本发明涉及医疗用品技术领域，具体是涉及一种壳聚糖基海绵敷料及其制备方法。
背景技术：
近年来，海绵在药物缓释、伤口敷料、细胞培养和组织工程等领域得到广泛的应用，利用天然的生物高分子开发生物医用海绵和多孔材料成为研究的热点。壳聚糖(chitosan)化学名称为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是一种含氨基的天然均态直链多糖，它是天然第二大高分子甲壳素脱乙酰基的产物。壳聚糖含有大量的游离氨基使其反应性和功能化大大加强。由于壳聚糖具有来源广泛、生物相容性好和可降级等优点，因此在人造皮肤、止血材料及伤口包扎材料等方面的研究与应用成为目前研究最热门的材料之一，在生物医用领域表现出极大的应用价值。作为生物医用敷料材料，壳聚糖的力学性能和抗菌性能往往达不到要求，为了提高此类天然高分子材料的强度和抗菌性能，人们常常通过交联反应和负载抗菌药物而达到增强和抗菌的目的。
物理交联的壳聚糖凝胶强度不高，且该凝胶受环境pH影响较大。化学交联所选用的交联剂大多为醛类交联剂，而这类交联剂具有相对较高的毒性，影响伤口的愈合和功能的恢复。京尼平是传统中药杜仲的活性成分之一，含有-OH、-COO-等多个活性官能团，可自发与氨基反应达到交联壳聚糖的效果。与传统交联剂相比，天然生物交联剂京尼平具有低毒性和良好的生物相容性，因此，以京尼平交联的壳聚糖凝胶在生物材料领域具有广泛的应用价值。
氨苄西林(Ampicillin)为半合成的广谱青霉素。氨苄西林对革兰阳性球菌和杆菌(包括厌氧菌)的抗菌作用基本与青霉素相同，但对粪肠球菌的作用较青霉素更强。能有效对抗革兰氏阴性细菌中脑膜炎球菌、淋球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、奇异变形杆菌、沙门菌等。某些大肠杆菌及某些志贺菌属也对氨苄西林敏感。目前，氨苄西林在临床上主要适应于治疗敏感菌所致的下列感染：1)呼吸系统感染，如急性和慢性支气管炎、支气管扩张、肺炎、扁桃腺炎、咽炎、喉炎、鼻窦炎；2)胃肠道感染，如伤寒、副伤寒、菌痢、沙门菌属和志贺菌引起的菌痢、细菌性腹泻；3)泌尿系统感染，如尿道炎、淋病、膀肤炎；4)其它感染，如脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、败血症等。更有报道显示，氨苄西林用于治疗慢性浅表性胃炎、类风湿性关苄炎也有效。但是，临床表明大量使用氨苄西林会产生的一些毒副作用：如肝毒性、肾毒性、神经系统毒性症状及耳毒性。为了提高氨苄西林的生物利用度，避免大量使用氨苄西林所产生的毒副作用，以氨苄西林作为抗菌剂接枝到壳聚糖基底，得到的壳聚糖基海绵敷料为新型医用敷料的发展开辟了新的领域。因此，一种壳聚糖基医用海绵敷料的制备方法的研究对新型抗菌敷料的制备和开发具有重要的意义。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种工艺简单，操作方便，反应条件温和，绿色、环境友好的壳聚糖基海绵敷料的制备方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)将壳聚糖溶解到醋酸水溶液中，得到1～5wt％的壳聚糖溶液；
2)取(3-氨丙基)三乙氧基硅烷，按照与壳聚糖的摩尔比4:1～1:8加入到壳聚糖溶液中充分搅拌，反应18-24h；
3)将京尼平溶解到去离子水中，得到0.01～0.2wt％的京尼平溶液；
4)将京尼平溶液加入到步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；倒入模具中，40～70℃反应4～8h，冷冻干燥后得到氨基修饰的壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵浸泡在含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应2～10h，冷冻干燥后得到壳聚糖基海绵敷料。
所述的壳聚糖醋酸溶液重量百分比优选为1.5～4wt％。
所述的(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比优选4:1～1:4。
所述的京尼平溶液重量百分比优选为0.01～0.08wt％。
所述的氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的1～6wt％。
所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为5:5:1～5:1:1。
所述的壳聚糖基敷料的制备方法所得到的壳聚糖基海绵敷料。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过化学交联和冷冻干燥制备出壳聚糖基海绵敷料，该敷料使用生物交联剂京尼平，避免使用具有毒性的醛交联剂，具有无毒或低毒性的特点。再通过接枝氨苄西林赋予敷料优越的抗菌性能。本发明敷料具有三维网络结构，具有较高的孔隙率和吸水率。所制备的壳聚糖基海绵敷料，作用于大肠杆菌和白色念珠菌的菌液，摇床培养6-8h，抑菌率可达到100％，抑菌效果显著。本发明工艺简单，操作方便，反应条件温和，绿色、环境友好，适用于医用止血伤口敷料。
附图说明
图1是壳聚糖基海绵敷料截面的扫描电镜照片图。
具体实施例
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，步骤如下：
1)首先将壳聚糖溶于3％的醋酸的水溶液得到1wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比1:1混合，充分搅拌得混合溶液，反应18h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.06wt％；
4)倒入模具中，40℃反应5h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应4h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为2:5:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的2wt％。
实施例2
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，步骤如下：
1)将壳聚糖溶于2％的醋酸的水溶液得到2wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比1:8混合，充分搅拌得混合溶液，反应24h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.1wt％；
4)倒入模具中，50℃反应4h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵胶浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应8h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为5:5:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的4.5wt％。
