一种含纳米金的抗菌壳聚糖敷料及其制备方法与流程

本发明涉及一种抗菌壳聚糖敷料，尤其涉及一种含纳米金的抗菌壳聚糖敷料，以及该抗菌壳聚糖敷料的制备和应用。

背景技术：

壳聚糖是一种可降解的生物相容性材料，壳聚糖可在伤口处提供非蛋白基质促进细胞增殖、组织生长。壳聚糖带有正电荷，能与带负电荷的红细胞结合，促进红细胞聚集而有助于止血。壳聚糖敷料是一类性能优异的用生物材料做成的敷料。

单纯的壳聚糖敷料不具有理想的杀菌抑菌作用。在壳聚糖敷料中添加抗菌剂将提高该敷料的抗菌性，更加完善其功能。纳米银有较强的抗菌性能，但是由于纳米银的不稳定性以及对人体细胞的毒性较大，美国FDA已经明确禁止纳米银在医疗方面的使用，我国CFDA在某些医用方面限制了纳米银的使用。

近年来，稳定性更好、对人体细胞毒性更小的纳米金作为抗菌剂的研究逐渐被报道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)报道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的双组份药物修饰的纳米金抗菌剂和纳米金铂双金属抗菌剂有很强的广谱抗菌性，特别对多药耐药菌有很强的杀灭作用，其对人体细胞的毒性远远低于纳米银，并且不会产生细菌耐药性，是一类非常有前途的抗菌剂。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.)报道的壳聚糖络合的纳米金也具有优异的抗菌性和对人体细胞低的毒性。

上述报道合成的纳米金需要透析处理，工艺较复杂，工艺有待进一步简化；单纯的纳米金溶液不易用于临床的伤口治疗与修复，抗菌性能有待进一步提高。

目前，国内外尚无公开文献报道添加有广谱抗菌性而细胞毒性小的纳米金制作的抗菌壳聚糖敷料。

技术实现要素：

因此，基于现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种具有广谱抗菌性且对细胞毒性小的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料，还提供了所述含纳米金的抗菌壳聚糖敷料的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种含纳米金的抗菌壳聚糖敷料，所述抗菌壳聚糖敷料为包含和/或附着有具有抗菌作用的含金纳米颗粒的壳聚糖织物。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料，其中，所述壳聚糖织物可以为无纺织物、机织织物或针织织物。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料，其中，所述含金纳米颗粒占所述抗菌壳聚糖敷料的0.01～3质量％，可以优选为0.01～1质量％。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料，其中，所述含金纳米颗粒的平均粒径为50nm以下，可以优选为2～10nm，例如4～6nm。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料，其中，所述具有抗菌性能的含纳米金的纳米颗粒选自纳米金、由单组份或多组分小分子药物或大分子修饰的纳米金、以及含纳米金的双组份或多组分金属纳米颗粒中的一种或多种。

优选地，所述由单组份或多组分小分子药物或大分子修饰的纳米金为以含氨基嘧啶类小分子作为单组份修饰的纳米金颗粒或以含氨基嘧啶类小分子/氨基类小分子作为双组份修饰的纳米金颗粒，所述含氨基嘧啶类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1，所述氨基类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1。最优选地，所述含氨基嘧啶类小分子为4,6-2氨基-2-巯基嘧啶，氨基类小分子为二甲双胍或1-(3-氯酚)双胍。

或优选地，所述含纳米金的双组份或多组分金属纳米颗粒为纳米金-铂双金属纳米颗粒。最优选地，所述纳米金-铂双金属纳米颗粒由80％原子百分比的金和20％原子百分比的铂组成。

本发明还提供了上述含纳米金的抗菌壳聚糖敷料的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)将纳米金溶液与步骤(1)得到的壳聚糖乙酸溶液混合均匀，静置消泡，然后用乙酸调节溶液pH值为4.5～5.5，得到纳米金壳聚糖纺丝液；所述纳米金溶液为含有所述具有抗菌作用的含金纳米颗粒的分散液；

