz,cdcl3):δ7.35-7.30(m,5h),5.12(s,2h),3.70(s,2h),2.58-2.42(m,2h),2.31-2.19(m,2h)1.43(s,9h)；esims:337(m+)。
实施例-1.1.4(步骤-d):(r)-5-氨基-4-((s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物5]
将叔丁氧基羰基-d-异谷氨酰胺苄酯[化合物4](6.5g，19.3mmol)溶解在冷的三氟乙酸(20ml)中，并将所得到的溶液在室温搅拌持续15分钟。然后，除去三氟乙酸，并且将残余物用乙醚(et2o)研磨，以获得油状的d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐。将油状的d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐经氢氧化钠(naoh)小球干燥并溶解在thf中。
单独地，将叔丁氧基羰基-l-丙氨酸(4.012g，21.23mmol)保持在干燥的thf中。将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci，4.46g，23.36mmol的量)和羟基苯并三唑(hobt，3.57g，23.36mmol的量)添加至在干燥的thf中的叔丁氧基羰基-l-丙氨酸(4.012g,21.23mmol)并在室温(rt)搅拌持续30分钟。向此溶液添加d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐(溶解在thf中)，随后是n,n-二异丙基乙胺(dipea，7.06ml,40.53mmol的量)。将反应在rt搅拌持续15小时，然后将溶液浓缩并且将残余物用etoac(500ml)萃取。etoac层用5％碳酸氢钠(nahco3)、10％柠檬酸和水(200ml×3)连续地洗涤，然后经na2so4干燥并蒸发以获得残余物。将残余物用石油醚研磨以形成晶体，将晶体从etoac-石油醚中重结晶，以产生具有以下nmr特性的作为白色固体的化合物5(6.37g，81％)。
1h-nmr(300mhz,cdcl3):δ7.39-7.29(m,5h),5.82(s,1h),5.13-5.10(m,1h),4.07(m,1h),2.60-2.42(m,2h),2.27-1.97(m,2h),1.32(d,3h)；c15h21n3o4的质量:m/z计算为307，实测为308[m+h]+。
实施例1.2：方案-b：
实施例-1.2.1：苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷[化合物ii]的制备
n-乙酰基d-葡萄糖胺(化合物i)的异头苄基化
将2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物i](15.0g，0.068mol)、amberliteir120[h]+离子交换树脂(15.0g)在苄醇(125ml)中的混合物在80℃搅拌持续3.5小时。将反应混合物过滤。将滤液在90℃在减压下蒸发。将残余物摄取在热的异丙醇(60ml)中并过滤。将滤液留下结晶，将白色结晶固体滤出，用冷的异丙醇(20ml)洗涤两次，并且用乙醚(ether)(200ml)洗涤两次，以给出苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物ii](5.62g，收率27％)。
实施例-1.2.2：苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物iii]的制备
亚苄基保护-
将苄基2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物ii](4.98g，16.01mol)添加至氯化锌(5.0g，36.82mmol)在干燥的苯甲醛(16.5ml)中的良好搅拌的混合物。将此混合物在室温搅拌持续20小时，然后在40℃搅拌持续4小时以溶解少量的剩余的固体，然后在室温搅拌持续18小时。现在，将良好搅拌的反应溶液用石油醚(30ml)、无水乙醇(etoh，10ml的量)和15ml的水(h2o)稀释。将反应混合物在室温搅拌持续2天，然后在0℃储存持续11天。将如此形成的凝结的白色沉淀物收集在粗玻璃熔块漏斗(coarseglassfritfunnel)上，充分排干，然后通过再悬浮于无水etoh(约50ml)中来洗涤。将白色细分固体充分排干，再悬浮于乙醚(约50ml)中，再次充分排干，并然后在室温在真空中经五氧化二磷(p2o5)干燥，以得到具有以下nmr特性的苄基2-乙酰氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖苷[化合物iii](4.17g，收率65.4％)。
1hnmr(cdcl3):7.37-7.7.82(m,10h),5.5(s,1h),4.2-4.9(m,4h),3.3-3.8(m,4h),2.5(s,3h),esims:400(m++1)。
实施例-1.2.3：苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖苷[化合物iv]的制备：
脱酰基-
