一种土木香叶提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及天然物质的提取技术领域，更具体而言，涉及一种具有多种生物活性的土木香叶提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

土木香(Inula helenium L.)为菊科(Compositae)旋覆花属植物，多年生草本，根供药用。菊科旋覆花属(Inula L.)植物全世界约有100种，分布于欧洲、亚洲及非洲，以地中海地区为主，我国有20余种和多种变种。本属多种植物常供药用，倍半萜类化学成分是本属植物的特征性成分，以桉烷型、吉马烷型和愈创木烷型倍半萜为主。土木香在古方中常用于祛痰、镇咳和抗菌。近年来国内外对土木香化学成分及药理活性研究发现倍半萜内酯类成分有抗肿瘤细胞增殖作用和抗结核分支杆菌等作用。每年秋天，药农采收土木香根时，大量的土木香叶都被遗弃。土木香叶的湿重占土木香植株60％以上，为了充分利用土木香植物资源，对土木香叶活性进行深入研究，具有巨大的社会效益和经济效益。

技术实现要素：

本发明的目的是为了充分利用土木香叶资源，提供一种土木香叶提取物及其在抗癌、抗炎和抗微生物方面的应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种土木香叶提取物，包含质量百分比不低于10％的土木香内酯和不低于5％的异土木香内酯。

它是通过以下方法制备得到：取干燥的土木香叶，粉碎，有机溶媒提取，合并提取液，蒸去溶剂，得土木香叶提取物。

作为优选，所述的有机溶媒包括有机溶剂：无水甲醇、含水体积比为1-30％的甲醇、无水乙醇、含水体积比为1-30％的乙醇、石油醚、环己烷中的任意一种，以及二氧化碳超临界流体。

作为优选，所述的提取方法包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法以及超临界流体提取法中的任意一种。

作为优选，本发明所述的制备土木香叶提取物的具体步骤为：取干燥的土木香叶，粉碎，加4-8倍量有机溶剂，提取2-5次，每次1-3小时，合并提取液，蒸去溶剂，得土木香叶提取物。

作为优选，本发明所述的制备土木香叶提取物的具体步骤为：取干燥的土木香叶，粉碎，采用二氧化碳超临界流体提取，得到土木香叶提取物；其中二氧化碳超临界流体提取的条件为：提取压力15-35Mpa，提取温度35-65℃，提取时间15-90min。

本发明通过MTT法检测土木香叶提取物对各种肿瘤细胞的增殖抑制作用，验证了其具有抗肿瘤活性。

本发明通过检测土木香叶提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用，验证了其具有抗炎活性。

本发明通过检测土木香叶提取物对细菌或真菌的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)，验证了其具有抗微生物活性。

进一步地，本发明提供所述的土木香叶提取物在制备抗肿瘤制剂中的应用。

进一步地，本发明提供所述的土木香叶提取物在制备抗炎制剂中的应用。

进一步地，本发明提供所述的土木香叶提取物在制备抗微生物制剂中的应用。

本发明还提供一种抗肿瘤制剂，由有效剂量的本发明所述的土木香叶提取物和药学上可接受的辅料制成。

本发明还提供一种抗炎制剂，由有效剂量的本发明所述的土木香叶提取物和药学上可接受的辅料制成。

本发明还提供一种抗微生物制剂，由有效剂量的本发明所述的土木香叶提取物和药学上可接受的辅料制成。

优选的，以上制剂为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、丸剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、贴膏剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、酒剂、膏药、茶剂、流浸膏剂和浸膏剂中的任意一种。

本发明提供的土木香叶提取物具有以下优点：

本发明提供的土木香叶提取物，在充分利用中药土木香植物资源基础上，变废为宝，开发出土木香新的药用资源，其抗癌、抗炎和抗微生物活性强，可开发成为新的抗癌、抗炎和抗微生物的药物，且本发明提供的土木香叶的提取物可以制备成多种剂型，方便使用。

附图说明

图1为土木香内酯对照品和异土木香内酯对照品的GC图谱；

图2为本发明实施例1所述土木香叶提取物的GC图谱；

图3为本发明实施例2所述土木香叶提取物的GC图谱；

图4为本发明实施例3所述土木香叶提取物的GC图谱；

图5为本发明实施例4所述土木香叶提取物的GC图谱；

具体实施方式

本发明实施例公开了一种土木香叶提取物及其在抗肿瘤、抗炎、抗微生物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改进对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

【实施例1】土木香叶提取物

一种具有多种生物活性的土木香叶提取物，它是通过以下方法制备得到：取干燥的土木香叶，粉碎，加4倍量石油醚，回流提取2次，每次1小时，合并提取液，蒸去石油醚溶剂，得土木香叶提取物。