(3)将步骤(2)得到的纳米金壳聚糖纺丝液通过喷丝帽挤出，进入凝固液中进行凝固，得到含纳米金的抗菌壳聚糖纤维；

(4)将步骤(3)得到的含纳米金的抗菌壳聚糖纤维进行拉伸、干燥，得到含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维，然后制备为所述含纳米金的抗菌壳聚糖敷料。

通过在壳聚糖纺丝液中添加具有抗菌作用的含金纳米颗粒，然后再纺丝得到含纳米金的抗菌壳聚糖纤维，继而制备为含纳米金的壳聚糖敷料(例如壳聚糖织物)，可以使含金纳米颗粒更均匀牢固地分布于壳聚糖纤维内(本领域技术人员容易理解，纤维表面也可能附着有含金纳米颗粒)，从而使壳聚糖织物包含和/或附着有具有抗菌作用的含金纳米颗粒。

所述含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维可以通过常规手段制备为壳聚糖织物，如无纺织物、机织织物或针织织物等。例如，含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维经过开松、成网、针刺制得无纺织物。

所制得的壳聚糖敷料可经进一步分切、包装、灭菌等操作以按需制备敷料成品。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料的制备方法，其中，所述乙酸溶液的浓度为0.3～0.9mol/L。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料的制备方法，其中，所述凝固液包含选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液和碱性氨类溶液中的一种或多种，优选为氢氧化钠溶液。更优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1.2mol/L。进一步优选地，所述凝固液还包含有机溶剂，所述有机溶剂优选为乙醇。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料的制备方法，其中，步骤(4)中的所述拉伸为2～5倍拉伸，所述拉伸在60～90℃下进行。优选地，步骤(4)中所述干燥的温度为60～90℃，时间为1～5h。

根据本发明的抗菌壳聚糖敷料的制备方法，其中，所述纳米金溶液是通过以下步骤制得：

(a)按照配比，将氯金酸溶液与含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液或氯铂酸钾溶液混合，得到混合溶液；

(b)在搅拌下向所述混合溶液中快速加入还原剂，充分反应后即得到所述纳米金溶液；

其中，所述还原剂的加入时间不超过5分钟，优选不超过1分钟，更优选5～60秒，进一步优选5～30秒，例如25秒。

优选地，步骤(a)中所述含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液还可以包括有机酸或无机酸。优选为乙酸、丙酸或盐酸。更优选地，酸在所述混合溶液中的质量百分比为0.01％～10％。

优选地，步骤(a)中所述含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液中还可以包括非离子表面活性剂。优选为吐温或聚乙二醇。更优选地，非离子表面活性剂在所述混合溶液中的质量百分比为0.005～10％，优选0.005～0.01％。

优选地，步骤(b)中所述还原剂可以选自硼氢化钠、柠檬酸钠和抗坏血酸钠中的一种或多种。步骤(b)中所述充分反应温度可以为室温或室温以下，例如可以为25℃以下，时间可以为0.5～3小时，例如为1小时。

优选地，步骤(b)中所述含纳米金的纳米颗粒在所述纳米金溶液中的浓度为10～4000ppm，优选为400～4000ppm，更优选为800～4000ppm。更进一步优选地，所述还原剂与氯金酸的摩尔比或者所述还原剂与氯金酸和氯铂酸钾的摩尔比为0.5～10:1，优选为0.5～3:1。其中，1ppm通常可换算为1mg/L。

更优选地，所述纳米金溶液的制备方法不包含纯化所述纳米金溶液的步骤；进一步优选地，纯化所述纳米金溶液的步骤包括用透析袋透析处理或离心过滤处理。换言之，本发明生产方法不需要用透析袋透析处理或离心过滤处理等方式来纯化纳米金溶液。作为更进一步的限定，上述纳米金溶液的制备方法也可以表述为由步骤(a)和步骤(b)组成。