将化合物iii(2.8g，6.7mmol)、12g氢氧化钾(koh)和95％etoh(40ml)的混合物在氮气(n2)下回流持续10小时，并然后倒入热水(150ml)中。将产生的粗产物的块状物破碎。将悬浮液在-5℃搅拌过夜持续16小时。将产物过滤并从etoh-水中重结晶，炭脱色，随后从四氢呋喃和二异丙醚(thf和i-pr2o)中重结晶，以获得苄基-2-氨基-4,6-o-亚苄基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖苷[化合物iv](2.3g，收率95％)；mp：129-131℃；[α]d25+57.58(c2.2，dmf)；ir(以cm-1计的n)：3450,3400,750,700；所述化合物具有以下nmr特性：
1hnmr(cdcl3):7.37-7.7.82(m,10h),5.5(s,1h),4.9-3.3(m,8h),esims:358(m++1)。
用于合成(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸[化合物viii，当r1＝r2＝h时]的程序：
此产物如下文描述的来合成。
实施例-1.2.4：乙基((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺[化合物v]的制备
酰化：
向在二氯甲烷(100ml)中蒸馏的化合物iv(1.07g,3.0mmol)的溶液顺序地添加1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-羧酸(0.651g,3.5mmol)、4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(0.01g，0.08mmol)和n,n-二环己基碳二亚胺(0.7g，3.3mmol)。将混合物在室温搅拌持续4小时并且将所得到的溶液过滤。将滤液用二氯甲烷稀释并用1n乙酸水溶液、饱和的碳酸氢钠水溶液和水连续地洗涤，干燥(mgso4)，过滤，并将滤液蒸发至干燥。固体通过使用二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂的在硅胶上的快速色谱法纯化，以给出化合物v，乙基((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-8-羟基-2-苯基六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-7-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰胺(1.27g，收率81％)。
1hnmr:7.48-6.97(m,10h),5.45(s,1h),4.82(d,1h),4.75(s,2h),4.64-4.45(m,1h),3.89(t,1h),3.85-3.72(m,2h),3.56(m,4h),1.83-1.65(m,10h)；esi-ms-526(m++1)。
实施例-1.2.5：(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸[化合物vi，当r1＝r2＝h时]的制备
o-烷基化：
在95℃向在作为稀释剂的干燥的二氧六环(30ml)中的化合物v(1.2g，2.28mmol)的搅拌的溶液添加氢化钠(2.5g)(60％油悬浮液)。还可以使用任何其他类似的惰性高沸点溶剂来替代干燥的二氧六环。在1小时后，将温度降低至(在其他情况下，将温度升高至)65℃，并然后添加l-2-氯丙酸(1.6g)在小体积的二氧六环中的溶液。在1小时后，添加另外的1g的氢化钠，并在搅拌下在65℃继续反应并持续过夜(16小时)。然后，小心地添加水(150ml)以冷却反应混合物。将产生的深色的下层丢弃，并将上层过滤、部分浓缩并用水(100ml)稀释。含水混合物用乙醚萃取，并且将水层在0℃酸化至ph～3并用氯仿(100ml，3次)萃取。将合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥并蒸发，以给出具有以下nmr特性的作为白色固体的期望的产物(2r)-2-((4ar,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酸[化合物vi](1.6g，收率85％)：1hnmr:7.47-6.95(m,10h),5.45(s,1h),5.2-5.0(d,1h),4.75(d,1h),4.64-4.52(m,2h),4.49-4.23(m,2h),4.25-3.41(m,2h),3.89(t,1h),3.85-3.72(m,2h),3.56(m,4h),1.64-0.95(s,10h)；esi-ms-598(m++1)。
实施例-1.2.6：((4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物vii，当r1＝r2＝h时]的制备
肽偶联：
将从如实施例1.1.4中公开的方案-a获得的化合物5(叔丁氧基羰基-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯，0.95g，2.42mmol)溶解在冷的三氟乙酸(10ml)中，并将产生的溶液在室温搅拌持续15分钟。然后，除去三氟乙酸并且将残余物用et2o研磨以获得l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐。此l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐经naoh小球干燥。
