狭长孢灵芝总三萜提取物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种真菌提取物，具体地说，涉及狭长孢灵芝总三萜提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

灵芝(ganodermalucidum(leyss.exfr.)karst.)隶属于真菌门(eumycota)、担子菌亚门(basidiomycotina)、层菌纲(hymenomycetes)、非褶菌目(aphyllophorales)、灵芝科(gamodermataceae)、灵芝属(ganoderma)类。《中华本草》中记录“其性甘；味平；无毒；归肺、心、脾、肾经。益气血；安心神；健脾胃。主治虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、矽肺、肿瘤。”《中国药典》中将灵芝收录为中药材，其中的灵芝多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质的主要基础，以三萜和多糖为其中主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗hiv-4及hiv-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。

灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。狭长孢灵芝ganoderma.boninense隶属于担子菌门(basidiomycota)，伞菌亚门(agaricomycotina)，伞菌纲(agaricomycetes)，多孔菌目(polyporales)，灵芝科(ganodermataceae)，灵芝属(ganoderma)，该菌寄生于棕榈科植物，曾有文献报道其子实体提取物具有抗肿瘤生物活性，但没有检索到对调节机体免疫力方面的报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供狭长孢灵芝总三萜提取物及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了狭长孢灵芝(ganodermaboninense)总三萜提取物，其制备方法包括如下步骤：

1)以狭长孢灵芝子实体为原料，粉碎后按照一定比例加入有机溶剂浸泡2～10小时，浸泡后回流1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；

2)对提取液进行减压浓缩，获取狭长孢灵芝提取物；

3)用有机溶剂对狭长孢灵芝提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和不同浓度的有机溶剂对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；

4)收集洗脱液，浓缩获得狭长孢灵芝总三萜提取物。

所得的狭长孢灵芝(ganodermaboninense)总三萜提取物中含有狭长孢灵芝酮e(图2所示1)、狭长孢灵芝酮f(图2所示2)、狭长孢灵芝缩酮a(图2所示3)、狭长孢灵芝缩酮f(图2所示4)。

进一步地，步骤1)中所述溶剂为水、70％v/v～100％v/v的甲醇、70％v/v～95％v/v的乙醇、100％v/v的乙酸乙酯、100％v/v的丙酮或100％v/v的二氯甲烷。

进一步地，步骤1)中所述子实体与所述溶剂的质液比为1:3～1:10(w/v)。

进一步地，步骤2)中减压浓缩时，醇提取液浓缩温度为35～60℃。

步骤3)中加热超声溶解的温度为60～80℃。

进一步地，步骤3)中所述有机溶剂为70％v/v～100％v/v的甲醇、70％v/v～95％v/v的乙醇、100％v/v的乙酸乙酯、100％v/v的丙酮或100％v/v的二氯甲烷。

进一步地，步骤3)中大孔树脂可以是极性、中等极性、弱极性或非极性大孔树脂。

进一步地，步骤3)中用水和浓度分别为50％v/v、70％v/v、100％v/v的甲醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；

或用水和浓度分别为50％v/v、75％v/v、95％v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；

或用水和浓度分别为50％v/v、70％v/v、90％v/v的丙酮溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；

进一步地，步骤4)收集70％v/v和100％v/v的甲醇、75％v/v和95％v/v的乙醇或70％v/v和90％v/v的丙酮洗脱液。。

第二方面，本发明提供一种狭长孢灵芝(ganodermaboninense)总三萜的提取方法，包括如下步骤：

1)以狭长孢灵芝的子实体为原料，粉碎后加入溶剂浸泡2～10小时，浸泡后回流提取1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；

2)对提取液进行减压浓缩，获取狭长孢灵芝提取物；

3)用有机溶剂对狭长孢灵芝提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附2小时以上，用水和不同浓度的有机溶剂对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；

4)收集洗脱液，浓缩获得狭长孢灵芝总三萜提取物。

作为优选，本发明提供了一种较佳的提取方法，按照该方法提取得到的提取物具有更优的活性和/或功效。

所述优选的提取方法具体包括如下步骤：

1)以狭长孢灵芝子实体为原料，粉碎后按照狭长孢灵芝和有机溶剂的重量比为1：(5～6)的比例加入乙酸乙酯浸泡2-5小时，浸泡后回流1-3次，每次提取2-3小时，过滤收集提取液；