本领域技术人员容易理解，在制备氯金酸溶液时使用的氯金酸原料可以为四水合氯金酸。

本发明还提供了上述含纳米金的抗菌壳聚糖敷料或按照上述方法而制备的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料在制备用于治疗烧伤、烫伤或褥疮感染的药物中的应用。

本发明制得的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料将具有优异的广谱抗菌性，无细菌耐药性，对人体细胞毒性小的抗菌纳米金添加到壳聚糖敷料中，使它兼具纳米金的广谱抗菌性而对人体细胞毒性小的作用和壳聚糖良好的促愈合、止血、生物可降解相容性。可用于临床的伤口处理，以及治疗各种烧伤、烫伤、褥疮感染等各种创伤感染，是一种极为优良的医用敷料。而且，本发明采用在壳聚糖纺丝液中添加抗菌纳米金，然后纺丝得到含纳米金的壳聚糖敷料，会使纳米金更均匀牢固的分布于壳聚糖纤维内，抗菌效果更佳。

现有技术已报道的抗菌纳米金的制备方法中，还原剂是以滴加的方式加入，对于工业化生产，背景报道的滴加方式耗时太长，不能实现，而在本发明提供的纳米金溶液的制备方法中，还原剂为一次性快速加入到所述混合溶液，因此更节约时间，有助于提升生产效率。

背景报道的纳米金溶液在反应完成后需要用透析袋透析或离心沉淀，对于工业化生产，背景报道的后处理方法复杂，设备昂贵。而在本发明提供的纳米金溶液的制备方法不需要透析或离心沉淀处理，因此工艺更为简单，降低了生产成本，进一步提升了生产效率。

通过试验检测证明，本发明提供的制备方法所制备的纳米金溶液的抗菌效果远优于还原剂滴加和/或经过透析处理所制备的纳米金溶液。本发明提供制备方法所制备的纳米金溶液的细胞毒性明显低于纳米银溶液和硝酸银溶液。此外，本发明提供的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料与含同一类型同一质量百分比的纳米金抗菌溶液相比，抗菌效果更优。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了实施例1纳米金与商购纳米银透射电镜(TEM)图；

图2示出了实施例1纳米金、商购纳米银、商购硝酸银的细胞毒性比较。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

仪器：

电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)；型号iCAP 6300；购自：美国Thermo Scientific公司

透射电子显微镜(TEM)；型号Tecnai G2 20S-TWIN；购自：美国FEI公司

实施例1

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料及其制备方法。

(1)将50g壳聚糖溶解在1000mL的0.90mol/L乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)将含有1.5g的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金颗粒的纳米金溶液与步骤(1)得到的壳聚糖乙酸溶液混合均匀，静置消泡，然后用乙酸调节溶液pH值为5，得到纳米金壳聚糖纺丝液；

(3)将步骤(2)得到的纳米金壳聚糖纺丝液通过喷丝帽挤出，进入1.2mol/L的氢氧化钠溶液中进行凝固，得到含纳米金的抗菌壳聚糖纤维；

(4)将步骤(3)得到的含纳米金的抗菌壳聚糖纤维进行拉伸(60℃下的2倍拉伸)、干燥(60℃下干燥5h)，得到含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维，然后对该抗菌壳聚糖长纤维进行开松、成网、针刺，制成含纳米金的壳聚糖无纺织物，可作为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料；

(5)还可以把无纺织物分切为敷料片，随后进行包装、灭菌，成为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料成品。

上述纳米金溶液的制备方法为：

(a)将3g的四水合氯金酸溶于0.75L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶和二甲双胍溶于0.75L的去离子水中，还加入一定量的吐温80和乙酸，以有助于促进氨基嘧啶类小分子与氨基类小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。

(b)将一定量的抗坏血酸钠溶于0.325L的去离子水中，在搅拌下将上述抗坏血酸钠溶液快速加入(用时30s)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约1.875L的浓度约为800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金颗粒的纳米金溶液。