在标准碳二亚胺偶联条件下将(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)edci(0.63g，3.3mmol)和(羟基苯并三唑)hobt(0.504g，3.3mmol)添加至在干燥的thf中的化合物vi(1.5g，2.2mmol)。在rt搅拌持续30分钟后，添加l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺苄酯三氟乙酸盐(溶解在thf中)，随后是(n,n-二异丙基乙胺)dipea(1.05ml，6.05mmol)。将反应在rt搅拌持续15小时，然后将溶液浓缩，并且将残余物用氯仿(chcl3，50ml的量)萃取。chcl3层用5％nahco3、10％柠檬酸和水(20ml，三次)连续地洗涤，然后经na2so4(硫酸钠)干燥并蒸发。将获得的残余物在硅胶柱上通过用氯仿-甲醇混合物洗脱来纯化，以给出具有以下nmr特性的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-((4ar,6s,7r,8r,8as)-6-(苄氧基)-2-苯基-7-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-2-甲酰氨基)六氢吡喃并[3,2-d][1,3]二噁英-8-基氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸苄酯[化合物vii](1.55g，收率75％)：
1hnmr:8.42-7.95(m,6h),7.65(d,2h),7.45-6.85(m,7h),6.05(s,1h),5.5(s,1h),4.85(d,1h),4.75-4.45(m,6h),4.42-3.41(m,5h),2.25-1.95(m,5h),1.45-0.95(m,18h)；esi-ms-882(m++1)。
实施例-1.2.7：(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸[viii，当r1＝r2＝h时]的制备：
将上文获得的化合物vii(0.800g，0.90mmol)溶解在冰乙酸(50ml)中，并添加钯黑(80mg)，并且以通常的方法使化合物氢解持续3天至5天，氢解的进展通过薄层色谱法来监测。将催化剂滤出，并且在添加水(30ml)后，将滤液在减压下蒸发。将残余物溶解在小体积的0.1m乙酸中，并然后应用至sephadexlh-20的柱(2.5×85cm)，该柱用相同溶剂冲洗。汇集对应于主峰的纯化的级分并冻干。将冻干的材料在相同的条件下再次色谱分离，以产生具有以下性质的作为细的白色晶体的期望的化合物viii的(4r)-5-氨基-4-((2s)-2-((2r)-2-(((3r,4r,5s,6r)-3-(2,3-二羟基丙酰氨基)-2,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-4-基)氧基)丙酰氨基)丙酰氨基)-5-氧代戊酸(0.243g，50％)：
熔点(mp)：160-162℃；
[α]25d+42.6°(c0.2，水)；
ir(以cm-1计的n)：3305,2941,1653,1533,1448,1251,1036；
1h-nmr(300mhz,dmso-d6)：δ5.13(m,2h),4.98(m,1h),4.38(m,1h),4.23(m,1h),4.11(m,1h),2.36-2.10(m,2h),2.08-1.90(m,1h),1.77(m,1h),1.34(d,j＝6.504,3h),1.23(d,j＝6.201,3h)，
c20h34o13n4的质量：m/z计算为538，实测为556[m+nh4]+。
对c20h34n4o13的分析计算为：c,44.61；h,6.36；n,10.40；o,38.62。实测为：c,44.83；h,6.42；n,10.53；o,38.90。
实施例-2：mdp-mn活性和安全性的评估(体外)
胞壁酰二肽分子具有结合至存在于免疫细胞的表面上的nod2受体，以便刺激免疫应答的能力。nod2(核苷酸寡聚结构域)受体是识别胞壁酰二肽衍生物并刺激信号传递通路的级联以诱导免疫应答的细胞内模式识别受体(prr)。为了证明本发明中合成的mdp-mn是否刺激nod2受体，从美国加利福尼亚州的invivogen购买了hek-blue人类nod2报告细胞系(reportercellline)。这些细胞通过将人类nod2基因和密码子优化的seap(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因共转染到hek293细胞中来制备。在用胞壁酰二肽衍生物刺激细胞后，nfkb获得激活，其进而分泌seap，并且seap在细胞上清液中被测量。此体外测定的实验细节作为实施例2.1给出。
