二苯乙烯苷在制备肥胖性高血压的治疗药物及保健品中的应用的制作方法

本发明涉及肥胖症相关的心血管疾病的候选药物，具体涉及二苯乙烯苷在治疗肥胖性高血压中的应用。

背景技术：

世界卫生组织将超重定义为体重指数(body mass index，BMI)大于25kg/m²，超过30kg/m²即为肥胖；而基于人种差异，国内指标分别为24kg/m²和28kg/m²。随着当代社会科学技术日益进步，人们的运动量减少，而饮食习惯和饮食结构却趋向愉悦口舌而有损健康，高糖、高脂、高热量食品逐渐占据饮食金字塔底层，导致超重和肥胖人数急剧增多。一项2014年5月发表在Lancet上，时间超过30年、有188个国家参与的最新流行病学研究的调查数据表明，全球肥胖或超重人群已经达到21亿人，几乎相当于30％的全球总人数。在中国，仅从1991年到2002年，超重人口增加了40％，而肥胖比例更是翻了1倍。超重和肥胖人群的健康状况已经并日益受到更多关注。本质上说，肥胖是由于能量代谢紊乱导致的脂肪堆积。超额的体重不但增加了心、肾、肺、血管系统等的负担，更易造成全身各系统功能紊乱，其中病死率最高的并发症是心脑血管病。肥胖被视为动脉粥样硬化相关心脑血管病发生的独立危险因素，例如，冠心病、高血压及脑卒中等。因此，肥胖所引起的上述疾病已成为世界卫生健康的主要威胁之一。由于心血管事件一旦发生即难于逆转，病死率高，所以早期发现心血管危险因素、早期实施干预一直是控制肥胖相关心血管疾病的重要策略。

肥胖与高脂血症、高胰岛素血症等密切相关，严重者可导致动脉粥样硬化、高血压等心脑血管疾病。研究表明，血管内皮功能障碍是上述病变的始动环节，是引起成人动脉粥样硬化的独立高危因素。鉴于其在临床上冠心病、脑血管病及外周血管病变发展中的核心作用，血管内皮功能障碍被认为是减少心血管疾病发病率和死亡率风险的重要的治疗靶标。研究表明，内皮功能障碍是由一系列复杂的遗传、环境和其它因素相互作用所引起，这些因素包括吸烟、活性氧自由基、脂质氧化、高血糖、高甘油三酯血症和切力应激等。这些因素单独或者相互协同作用可导致血管内皮细胞损伤、分泌功能异常、以及对舒张/收缩因子反应异常等，后者即构成血管内皮功能障碍。然而，尽管肥胖相关的血管内皮功能障碍一直是重点关注和研究的领域，但迄今为止，其诱发机制，尤其是分子病因学机制，尚未完全阐明。

自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，其所起的作用是正面还是负面，根据其所处微环境而各有不同，尚未完全阐明，值得关注。新近的研究已证实血管内皮细胞存在自噬现象。前期的研究结果表明，在幼年自发性高血压大鼠(SHR)中，过度自噬可能是诱发其微血管内皮功能障碍的重要原因之一(Am J Chin Med,2016)。此外，长期摄入必需脂肪酸α-亚麻酸(ALA)可通过抑制氧化应激而改善糖尿病性的内皮功能障碍(PLoS ONE,2013；Vasa,2013)。

中药何首乌在我国沿用已有上千年的历史，有补益精血、乌须发、补肝肾、强筋骨之效。2002年被卫生部列入“可用于保健食品的物品”名单。二苯乙烯苷(2,3,5,4’-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb中提取的主要有效成分(水溶性有效成分)，现代药理研究表明其具有较好的保护内皮、抗氧化、抗衰老、抗动脉粥样硬化作用。前期研究发现，TSG治疗能通过上调Akt/mTOR通路、抑制过度自噬部分恢复SHR的阻力血管内皮功能，但未能显著地降低其血压。

目前尚未见到TSG在治疗肥胖性高血压中的作用及机制的研究报道。TSG对肥胖状态下的血压升高和血管内皮功能障碍有何影响、其机制为何？这些问题尚不清楚。如能彻底阐明，将为应用TSG防治肥胖相关的心血管病提供理论依据，具有较为重要的公共卫生意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供二苯乙烯苷在制备肥胖性高血压的治疗药物及保健品中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

与正常对照组大鼠(Lean ZDF)相比，肥胖大鼠(ZDF)的收缩压升高，长期摄食或膳食补充二苯乙烯苷(TSG)则可降低ZDF大鼠的动脉血压，其作用机制包括：

1)TSG可改善ZDF大鼠的内皮依赖性血管舒张效应。

2)TSG可显著上调ZDF大鼠的阻力血管Akt/mTOR通路。

3)TSG可降低ZDF大鼠血管LC3II/I、Beclin1表达。

TSG具有降低肥胖性高血压个体的动脉血压的作用，可保护肥胖性高血压个体的血管内皮功能，能够用于制备肥胖性高血压的治疗药物或保健品。

本发明的有益效果体现在：

本发明经过对血压明显升高的肥胖大鼠膳食性补充二苯乙烯苷实验测试，发现二苯乙烯苷具有降低肥胖大鼠收缩压和平均动脉压的作用，能够用于制备肥胖性高血压的治疗药物或保健品，具有良好的研究与应用前景，为肥胖患者进行早期有效的血压干预，从而预防肥胖症心脑血管并发症的发生发展提供新的防治策略和实验证据。