根据投料比，4,6-2氨基-2-巯基嘧啶与金元素的摩尔含量比为2:1，二甲双胍与金元素的摩尔含量比为0.5:1，还原剂抗坏血酸钠与氯金酸的摩尔含量比为0.5:1，乙酸占纳米金溶液的质量百分比为0.01％，表面活性剂吐温80占纳米金溶液的质量百分比为0.005％。

在该含纳米金的抗菌壳聚糖敷料中，经ICP-OES测定，每片壳聚糖敷料的含金量为3质量％。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为5nm。

对比例1

按照与实施例1相同的制备方法制得对比例1的纳米金抗菌溶液，再通过常温溶剂水的蒸发，配制成不同浓度的纳米金抗菌溶液，其中，包括与实施例1中的纳米金壳聚糖敷料有相同的纳米金质量百分含量的纳米金溶液。

对比例1.1

按照与对比例1相似的制备方法制得对比例1.1的纳米金抗菌溶液。对比例1.1中还原剂溶液滴加的方式加入到反应溶液中，并且采用透析处理24小时的方式得到纳米金抗菌溶液，加入纯化水，使其与对比例1中的纳米金抗菌溶液有相同的纳米金质量百分含量。

试验例1

通过试验例1中的抗菌实验，证明对比例1的纳米金抗菌溶液要优于对比例1.1的纳米金抗菌溶液。抗菌效果见表1。

比较方法如下：采用最小抑菌浓度MIC(mg/L)来衡量，采用微孔稀释方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，将100μL不同浓度的对比例1和对比例1.1的纳米金溶液分别加入到96微孔板中，10μL相同浓度(10⁴CFU/mL)的细菌培养液加入每个微孔中，37℃培养24小时后观察，没有可看见的细菌生长的微孔中最少的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

测试结果见表1。从测试结果可见，对比例1的纳米金抗菌溶液的抗菌效果远优于对比例1.1的纳米金抗菌溶液的抗菌效果。说明采用与对比例1制备方法相同的纳米金溶液制备的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料，其抗菌效果也应远优于采用与对比例1.1制备方法相同的纳米金溶液制备的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料。

表1对比例1和对比例1.1的纳米金抗菌溶液的抗菌性能比较

实施例2

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料及其制备方法。

(1)将30g壳聚糖溶解在1000mL的0.30mol/L乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)将含有0.003g的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/1-(3-氯酚)双胍作为双组份小分子修饰的纳米金颗粒的纳米金溶液与步骤(1)得到的壳聚糖乙酸溶液混合均匀，静置消泡，然后用乙酸调节溶液pH值为4.5，得到纳米金壳聚糖纺丝液；

(3)将步骤(2)得到的纳米金壳聚糖纺丝液通过喷丝帽挤出，进入0.5mol/L的氢氧化钠溶液中进行凝固，得到含纳米金的抗菌壳聚糖纤维；

(4)将步骤(3)得到的含纳米金的抗菌壳聚糖纤维进行拉伸(90℃下的5倍拉伸)、干燥(90℃下干燥1h)，得到含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维，然后对该抗菌壳聚糖长纤维进行开松、成网、针刺，制成含纳米金的壳聚糖无纺织物，可作为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料；

(5)还可以把无纺织物分切为敷料片，随后进行包装、灭菌，成为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料成品。

上述纳米金溶液的制备方法为：

(a)将0.27g的四水合氯金酸溶于0.067L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶和1-(3-氯酚)双胍溶于0.067L的去离子水中，还加入一定量的吐温80和乙酸，以有助于促进氨基嘧啶类小分子与氨基类小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。

(b)将一定量的抗坏血酸钠溶于0.033L的去离子水中，在搅拌下将上述抗坏血酸钠溶液快速加入(用时5s)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约0.167L的浓度约为800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/1-(3-氯酚)双胍作为双组份修饰的纳米金颗粒的纳米金溶液。