实施例2.1：nod2特异性报告物测定：将hek-blue人类nod2报告细胞(5×104个/孔)铺板并在37℃在潮湿的co2培养箱中培养过夜。第二天，将细胞用不同浓度的mdp-mn(0.001mg/ml至1mg/ml)处理并培养持续24-72小时。收集上清液并在37℃用quantiblue检测试剂处理持续15-30分钟。在630nm处读取吸收度。通过在x轴上标绘佐剂的浓度和y轴上标绘％应答所产生的剂量应答曲线如图1中示出的。为了产生剂量应答曲线，将在测试浓度示出的最高吸收度当作100％应答，并将最小吸收度当作0％应答。50％应答的有效浓度(ec50)从剂量应答曲线来确定。在本发明中，mdp-mn示出在10μg/ml浓度处具有高吸收度的最大100％应答(在s形曲线(sigmoidalcurve)中在此浓度处达到平台期(plateau))，然而，mdp-mn示出在0.01μg/ml浓度处具有低吸收度的0％应答。这些结果指示ec50为1.341μg/ml(mdp-mn示出半数最大应答的浓度)。总之，获得的结果指示，本发明中的新颖的合成的mdp-mn能够刺激nod2受体，nod2受体进而进一步确定刺激或增强免疫应答和充当佐剂的效力。
另外，使用免疫调节分子作为佐剂提出安全问题。为了评估mdp-mn的毒性，进行了两种体外测定，即细胞毒性和热原性测定，这些测定在下文中作为如实施例2.2和实施例2.3中的实施例来描述。
为了证明此特定的mdp-mn是否引起细胞毒性，使用mtt[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物]在j774.2a细胞中进行体外细胞毒性测定。测定的细节如实施例2.2中解释的。
实施例2.2：细胞毒性测定：将j774.2a细胞(2×104个/孔)铺板并孵育过夜。第二天，将细胞用不同浓度的mdp-mn(浓度范围从0.005mg/ml至0.5mg/ml的10倍稀释物和2mg/ml)处理并培养持续24小时。丢弃上清液并且将细胞用100μl的mtt[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物](5mg/ml)处理并孵育持续3-4小时，直到形成甲
通常，任何分子的热原性可以通过过度产生促炎细胞因子il-1β、il-6、和tnfα，随后体外活化单核细胞来测量，所述单核细胞活化进而可以指示增加的体内反应原性。因此，在本发明中，测试mdp-mn的体外热原性。实验细节已经如下文中作为实施例2.3被提及。为了确定在本发明中合成的mdp-mn是否是热原性的，使用外周血单核细胞(pbmc)进行体外热原测试。
实施例2.3：体外热原测试：将冷冻的外周血单核细胞(pbmc)复苏并铺板(0.5×106个细胞/ml，100μl)在96孔圆底细胞培养板中。细胞用包含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺(2mm)和青霉素-链霉素的rpmi1640培养基(gibcolaboratories,grandisland,n.y.)来补充。细胞用lps(10ng/ml)或内毒素(1eu/ml、0.5eu/ml、0.25eu/ml、0.125eu/ml)或mdp-mn(10μg/ml或100μg/ml)进一步刺激。将用lps或内毒素刺激的细胞孵育持续4小时，然而将用本发明的mdp衍生物刺激的细胞保持在37℃在潮湿的co2室中孵育持续24小时。在刺激后，收集细胞培养物上清液，并且通过elisa来测定细胞因子(例如il-1β、il-6或tnf-α)。在0.5eu/ml参考标准内毒素存在下，一式三份地测量由pbmc产生的每种细胞因子的浓度。对于每种细胞因子，使用由以0.5eu/ml的参考标准内毒素产生的细胞因子水平来计算阈值水平(marina等人，vaccine30(2012)4859-4865)。
实施例2.3.1：通过elisa确定il-1β：为了确定白细胞介素1β，根据指导手册(ebioscience，目录号88-7010)来进行酶联免疫吸附测定(elisa)。简言之，首先使用涂覆缓冲液以1:250稀释捕获抗体(目录号14-7018-67，ebioscience)，并且向96孔微孔板中的每个孔添加100μl。将板在2-8℃孵育过夜。然后，涂覆的板用洗涤缓冲液(pbst)洗涤。在洗涤后，使用1x测定稀释剂(diluent)将这些板在室温封闭持续1小时，随后用pbst洗涤。由最高浓度标准品(topstandard)制备在从4pg/ml至500pg/ml的范围内的连续的2倍稀释物，以制作标准曲线。类似地，制备从用mdp-mn刺激pbmc获得的细胞上清液的4倍稀释物(1:4、1:16和1:64)。将稀释的标准物或细胞上清液的等分试样(100μl)一式两份地添加到孔，并将板在室温孵育持续2小时。在将板洗涤后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的检测抗体(目录号33-7016-67)并在室温孵育持续1小时。之后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的抗生物素蛋白-hrp*并在室温孵育持续30分钟。最后，在洗涤后，将100μl的底物溶液添加至每个孔并在rt孵育持续15分钟。通过将50μl的2nh2so4添加至每个孔来停止反应，并在450nm处读取板。