2)在35～60℃，对提取液进行减压浓缩，获取狭长孢灵芝提取物；

3)在60-80摄氏度的温度范围内，用100％v/v的甲醇对狭长孢灵芝提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液以5ml/min的速度滴加到装有d101或ab-8大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和50％v/v、75％v/v、95％v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，且每一个浓度洗脱3-5个保留体积；

4)收集70％和95％的乙醇洗脱液，浓缩获得狭长孢灵芝总三萜。

第三方面，本发明提供了狭长孢灵芝总三萜提取物在制备调节机体免疫力的药物或食品中的应用。

所述狭长孢灵芝总三萜提取物为含有狭长孢灵芝酮e(图2所示1)、狭长孢灵芝酮f(图2所示2)、狭长孢灵芝缩酮a(图2所示3)和狭长孢灵芝缩酮f(图2所示4)的混合物。

优选为前述狭长孢灵芝总三萜提取物，或按照前述提取方法得到的狭长孢灵芝总三萜提取物。

调节机体免疫力是指提高正常机体ifn-γ，il-2，tnf-α等免疫因子的水平，增强机体免疫功能，也可指提高免疫抑制患者的ifn-γ，il-2，tnf-α等免疫因子的水平，增强机体免疫功能，也包括提高放化疗引起的白细胞降低等；也可指抑制免疫亢进患者的抗自身抗体和总igg水平，也包括对红斑狼疮类疾病的治疗/辅助治疗作用。

第四方面，本发明提供了含有前述狭长孢灵芝总三萜提取物或由其制备的药物组合物或可食用的产品。

所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的辅料。所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、缓释剂等。

所述药物组合物可为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂等剂型。各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。所述药物组合物可通过口服、胃肠内给药、注射、喷射、物理或化学介导等方法给药，或是被其他物质混合或包裹后给药。

所述药物组合物同样具有调节机体免疫力的作用。

所述可食用的产品可用于例如日常保健、以及调节机体免疫力相关方面的预防和辅助治疗。具体形式可为口服液、茶饮、含片、胶囊、饮品、泡腾片等等。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明以狭长孢灵芝(ganodermaboninense)为研究对象，对狭长孢灵芝总三萜提取物进行了提取工艺和生物活性研究，发现狭长孢灵芝总三萜提取物能够有效的调节机体免疫力，对机体具有多方面的保健和调节作用，具有很好的药用和食用价值。

本发明研究发现，狭长孢灵芝可采用任何常规的溶剂，包括水进行提取，提取方法简单，提取物可溶于水。提取物中含有较大量的三萜类化合物，并经验证具有调节机体免疫力的作用。因此，狭长孢灵芝总三萜的提取物具有广阔的药用和食用的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2所述的狭长孢灵芝总三萜提取物gb-1的hplc图谱。

图2为狭长孢灵芝酮e(图2所示1)、狭长孢灵芝酮f(图2所示2)、狭长孢灵芝缩酮a(图2所示3)和狭长孢灵芝缩酮f(图2所示4)的结构式。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

狭长孢灵芝子实体采集自海南清澜自然保护区，经中国科学院微生物研究所姚一建研究员鉴定为ganodermaboninense。

实施例1狭长孢灵芝总三萜提取物的制备

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)体积百分含量100％的乙酸乙酯浸泡3小时，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到15.5克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用100％甲醇在60℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％乙醇、95％乙醇洗脱液浓缩后，合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-14.2g，计算收率为1.05％。

香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定总三萜含量：

5％香草醛-冰醋酸溶液：取香草醛0.5g，用适量冰醋酸溶解并转入容量瓶中，冰醋酸定容至10ml，摇匀，现配现用。

齐墩果酸对照品溶液：精密称取齐墩果酸12.0mg，甲醇定容100ml容量瓶中，得到0.12mg/ml的齐墩果酸对照品溶液。

测定方法：使用分光光度计测定样品中总三萜含量：精密吸取齐墩果酸对照品0,0.2,0.4,0.6,0.8,1ml，60摄氏度水浴加热，除掉溶剂。分别加入新鲜配制的香草醛-冰醋酸溶液0.3ml和1ml高氯酸，摇匀，60摄氏度水浴下反应20分钟，冰水冷却，加入5ml冰醋酸，摇匀，空白溶剂作参比，548nm测定吸光度，以齐墩果酸对照品的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图得到标准曲线，并利用其计算狭长孢灵芝总三萜提取物中总三萜含量。