本发明通过实验研究，发现二苯乙烯苷可下调血管LC3II/I、Beclin1表达，并改善血管内皮功能、降低其收缩压和平均动脉压，表明二苯乙烯苷可通过抑制过度自噬来改善阻力血管功能，从而改善肥胖性高血压。

附图说明

图1为二苯乙烯苷(TSG)分子结构图示。

图2为肥胖大鼠长期摄食二苯乙烯苷降低动脉血压升高的结果；(A)二苯乙烯苷对大鼠收缩压的影响；(B)二苯乙烯苷对大鼠舒张压的影响；(C)二苯乙烯苷对大鼠平均动脉压的影响。其中，**P<0.01,***P<0.001vs Lean组；^#P<0.05,##P<0.01vs ZDF组。

图3为二苯乙烯苷改善肥胖大鼠的内皮依赖性血管舒张效应的结果；(A)ACh诱导的血管舒张效应；(B)SNP诱导的血管舒张效应。其中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs Lean组；^#P<0.05,###P<0.001vs ZDF组，n＝6。

图4为二苯乙烯苷抑制肥胖大鼠肠系膜微血管组织LC3II/I、Beclin1表达并增强Akt、mTOR磷酸化水平的结果；(A)各组大鼠肠系膜微动脉的Western blot结果，p-Akt、p-mTOR分别表示Akt总蛋白、mTOR总蛋白中相应磷酸化蛋白，β-Actin为内参；(B)二苯乙烯苷提高肥胖大鼠血管组织Akt、mTOR的磷酸化水平的结果，其中，*P<0.05，**P<0.01vs Lean组；^#P<0.05,^##P<0.01vs ZDF组；(C)二苯乙烯苷降低肥胖大鼠血管组织LC3II/I、Beclin1的表达的结果，其中，**P<0.01vs Lean组；^#P<0.05vs ZDF组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

超重/肥胖是心脑血管疾病的独立危险因素，且发生率日益增高，已成为重大的社会健康问题。通过围绕肥胖状态下内皮功能障碍与高血压的发生机制及防治策略进行的研究，前期发现Akt/mTOR信号受损诱导过度自噬可能是促发幼年自发性高血压大鼠微血管内皮功能障碍的原因，提示自噬与血管功能障碍及高血压的可能关系(Am J Chin Med,2016)。最新的实验结果证实，与正常对照组大鼠(Lean ZDF)相比，肥胖大鼠(ZDF)肠系膜微动脉的自噬启动和调节关键蛋白beclin1、自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的水平均增高，结果提示，肥胖状态下的血管内皮细胞发生自噬，从而可能在促发血管内皮功能障碍中起到作用。

本发明中，通过研究证实，在肥胖动物模型膳食补充TSG，可通过上调Akt/mTOR通路、抑制过度自噬部分恢复微血管内皮功能。进一步研究证实，且可显著降低肥胖状态下的收缩压和平均动脉压，提示TSG确可通过抑制血管过度自噬而治疗肥胖型高血压，具体研究及结果如下：

1、摄食TSG对ZDF大鼠血压的影响实验：

采用雄性ZDF大鼠及年龄性别匹配的正常血压Lean ZDF大鼠。实验动物共分为3组(n＝6)：①正常对照组(Lean组)：雄性Lean ZDF大鼠，普通饲料喂养，每日灌胃生理盐水。②雄性肥胖大鼠组(ZDF组)：雄性ZDF大鼠，高脂饲料喂养，每日灌胃生理盐水。③雄性肥胖大鼠二苯乙烯苷灌胃组(ZDF+TSG组)：雄性ZDF大鼠，高脂饲料喂养，灌胃TSG(100mg/kg/day，TSG参见图1)。2周后，大鼠禁食12h，清醒、安静状态下，用Softron BP-98A大小鼠无创血压仪测量大鼠尾动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，测量前大鼠在39℃加热套中适应10min左右，连续测量3次，计算平均值；根据收缩压(SBP)和舒张压(DBP)计算平均动脉压(MBP)。结果显示，TSG可显著降低ZDF大鼠的收缩压，提示肥胖状态下膳食补充TSG可延缓ZDF大鼠动脉血压升高，参见图2。