实施例2.3.2：通过elisa确定il-6：为了确定白细胞介素6(il-6)，根据指导手册(ebioscience，目录号88-7066)来进行酶联免疫吸附测定(elisa)。简言之，首先使用涂覆缓冲液以1:250稀释捕获抗体(目录号14-7069-67，ebioscience)，并且向96孔微孔板中的每个孔添加100μl。将板在2-8℃孵育过夜。然后用先前通过用去离子水稀释20x浓缩物制备的1x洗涤缓冲液来洗涤涂覆的板四次(350μl/孔)。在洗涤后，将板倒置并在吸水纸上印迹以除去任何残余的缓冲液。在室温使用测定稀释剂(250μl/孔)将这些板封闭持续60分钟，随后用1x洗涤缓冲液洗涤四次(350μl/孔)。由最高浓度标准品制备在从0pg/ml至200pg/ml的范围内的连续的2倍稀释物，以制作标准曲线。类似地，制备从用mdp-mn刺激pbmc获得的细胞上清液的4倍稀释物(1:4、1:16和1:64)。将稀释的标准物或细胞上清液的等分试样(100μl)一式两份地添加到孔，并将板在室温孵育持续2小时。在将板洗涤后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的检测抗体(目录号33-7068-67,ebioscience)并在室温孵育持续1小时。之后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的抗生物素蛋白-hrp*并在室温孵育持续30分钟。最后，在洗涤后，将100μl的底物溶液添加至每个孔并在rt孵育持续15分钟。通过将50μl的停止溶液添加至每个孔来停止反应，并在450nm处读取板。
实施例2.3.3：通过elisa确定tnf-α：为了确定组织坏死因子-α(tnf-α)，根据指导手册(ebioscience，目录号88-7346)来进行酶联免疫吸附测定(elisa)。简言之，首先使用涂覆缓冲液以1:250稀释捕获抗体(目录号14-7348-67，ebioscience)，并且向96孔微孔板中的每个孔添加100μl。将板在2-8℃孵育过夜。然后用先前通过用去离子水稀释20x浓缩物制备的1x洗涤缓冲液来洗涤涂覆的板四次(350μl/孔)。在洗涤后，将板倒置并在吸水纸上印迹以除去任何残余的缓冲液。在室温使用测定稀释剂(250μl/孔)将这些板封闭持续60分钟，随后用1x洗涤缓冲液洗涤四次(350μl/孔)。由最高浓度标准品制备在从4pg/ml至500pg/ml的范围内的连续的2倍稀释物，以制作标准曲线。类似地，制备从用mdp-mn刺激pbmc获得的细胞上清液的4倍稀释物(1:4、1:16和1:64)。将稀释的标准物或细胞上清液的等分试样(100μl)一式两份地添加到孔，并将板在室温孵育持续2小时。在将板洗涤后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的检测抗体(目录号33-7349-67,ebioscience)并在室温孵育持续1小时。之后，添加在1x测定稀释剂中稀释的100μl/孔的抗生物素蛋白-hrp*并在室温孵育持续30分钟。最后，在洗涤后，将100μl的底物溶液添加至每个孔并在rt孵育持续15分钟。通过将50μl的停止溶液添加至每个孔来停止反应，并在450nm处读取板。
发现每个细胞因子的阈值水平为如下：对于il-1β为370pg/ml，对于il-6为3110pg/ml且对于tnf-α为753pg/ml。发现在用mdp-mn以10μg/ml和100μg/ml两者刺激pbmc后获得的促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的水平在阈值内(数据未示出)。因此，此结果示出mdp-mn不引起任何热原性。
已经发现本发明的化合物即特别是mdp-mn，当其与抗原组合使用时，具有显著的免疫调节活性。使用在下文中更详细解释的多种测试方法来证明此活性。
实施例-3：体内评估mdp-mn的免疫原性：初始地，为了证明mdp-mn作为佐剂的能力并且示出增强的体液和细胞介导的应答，将mdp-mn和两种选择的抗原(重组乙型肝炎表面抗原hbsag和间日疟原虫duffy结合域区域ii(plasmodiumvivaxduffybindingdomainregionii)pvrii)一起测试。然而，疫苗抗原与作为疫苗佐剂的本发明的新颖的化合物mdp-mn的选择不仅仅限于本文中例示的疫苗抗原。由于以明矾作为佐剂的乙型肝炎疫苗是在市场上高度成功的疫苗，在本研究中，将mdp-mn和hbsag一起测试是由于两个原因：(i)为了通过使用mdp-mn替代明矾来观看剂量节约效应(dosesparingeffect)，以及(ii)用于hbsag的所有方法是非常确定的，并且筛选新颖的佐剂是容易的，而且区分任何观察到的毒性是否是由于佐剂的存在或可选择地由疫苗抗原造成的也将是明显的，因为hbsag是已经确定和证明安全的。
用于与本发明的疫苗佐剂组合的疫苗抗原可以与其他合适的疫苗抗原一起来配制，所述其他合适的疫苗抗原包括但不限于其他抗原也就是包括生命周期的所有阶段的亚基疟疾抗原，例如任何形式的环子孢子蛋白(csp)、rpvrii、rmsps、rpfs25传播阻断抗原(transmissionblockingantigen)、rpvs25、rpvs27、rpff2、glurp、肝阶段抗原(liverstageantigen)、灭活的狂犬病抗原、基孔肯雅病毒抗原(chikungunyavirusantigen)等。