香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-1中总三萜含量为64.3％。

实施例2狭长孢灵芝总三萜提取物的指纹图谱检测

高效液相化学指纹图谱分析条件如下：使用agilent1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，dad检测器，agilent色谱工作站。色谱柱ymcc8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈-体积百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，温度室温(20～30℃)的条件下进行梯度洗脱(洗脱程序以及各成分的体积百分含量如下所示)，流速1.00ml/min。将粗提物gb用乙腈溶解，配成10mg/ml的溶液，进样量10μl，紫外检测波长为210nm。

梯度洗脱步骤如下表所示：

按照上述洗脱条件得到提取物gb-1的hplc图谱如图1所示。

实施例3用乙醇提取狭长孢灵芝总三萜

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)体积百分含量95％乙醇的水溶液浸泡2小时，回流提取2次，每次2小时。合并提取液，在45℃下减压浓缩干燥得到14.6克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用95％乙醇在60℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％乙醇、95％乙醇洗脱液浓缩后合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-23.8g，计算收率为0.95％。香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-2中总三萜含量为65.7％。

实施例4用甲醇提取狭长孢灵芝总三萜

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)体积百分含量100％甲醇浸泡2小时，回流提取2次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到15.8克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用100％甲醇在60℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％甲醇、100％甲醇洗脱液浓缩后合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-34.2g，计算收率为1.05％。香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-3中总三萜含量为61.2％。

实施例5用二氯甲烷提取狭长孢灵芝总三萜

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)体积百分含量100％的二氯甲烷浸泡2小时，回流提取2次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到14.8克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用100％甲醇在70℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％甲醇、100％甲醇洗脱液浓缩后合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-44.0g，计算收率为1.0％。香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-4中总三萜含量为63.3％。

实施例6用丙酮提取狭长孢灵芝总三萜

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)体积百分含量100％的丙酮浸泡2小时，回流提取2次，每次2小时。合并提取液，在45℃下减压浓缩干燥得到15.1克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用100％甲醇在60℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％丙酮、70％丙酮、90％丙酮进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％丙酮、90％丙酮洗脱液浓缩后合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-53.9g，计算收率为0.98％，香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-5中总三萜含量为63.1％。

实施例7用水提取狭长孢灵芝总三萜

将狭长孢灵芝子实体剪碎，称重400克。用2l(5倍量)水浸泡2小时，回流提取2次，每次2小时。合并提取液，在45℃℃下减压浓缩干燥得到25.8克狭长孢灵芝提取物。将狭长孢灵芝提取物用水在60℃下加热超声溶解，以5ml/min速度将样品溶液滴加在d101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70％甲醇、100％甲醇洗脱液浓缩后合并得到狭长孢灵芝总三萜提取物gb-62.2g，计算收率为0.55％。香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得狭长孢灵芝总三萜提取物gb-6中总三萜含量为61.3％。

实施例8狭长孢灵芝总三萜提取物提高免疫力的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例3～7所述的6个提取物(gb-1～gb-6)。分别用0.5％cmc-na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。体重18-22g雄性清洁级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。

方法：80只小鼠给药24小时后随机分为8组：6个给药组、阳性对照组和正常对照组，每组10只。各给药组分别灌胃给予0.1ml的100mg/ml提取物溶液，阳性对照组灌胃给予0.1ml的20mg/ml西咪替丁，正常对照组给予0.1ml的0.5％cmc-na溶液。连续给药15天，末次给药1小时后，处死，心脏取血、脾脏、胸腺。阳性对照药物选择西咪替丁，西咪替丁是一种组胺拮抗剂，通过与ts细胞的h2受体结合，阻止组胺对ts细胞的活化作用，增强机体的免疫力。

胸腺指数＝胸腺/体重×100％

脾脏指数＝脾脏/体重×100％

il-2、tnf-α、ifn-γ按照试剂盒进行操作。

结果：与模型组比较，狭长孢灵芝总三萜提取物对脾脏和胸腺都有一定的保护作用，另外可提高正常小鼠ifn-γ，il-2，tnf-α的含量，具有一定的提高机体免疫力功能，结果见表1。

表1

*p<0.05，**p<0.01与正常对照组相比。

实施例9狭长孢灵芝总三萜提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例3～7所述的6个提取物(gb-1～gb-6)。分别用0.5％cmc-na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。体重18-22g雄性清洁级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。