实施例3
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，步骤如下：
1)将壳聚糖溶于2％的醋酸的水溶液得到1wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比1:4混合，充分搅拌得混合溶液，反应24h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.08wt％；
4)倒入模具中，45℃反应5h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵胶浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应6h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为4:5:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的5wt％。
实施例4
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，步骤如下：
1)将壳聚糖溶于1.5％的醋酸的水溶液得到2wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比1:1混合，充分搅拌得混合溶液，反应20h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.08wt％；
4)倒入模具中，40℃反应8h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应6h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为3:5:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的5wt％。
壳聚糖基海绵敷料截面的扫描电镜照片，如图1所示，可以看到壳聚糖基海绵敷料具有典型的三维网络结构，使其具有较高的孔隙率和吸水率，具有吸收伤口渗液和透气性的优点。
实施例5
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)将壳聚糖溶于3％的醋酸的水溶液得到2.5wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比2:1混合，充分搅拌得混合溶液，反应18h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.01wt％；
4)倒入模具中，50℃反应6h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应6h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为1:3:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的5.5wt％。
实施例6
一种壳聚糖基海绵敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)将壳聚糖溶于4％的醋酸的水溶液得到3wt％的壳聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷与壳聚糖的摩尔比4:1混合，充分搅拌得混合溶液，反应20h；
3)将京尼平溶液与步骤2)所得溶液混合，充分搅拌；混合后京尼平的质量分数为0.02wt％；
4)倒入模具中，35℃反应8h，冷冻干燥得壳聚糖海绵；
5)将壳聚糖海绵浸泡在20mL的含有氨苄西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液中，反应8h，冷冻干燥既得产品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的加入量与壳聚糖的摩尔比为4:1:1，氨苄西林的加入量为壳聚糖重量的6wt％。
实施例7
对实施例1-6制备获得的壳聚糖基海绵敷料进行性能检测以及抗菌活性检测，具体如下：
1、孔隙率测定：1)将样品剪成直径为D的圆形并称重，记m1；2)用千分尺测量样品的厚度，记H；3)将样品分别放入10mL无水乙醇中，24h后取出样品擦干表面的乙醇，并称重，记m2。孔隙率计算公式如下：
孔隙率％＝(m2-m1)/(ρ乙醇×V)*100％
式中，V＝π×(D/2)2×H。
测试结果见表1。从表中可以看到壳聚糖基海绵敷料的孔隙率均高于70％，证明所制备的海绵敷料具有非常好的透气性能，适合于做敷料。
2、吸水率的测定：1)将样品干燥后放入干燥器中24小时后，称量的样品质量，记W1；2)将样品放入去离子水中溶胀24小时后，擦干表面的水后称重，记为W2。吸水率计算公式如下：
吸水率％＝(W2-W1)/W1*100％
测试结果见表1。从表中可以看到壳聚糖基海绵敷料都具有较高的吸收率，说明所制备的海绵敷料具有良好的吸收伤口渗液的性能，适合于做敷料。
3、抑菌实验
实验采用液态培养体系，以加入等量的无菌水作为空白对照样计算抑菌率，细菌计数采用平板计数法进行。具体步骤为：
a)菌液制备：培养大肠杆菌采用的固体培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)，培养基组成为：酪蛋白胰酶消化物15.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2，高压蒸汽121℃灭菌20分钟后，倒平板。用灭菌接种环取冷冻保存的大肠杆菌和白色念珠菌菌种分别接种到TSA培养板上，置于培养箱37℃恒温培养24小时，用灭菌接种环挑取菌落分别到盛有100mL灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的无菌锥形瓶中，培养基组成为：酪蛋白胰酶消化物15.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH值7.2，高压蒸汽121℃灭菌20分钟。采用比浊法测量使其细菌浓度在1×107CFU/mL左右，剧烈振荡使其混合均匀。
b)样品准备：将壳聚糖基海绵敷料剪成直径为10mm的圆形，经紫外线灭菌30min后测试抑菌性能。
c)摇床培养：向50mL锥形瓶中分别添加40mL的无菌胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，再分别添加10μL的步骤a)中的大肠杆菌菌液和白色念珠菌菌液，分别加入步骤b)中样品，其中一只锥形瓶中不添加，作为空白对照样。将锥形瓶置于转速为150rpm/min，37℃的摇床中培养6小时。
d)抑菌率计算：采用逐级稀释涂平板的方法，分别对锥形瓶内的存活细菌进行计数，抑菌率由下列公式计算：
R(％)＝(N空白-N试样)/N试样×100％
其中，N空白和N试样分别为空白对照锥形瓶和添加壳聚糖基海绵敷料锥形瓶内的菌落数。
壳聚糖基海绵敷料的抑制大肠杆菌的抑菌率结果，如表1所示。可以看出本发明的壳聚糖基海绵敷料的抑菌率可以达到100％，具有优越的抑制大肠杆菌效果。
表1，各结果汇总表