用于与本发明的新颖的佐剂mdp-mn一起配制的本发明的疫苗抗原可以选自重组人类乳头瘤病毒抗原(包括hpv感染的任何和所有不同的血清型)、日本脑炎病毒抗原、灭活的狂犬病抗原、甲型肝炎抗原、乙型肝炎抗原、戊型肝炎抗原(包括亚基病毒样颗粒)、埃博拉病毒抗原、任何虫媒病毒抗原包括但不限于寨卡病毒(zikavirus)、登革热疫苗抗原、白喉-破伤风-百日咳(全细胞百日咳或无细胞百日咳如dtap、tdap)、乙型流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzaetypeb)(hib)，包括引起脑膜炎球菌感染(meningococcalinfection)也就是脑膜炎奈瑟菌a、脑膜炎奈瑟菌c、脑膜炎奈瑟菌y、脑膜炎奈瑟菌w135、脑膜炎奈瑟菌x和脑膜炎奈瑟菌b的疫苗抗原的任何和所有已知的形式。用于与此新颖的佐剂mdp-mn一起配制的本发明的疫苗抗原还可以包括肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)抗原，例如肺炎链球菌血清型4(streptococcalpneumoniaeserotypes4)、肺炎链球菌血清型6b、肺炎链球菌血清型9v、肺炎链球菌血清型14、肺炎链球菌血清型18c、肺炎链球菌血清型19f和肺炎链球菌血清型23f。疫苗抗原例如伤寒沙门氏菌vi多糖(salmonellatyphivipolysaccharide)(无缀合的(plain)或缀合的)、肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)、非伤寒沙门氏菌(non-typhoidalsalmonella)、副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphi)、单纯疱疹病毒抗原，人类免疫缺陷病毒抗原、巨细胞病毒抗原、h1n1病毒抗原或结核病疫苗也被包括在本发明的范围内。用于与本发明的新颖的疫苗佐剂mdp-mn一起配制的任何潜在的减毒活疫苗抗原包括mmr(麻疹、腮腺炎、风疹)、水痘、口服脊髓灰质炎(oralpolio)(萨宾(sabin))、流感(季节性流感h1n1病毒)、轮状病毒和黄热病、西尼罗热(westnilefever)疫苗。疫苗抗原例如基孔肯雅病毒、金迪普拉病毒(chandipuravirus)或其他形式的灭活的疫苗抗原例如为病原体的热灭活颗粒或化学灭活颗粒的灭活的脊髓灰质炎-salk、减毒活sabin脊髓灰质炎病毒i型、减毒活sabin脊髓灰质炎病毒ii型和减毒活sabin脊髓灰质炎病毒iii型、甲型肝炎也在用于与本发明的新颖的佐剂一起配制的本发明的范围内。如上文提及的本发明的抗原可以单独地存在或以其组合存在。
实施例-3.1：与卵白蛋白(ova)抗原一起的佐剂效果的评估：
实施例3.1.1：mdp-mn类似物对脾细胞增殖的效果
脾从小鼠中分离并处理成单细胞悬浮液。96孔平底微量滴定板用rpmi1640培养基以1×105个细胞/孔来接种。细胞用化合物、ova、cona(2μg/ml)和lps(10μg/ml)或培养基处理，给出200ml的最终体积。将板在培养箱中在37℃以5％co2中孵育。在48小时的孵育后，将20ml的三唑基蓝四唑鎓溴化物(triazolylbluetetrazoliumbromide)(mtt)溶液添加至每个孔，再孵育4小时。通过吸出上清液(180ml)从每个孔除去未转化的mtt并用dmso替代。在15分钟后，在570nm处读取吸收度。
免疫刺激物质通过特异性(抗原依赖性)t淋巴细胞、b淋巴细胞和树突细胞起作用，并还通过涉及粒细胞、巨噬细胞和nk细胞的非特异性作用机制(非抗原依赖性)起作用。作为次级淋巴器官，脾包含用于检查免疫刺激剂活性的淋巴细胞的异质群体。然而，免疫细胞如t细胞和b细胞的增殖是免疫增强的基准。用或不用ova或与mdp和mdp-mn组合地处理细胞。所有处理的组中的免疫应答的类型用图3中描绘的lps和con-a脾细胞增殖测定来测量。此研究揭示mdp-mn诱导lps介导的脾细胞增殖。这对于b细胞扩增是重要的。
实施例3.1.2.mdp-mn类似物对ova特异性igg的效果
在第1天和第15天，单独的用ova100μg或者用溶解在含类似物(7.5μg、15μg或30μg)的盐水中的ova100μg对雄性balb/c小鼠进行皮下免疫。在最后一次免疫后2周收集血清。血清中的ova特异性igg抗体通过间接elisa来测量。值以log2效价来显示。
表1：mdp-mn+ova、mpd+ova和单独的ova的igg效价
免疫系统产生所需量的对病原体/抗原特异性的抗体。这些产生的抗体中和病原体/抗原。真正的疫苗佐剂是这样的分子：其可以增加抗原特异性抗体的产生。上文数据示出在免疫后从小鼠收集的血清中的igg水平。相比于mdp+ova组，对于用包含15μg和30μg的mdp-mn的ova免疫的小鼠记录了最高的血清igg应答，并且mdp-mn在7.5μg浓度处示出几乎相等的抗体效价。
实施例-3.1.3：类似物对总igg1和igg2a的效果：
在第1天和第15天，用单独的ova100μg或用溶解在含类似物(7.5μg、15μg或30μg)的盐水中的ova100μg对雄性balb/c小鼠进行皮下免疫。在最后一次免疫后2周收集血清。血清中的总igg1和igg2a抗体通过夹心elisa(sandwichelisa)来测量。值以log2效价来显示。
表2：mdp-mn+ova、mdp+ova和单独的ova的igg1和igg2a效价