2、肠系膜微动脉分离及功能检测实验：

灌胃TSG处理结束后，称重，30mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，动物深度麻醉后仰卧位固定于手术操作台上，剪开腹腔，迅速取出肠系膜微动脉，置于0℃预冷的PSS缓冲液中，在体式显微镜下分离血管周围脂肪及结缔组织，并小心避免损伤血管内皮，然后截取长约1mm的血管环(3-4个血管环/动物)。生理盐溶液[physiologic salt solution,PSS(mM):NaCl 119.0,KCl 4.7,NaHCO₃ 25.0,MgSO₄ 1.2,KH₂PO₄ 1.2,CaCl₂ 2.5,Glucose5.5,EDTA 0.026,pH 7.4]预先置于37℃恒温水浴加热；在微血管灌流仪的灌流槽中加入预热的PSS液5mL，持续通入含95％O₂和5％CO₂混合气体，保持37℃恒温。在血管环中穿入两根直径40μm的不锈钢丝，移入微血管灌流仪的灌流槽中，一根钢丝连接张力换能器，另一根连张力调节器(调节负荷张力)，通过硬件PowerLab 8通道桥式放大器和软件LabChart8.0显示血管负荷张力于计算机屏幕。调节血管环静息负荷2mN，平衡60min，平衡时每20min换液。高钾(60mM)溶液使血管预收缩2次，弃用活性差的血管，血管收缩反应平台后，用37℃PSS液清洗灌流槽3次，每次10min。加入10^-6mol/L苯肾上腺素(PE)引起血管收缩，平台后浓度累加法加入ACh(乙酰胆碱，一种内皮依赖性血管舒张因子，累积浓度为10^-11-10^-6mol/L),以观察内皮依赖性舒张反应，或SNP(S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺，一种内皮非依赖性血管舒张因子，累积浓度为10^-10-10^-5mol/L)以观察非内皮依赖性舒张反应，或TSG(累积浓度为10^-9-10^-3mol/L)，各次给药结束后用预热的PSS液冲洗3次，每次10min；PE的预收缩幅度为100％，舒张率(％)＝药物引发的舒张张力/PE的预收缩张力×100％，从而评定血管内皮的功能。实验结果显示，与Lean ZDF大鼠相比，ZDF大鼠对ACh诱导的内皮依赖性血管舒张效应明显下降，表明其血管内皮功能受损；给予TSG两周可改善ACh诱导的血管舒张效应，而SNP诱导的内皮非依赖性血管舒张效应在Lean ZDF大鼠和ZDF大鼠中并没有显著差异。这一现象说明在ZDF大鼠中，影响血管功能并进一步升高动脉血压的重要因素之一可能是受损的血管内皮，而给予TSG治疗后可部分逆转这一过程，恢复内皮依赖性血管舒张功能，并发挥降血压功效，参见图3。

3、Western Blotting检测大鼠血管组织LC3II/I、Beclin1、Akt/mTOR信号通路表达水平实验：

大鼠血管组织用0℃PBS(pH 7.4)清洗，称重后移入预冷的RIPA裂解液中剪碎。于冰上组织匀浆30s，12000×g 4℃离心10min，取上清。BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。加入5×SDS上样缓冲液煮沸10min，冷却后离心分装，-80℃保存。蛋白样品行SDS-PGEA电泳，6％浓缩胶，12％分离胶，每孔上样30μg蛋白，第一阶段恒压90V 30min，第二阶段恒压150V至溴酚蓝跑至分离胶最前端，停止电泳。用湿转法恒流300mA 90min将凝胶转移到PVDF膜上。转移后的PVDF膜放入5％脱脂奶粉室温封闭1h。用anti-beclin1(1:1000)、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ(1:1000)、anti-pAkt(1:1000)、anti-Akt(1:1000)、anti-pmTOR(1:1000)、anti-mTOR(1:1000)及anti-βactin(1:1000)孵育PVDF膜，4℃过夜；孵育结束后PBST缓冲液清洗，用HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000)室温孵育60min，PBST缓冲液清洗，1:1混合ECL发光检测A液和B液，凝胶成像系统进行化学发光检测。结果显示，膳食补充TSG后，ZDF大鼠肠系膜微动脉中表达的自噬启动和调节关键蛋白LC3II/I、Beclin1水平均降低，Akt和mTOR磷酸化水平增加。以往的研究发现，Akt/mTOR信号通路、AMPK信号通路、MAPK/ERK1/2信号通路都能调节自噬，其中Akt/mTOR信号通路起到关键的调节作用。Akt/mTOR是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化等调节，该通路的活化可抑制细胞凋亡及细胞自噬，促进细胞周期进展。本研究的结果表明Akt/mTOR信号增强介导的自噬蛋白LC3II/I、Beclin1下调可能参与了TSG改善血管内皮功能、进而降低动脉血压的作用，参见图4。

本发明通过实验研究发现肥胖大鼠进行TSG膳食补充可改善血管内皮功能，降低动脉血压；且可部分激活其阻力血管Akt/mTOR通路、降低自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1表达。以上结果提示肥胖患者摄入TSG具有治疗肥胖性高血压的作用，其机制可能与TSG抑制过度自噬并改善阻力血管功能有关。