方法：90只小鼠给药24小时后随机分为9组：6个给药组、阳性对照组、模型对照组和正常对照组，每组10只。8组小鼠(除正常对照组外)连续三天腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，正常对照组小鼠不做处理。各组分别灌胃给予0.1ml的100mg/ml提取物溶液，阳性对照组灌胃给予0.1ml的100mg/ml香菇多糖溶液，模型组给予0.1ml的0.5％cmc-na溶液。连续给药10天，末次给药1小时后，处死，心脏取血、脾脏、胸腺。阳性对照药物选择香菇多糖，香菇多糖可以调节机体免疫功能，在临床上用作免疫增强剂。

胸腺指数＝胸腺/体重×100％

脾脏指数＝脾脏/体重×100％

il-2、tnf-α、ifn-γ按照试剂盒进行操作。

结果：与模型组比较，狭长孢灵芝总三萜提取物对脾脏和胸腺都有一定的保护作用，另外可逆转环磷酰胺所致的免疫抑制现象。结果见表2。

表2

*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。

实施例10狭长孢灵芝总三萜提取物对小鼠红斑狼疮样自身免疫反应亢进的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例3～7所述的6个提取物(gb-1～gb-6)。分别用0.5％cmc-na溶液配制10mg/ml溶液，供活性测试。2月龄雄性清洁级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。

佐剂的配置：液体石蜡高温灭菌后加入卡介苗(10g/l)混匀待用。

甲醛化空场弯曲菌悬液的制备：空肠弯曲菌cj-s131菌株，一次传代后挑取典型菌落，接种于c-bap选择性培养基，5％o2、85％n2、10％co2环境下，42摄氏度温育24小时，0.5％(v/v)甲醛生理盐水按照常规制备成细菌悬液，并将细菌悬液调整为a540nm值为1.25(相当于4*10¹²cfu/ml)

方法：100只小鼠给药随机分为10组：6个给药组、阳性对照组(强的松)、佐剂对照组、模型对照组和正常对照组，每组10只。各给药组分别灌胃给予0.2ml相应的提取物溶液(200mg/kg/d)，阳性对照组灌胃给予0.2ml的强的松溶液(4mg/kg/d)，佐剂对照组、模型对照组和正常对照组给予0.2ml的0.5％cmc-na溶液，连续给药4周。给药第一天，取上述细胞悬液和等量的佐剂混匀乳化，取50微升给小鼠足跖注射，正常对照组给等体积生理盐水，佐剂对照组给等体积佐剂。免疫后第三周，除正常及佐剂对照组，取上述细胞悬液0.2ml，小鼠尾静脉注射，加强免疫一次。小鼠致敏后4周末，测血清自身抗体水平，同时进行免疫学指标检测。

阳性对照药物选择强的松，强的松是糖皮质激素，具有很强抗炎和免疫抑制作用的药物，对许多非感染性炎症性疾病尤其是变态反应疾病有良好的治疗作用。

血清抗ssdna、dsdna、组蛋白抗体等检测：分别取dsdna50ug/ml、ssdna50ug/ml、组蛋白10ug/ml,100ul/孔加入96孔板，4摄氏度过夜18-24小时，第二天，弃上清，加洗涤液200ul/孔，洗涤3次。待测血清加抗体稀释液1:200稀释，100ul/孔，每个样品3个浮空，4摄氏度过夜。第三天，加洗涤液200ul/孔，洗涤5次。甩干，家羊抗小鼠igg-hrp(1:2000稀释)，100ul/孔，37摄氏度孵育2小时，加洗涤液200ul/孔，洗涤5次。甩干，底物溶液100ul/孔，37摄氏度孵育，30min显色后，加入2mol/l硫酸50ul/孔终止反应，492nm读取吸光值。总igg测定的步骤同上，取5ug/ml羊抗小鼠igg，100ul/孔加入到96孔板中，第二天加入待测稀释血清(1:150000)100ul/孔，地天加入羊抗小鼠igg-hrp(1:40000稀释)，100ul/孔，492nm读取吸光值。

模型对照组小鼠血清抗ssdna、抗dsdna、组蛋白自身抗体水平比正常对照组和佐剂对照组明显升高，给予狭长孢灵芝总三萜提取物组血清自身抗体水平没有明显升高，与模型组相比，明显降低。

与正常对照组相比，模型对照组和佐剂对照组小鼠血清总igg水平明显升高，给予狭长孢灵芝总三萜提取物能显著抑制小鼠血清总igg水平的升高。

表3

*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。