总igg亚型例如igg1和igg2a的测量对于评估产生的免疫的类型是有用的。在小鼠中，igg1与th2型应答整合，而th1型应答与igg2a抗体、igg2b抗体和igg3抗体的产生整合。抗体亚类对于补体结合(complementfixation)是不可缺少的，并提供保护。igg2a和igg2b可以比igg1更强地结合补体。示出宽的亚类分布的疫苗佐剂对于病原体是有益的。上文数据示出，15μg和30μg浓度的mdp-mn+ova组比mdp+ova组产生更高的igg2a应答，即th1型，并且还诱导比mdp+ova组显著的igg1应答，即th2型。
实施例3.1.4：类似物对来自ova免疫小鼠的脾细胞中的细胞因子水平的效果
在第1天和第15天，用溶解在含gmdp、mdp(15μg)和类似物(7.5μg、15μg或30μg)的盐水中的ova100μg对雄性balb/c小鼠进行皮下免疫。在最后一次免疫后2周制备脾细胞并在具有和不具有ova(20μg)的情况下培养持续48小时。通过夹心elisa来测量培养物上清液中的th1(il-2、il-12、ifn-γ和tnf-α)细胞因子和th2(il4)细胞因子。值以平均值±sd(n＝3)来显示。
表3：mdp+ova、mdp-mn+ova免疫的小鼠中的细胞因子水平。
由离体培养的细胞分泌的细胞因子将为抗体亚类确定提供支持。在抗原的存在下具有或不具有再刺激的离体培养的细胞将给出关于免疫记忆的基本思想。具有诱导带免疫记忆的适应性免疫的能力的疫苗佐剂可以用离体细胞培养物来鉴定。再刺激的培养物将记住抗原遭遇(antigenencounter)并产生大量的细胞因子th1和th2两者。促炎信号例如tnf-α的产生对于抵抗有效的病原体是重要的。此测定在免疫时间表的第28天进行，脾从处死的小鼠收集。在每个组中，细胞在具有或不具有抗原的情况下孵育，并且在48小时后测量上清液的细胞因子分泌。结果揭示，用15μg的mdp-mn+ova处理的小鼠已经示出较高的il-12和tnf-α，并且在30μg时示出比mdp+ova更高的tnf-α，并且mdp-mn+ova处理的小鼠中的il-2应答、il-4应答和ifn-γ应答与mdp+ova相同。较高的il-12分泌将活化树突细胞应答。树突细胞的活化是先天性免疫和适应性免疫的桥梁。mdp-mn+ova中的大量的tnf-α指示延迟的免疫应答。
实施例3.1.5：类似物对延迟型超敏(dth)反应的效果
用具有或不具有30μg的mdp和mdp+mn类似物的ova100μg/小鼠对三只雄性balb/c小鼠的组进行皮下免疫。在7天后，所有小鼠在两个足垫(footpad)处用ova50μg皮下注射。dth反应被表示为图4中呈现的在注射部位处足垫肿胀的百分比增加。
延迟型超敏反应通过t细胞介导。抗原呈递细胞活化t细胞以分泌细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化因子刺激血管内皮细胞以增强通透性并诱导在dth反应的部位处的吞噬细胞浸润和体液累积。增强抗原效果的疫苗佐剂将诱导更多的dth免疫反应。在本研究中，进行足垫dth模型。通常，足垫肿胀在抗原激发(antigenchallenge)后24-48小时达到峰值，并开始下坡过程。在mdp-mn+ova组中，已经在24小时示出峰值，并且观察到足垫肿胀的瞬时降低，然而mdp+ova已经示出多达7天比mdp-mn+ova少很多的肿胀。mdp-mn+ova的dth免疫应答支持上文实验中的脾细胞培养物的高量tnf-α释放。
实施例-3.2：与乙型肝炎抗原一起的佐剂效果的评估：
实施例-3.2.1：免疫：在第0天和第28天，用媒介物对照或者具有和不具有在磷酸盐缓冲盐水中稀释的mdp-mn(10μg/小鼠/剂量/100μl或50μg/小鼠/剂量/100μl或100μg/小鼠/剂量/100μl)的乙型肝炎抗原(20μg/小鼠/剂量/100μl，50μl/四头肌)对雌性balb/c小鼠(6-8周龄，n＝6/组)进行肌内疫苗接种(i.m，在两个四头肌处)。在免疫之前，在无菌条件下通过轻轻地搅动将乙型肝炎表面抗原与mdp-mn混合(1:1的比率)。在第42天，将小鼠抽血并安乐死。收集血液并且分离血清以评估分析抗原特异性总igg抗体效价(如在实施例3.1.2中)和抗体亚类(同种型也就是igg1或igg2a或igg3，如在实施例3.1.3中)。
实施例-3.2.2：通过elisa-酶联免疫吸附测定确定抗原特异性总igg的终点效价：
使用单个血清样品的连续稀释物(在从1:50至1:819200的范围内的4个稀释液)来通过elisa确定抗原特异性总igg抗体效价的终点效价。测定方案的细节如下文所描述的。
为了分析抗原特异性抗体效价，将乙型肝炎表面抗原悬浮在ph9.6的50mm碳酸盐碳酸氢盐缓冲液中，并以一定浓度(1μg/ml，100μl/孔)涂覆在96孔板中并保持在4℃持续过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(ph7.4的具有0.05％吐温的pbst-磷酸盐缓冲盐水)洗涤，并用封闭缓冲液(具有1％bsa的pbs)在rt封闭持续1-2小时。将elisa板用洗涤缓冲液(pbs，0.05％tweentm20)再次洗涤并添加来自超免疫的小鼠的连续稀释的(在pbs、0.1％bsa、0.05％tweentm20、0.02％叠氮化钠中)血清，并在rt孵育持续1小时。在孵育后，再次洗涤孔，并且添加1:5000的稀释度的山羊抗小鼠igghrp缀合物抗体并在rt孵育持续1小时。之后，洗涤孔，并用opd(邻苯二胺)作为底物来显色持续15分钟。