该土木香叶提取物中土木香内酯和异土木香内酯含量测定：参照2015版《中国药典》记载的气相色谱法(通则0521)测定。

色谱条件：Agilent 6890N气相色谱仪；聚乙二醇20000(PEG-20M)毛细管柱(柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm)；载气为氦气；分流比为10:1；程序升温：初始温度190℃，保持30分钟，以每分钟120℃的速率升温至240℃，保持5分钟；进样口温度为260℃；检测器温度为280℃。

对照品溶液的制备：取土木香内酯对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：110760-200507)和异土木香内酯对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：110761-200204)适量，精密称定，加入二氯甲烷，制成每1mL各含1mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密称定约50mg实施例1所得土木香叶提取物干燥粉末，精密加入二氯甲烷5mL，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入气相色谱仪，测定，即得。

测得，该土木香叶提取物含16.42％土木香内酯和13.91％异土木香内酯。实施例1所得土木香叶提取物的GC图谱见图2；土木香内酯对照品和异土木香内酯对照品的GC图谱见图1。

【实施例2】土木香叶提取物

一种具有多种生物活性的土木香叶提取物，它是通过以下方法制备得到：取干燥的土木香叶，粉碎，加8倍量石油醚，回流提取5次，每次3小时，合并提取液，蒸去石油醚溶剂，得土木香叶提取物。

参照实施例1描述的土木香叶提取物中土木香内酯和异土木香内酯的含量测定方法，测得，实施例2所得土木香叶提取物含20.26％土木香内酯和17.57％异土木香内酯。实施例2所得土木香叶提取物的GC图谱见图3。

【实施例3】土木香叶提取物

一种具有多种生物活性的土木香叶提取物，它是通过以下方法制备得到：取干燥的土木香叶，粉碎，采用二氧化碳超临界流体提取，得到土木香叶提取物，其中，二氧化碳超临界流体提取的条件为：提取压力15Mpa，提取温度35℃，提取时间15min。

参照实施例1描述的土木香叶提取物中土木香内酯和异土木香内酯的含量测定方法，测得，实施例3所得土木香叶提取物含25.46％土木香内酯和20.18％异土木香内酯。实施例3所得土木香叶提取物的GC图谱见图4。

【实施例4】土木香叶提取物

一种具有多种生物活性的土木香叶提取物，它是通过以下方法制备得到：取干燥的土木香叶，粉碎，采用二氧化碳超临界流体提取，得到土木香叶提取物，其中，二氧化碳超临界流体提取的条件为：提取压力35Mpa，提取温度65℃，提取时间90min。

参照实施例1描述的土木香叶提取物中土木香内酯和异土木香内酯的含量测定方法，测得，实施例4所得土木香叶提取物含28.76％土木香内酯和22.67％异土木香内酯。实施例4所得土木香叶提取物的GC图谱见图5。

【实施例5】将实施例1和3制备得到的土木香叶提取物进行体外抗肿瘤活性验证。

实验方法：肿瘤细胞培养于含10％小牛血清、青霉素和链霉素培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。取对数生长期细胞进行增殖抑制实验。用MTT法检测提取物对各种肿瘤细胞的增殖抑制作用，其对肿瘤细胞生长抑制率实验结果：见表1。

表1：实施例1和3所得到的土木香叶提取物对上述5种肿瘤细胞的抑制率

【实施例6】将实施例1和3制备得到的土木香叶提取物进行体外抗炎活性验证。

细胞株：RAW 264.7小鼠巨噬细胞

实验方法：按常规复苏细胞并且传代培养，使用DMEM，10％PBS，l％双抗的完全培养基，接种细胞到96孔细胞培养板，置于5％CO₂培养箱于37℃培养48小时，加入LPS，诱导4小时，对检测数据进行统计分析，以确定提取物预处理对于LPS诱导的炎症反应是否具有抑制作用。

实验结果：见表2。

表2：实施例1和3所得到的提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用。

【实施例7】将实施例1和3制备得到的土木香叶提取物进行体外抗菌活性验证。

实验方法：将该提取物溶于PBS缓冲液制成储备液，然后用二倍稀释法接种试验细菌和真菌，细菌37℃恒温培养24小时，真菌28℃恒温培养48小时后，观察结果，找出阻止细菌生长的最低药物浓度，即为最低抑菌浓度(MIC)。在MIC的基础上，继续将此菌液接种于无菌培养基上培养，活菌计数法计算菌落数，平均菌落数小于5个的药物浓度即为最低杀菌浓度(MBC)。

实验结果：见表3。

表3：提取物对各菌株的MIC(μg/mL)和MBC(μg/mL)

本发明充分利用土木香资源，变废为宝，通过对土木香叶提取物的生物活性实验筛选，去粗存精，制备得到具有生物活性的土木香叶的提取物，实验结果表明，本发明提供的土木香叶的提取物抗癌、抗炎和抗微生物活性强，具有重要的经济效应。该提取物可与药学上允许的辅料制备成包括但不仅限于片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、丸剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、贴膏剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、酒剂、膏药、茶剂、流浸膏剂和浸膏剂。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。