使用2nh2so4停止反应。在490nm处读取吸收度。通过采取阴性对照(pbs)组的吸收度确定阈值(平均值+3sd)，随后是反应性指数(在特定稀释度的吸收度和阈值的比率)，以便确定终点效价。基于此计算，反应性指数值<1的最高稀释度被认为是终点抗体效价稀释度。在存在和不存在mdp-mn的情况下，抗原特异性抗体终点效价如图5a中所呈现的。在存在以10μg/小鼠的mdp-mn的情况下，hbsag特异性igg抗体效价示出与针对单独的hbsag获得的抗体效价(1:12800稀释度)相比类似的抗体效价。然而，在存在更高浓度的mdp-mn(即50μg/小鼠和100μg/小鼠)的情况下，分别示出与针对单独的hbsag抗体效价(1:12800稀释度)相比4倍(1:51200稀释度)的增加和8倍(1:204800稀释度)的增加。
类似地，mdp-mn还与疟疾抗原(rpvrii，间日疟原虫duffy结合蛋白区域ii，(chitnis,c.e.等人，(1994)j.exp.med.180，497-506))一起以10μg/小鼠测试。在存在和不存在mdp-mn的情况下，抗原特异性抗体终点效价如图5b中所代表的。在以10μg/小鼠的mdp-mn的存在下，rpvrii特异性igg抗体效价示出与针对单独的rpvrii的抗体效价(1:12800稀释度)相比4倍(1:51200稀释度)的增加。没有测试rpvrii特异性抗体同种型。
已知在针对给定的抗原免疫后产生的igg亚类主要确定抗体的功能或间接地测量th1型细胞因子诱导对th2型细胞因子诱导的相对贡献。更具体地，igg1抗体的产生诱导th2型细胞因子，而igg2a抗体和igg3抗体的产生诱导th1型细胞因子。因此，在本发明中，我们计划通过分析igg亚类确定在mdp-mn的存在下用hbsag在小鼠中接种疫苗后的th1极化、th2极化。在此情况下，在本发明中，我们确定在存在或不存在mdp-mn(10μg/小鼠和50μg/小鼠)的情况下针对hbsag升高的igg同种型(igg1、igg2a和igg3)的水平，并计算th1:th2指数，然后计算为([igg2a+igg3]/2)/(igg1)。测定方案的细节如下文如在实施例3.1.3中所描述的。根据这样的计算，指数值<1代表th2极化；指数值>1代表th1极化。
实施例-3.2.3：th1:th2指数的确定：抗原特异性igg抗体亚类(同种型也就是igg1或igg2a或igg3)的分析如实施例3.1.2中所提到的进行，除了一个步骤，其中使用1:5000的稀释度的山羊抗小鼠igg1或igg2a或igg3hrp(替代山羊抗小鼠igg)，以10μg/小鼠和50μg/小鼠的mdp-mn获得的th1:th2指数如图5c中所示出的。结果指示，在mdp-mn的存在下，hbsag还诱导th1型细胞因子，th1:th2指数值<1(2.5)，而单独的hbsag诱导th2型细胞因子，th1:th2指数小于1(0.5)。
在mdp-mn的存在下用重组乙型肝炎表面抗原接种疫苗的小鼠不仅增加(4-8倍，剂量依赖性增加)体液应答(th2)，而且还诱导th1型细胞因子。因此，得出结论，本发明的化合物具有优良的药理学活性，特别是佐剂活性。因此，mdp-mn可用作疫苗制剂中的佐剂。尽管在本研究中用hbsag与mdp-mn一起测试，但包含本发明化合物mdp-mn的佐剂化疫苗制剂(adjuvanatedvaccineformulation)还扩展到其他疫苗抗原以及前述段落中已经提到的疫苗抗原。
实施例-4：体内评估mdp-mn的细胞毒性
已经发现，本发明的化合物mdp-mn的特征是少得多的副作用，并因此被耐受多达100μg/大鼠。此特别有益的性质通过使用大鼠作为动物模型进行的最大耐受剂量测试来证明。
最大耐受剂量测试：对wistar大鼠(n＝6，3m和3f)用以递增的方式包含10μg/动物/200μl、50μg/动物/200μl和100μg/动物/200μl的固定佐剂剂量的mdp-mn来肌内(i.m)施用。每天观察动物的临床体征和死亡率持续14天的时间段。每天测量体重。还每天监测动物消耗的食物和水的任何异常情况，并且还计算每只动物的食物和水摄取。测量体温，每4小时直至24小时，之后每天一次直至7天，并然后每隔一天直至第14天。将大鼠在第14天处死，并收集器官/组织例如注射部位、脾、胸腺、脑、肺、心脏、肝、肾，并进行宏观检查。在上文提及的器官上没有发现明显的损伤或异常。在此我们发现，即使在测试的高剂量(100μg/动物)，不存在死亡并且没有观察到明显的临床体征。然而，相比于未经处理的动物增加的体重，那些接受高剂量的动物的体重增加较小，而那些接受10μg和50μg的动物的体重增加类似于未经处理的动物。在任何动物中多达14天不存在温度升高。这指示，即使在高剂量(100μg/动物)，大鼠也是可耐受的。用在注射后24-36小时之间收集的血液测试crp水平。发现即使在高剂量(100μg/动物)，crp水平也是正常的(大鼠中的正常crp水平为200-550μg/ml)。上文提及的结果指示，mdp-mn示出即使在100μg/动物也是可耐受的。此外，在不存在促炎性细胞因子的情况下，crp水平指示mdp-mn不是热原性的。
在mdp-mn的存在下用乙型肝炎表面抗原接种疫苗的小鼠不仅增加(4-8倍，剂量依赖性增加)体液应答(th2)，而且还诱导th1型细胞因子。因此，我们得出结论，本发明的本发明类似物‘mdp-mn’具有优良的药理学活性，特别是用于用作疫苗制剂中的佐剂的佐剂活性。