根据投料比，4,6-2氨基-2-巯基嘧啶与金元素的摩尔含量比为0.5:1，1-(3-氯酚)双胍与金元素的摩尔含量比为2:1，还原剂抗坏血酸钠与氯金酸的摩尔含量比为3:1，乙酸占纳米金溶液的质量百分比为0.01％，表面活性剂吐温80占纳米金溶液的质量百分比为0.01％。

在该含纳米金的抗菌壳聚糖敷料中，经ICP-OES测定，每片壳聚糖敷料的含金量为0.01质量％。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为6nm。

对比例2

按照与实施例2相同的制备方法制得对比例2的纳米金抗菌溶液，再通过常温溶剂水的蒸发，制成纳米金抗菌溶液，使其与实施例2中的纳米金壳聚糖敷料有相同的纳米金质量百分含量。

实施例3

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料及其制备方法。

(1)将50g壳聚糖溶解在1000mL的0.50mol/L乙酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)将含有0.5g的金-铂双组分Au₈₀Pt₂₀纳米颗粒的纳米金溶液与步骤(1)得到的壳聚糖乙酸溶液混合均匀，静置消泡，然后用乙酸调节溶液pH值为5.5，得到纳米金壳聚糖纺丝液；

(3)将步骤(2)得到的纳米金壳聚糖纺丝液通过喷丝帽挤出，进入0.8mol/L的氢氧化钠溶液中进行凝固，得到含纳米金的抗菌壳聚糖纤维；

(4)将步骤(3)得到的含纳米金的抗菌壳聚糖纤维进行拉伸(70℃下的3倍拉伸)、干燥(70℃下干燥3h)，得到含纳米金的抗菌壳聚糖长纤维，然后对该抗菌壳聚糖长纤维进行开松、成网、针刺，制成含纳米金的壳聚糖无纺织物，可作为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料；

(5)还可以把无纺织物分切为敷料片，随后进行包装、灭菌，成为含纳米金的抗菌壳聚糖敷料成品。

上述含纳米金-铂双金属纳米颗粒的纳米金溶液的制备方法为：

(a)将0.825g的四水合氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)和0.175g氯铂酸钾(K₂PtCl₆)溶于0.2L的去离子水中，得到混合溶液。

(b)将一定量的硼氢化钠溶于0.05L的去离子水中，在搅拌下将上述硼氢化钠溶液快速加入(用时25s)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约0.25L的浓度约为800ppm含有纳米金-铂双金属纳米颗粒的纳米金溶液。

根据投料比，还原剂硼氢化钠与氯金酸和氯铂酸钾的摩尔含量比为3:1，铂的原子百分比为20％，因此该金-铂纳米颗粒可表示为Au₈₀Pt₂₀纳米颗粒。

在该含纳米金的抗菌壳聚糖敷料中，经ICP-OES测定，每片壳聚糖敷料的含金量为1质量％。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为4nm。

对比例3

按照与实施例3相同的制备方法制得对比例3的纳米金抗菌溶液，再通过常温溶剂水的蒸发，使其与实施例3中的纳米金壳聚糖敷料有相同的纳米金质量百分含量。

试验例2

将实施例1采用的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金抗菌溶液与市售含纳米银的抗菌溶液(购自张家港耐尔纳米科技公司)的抗菌性能相比较，说明本发明的含纳米金的抗菌壳聚糖敷料也应具有良好的抗菌性能。

比较方法如下：采用最小抑菌浓度MIC(mg/L)来衡量，采用微孔稀释方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，将100μL不同浓度的纳米金或纳米银加入到96微孔板中，10μL相同浓度(10⁴CFU/mL)的细菌培养液加入每个微孔中，37℃培养24小时后观察，没有可看见的细菌生长的微孔中最小的纳米金或纳米银的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。测试结果见表2。

从测试结果可见，实施例1采用的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金抗菌溶液的大肠杆菌和绿脓杆菌的MIC都小于市售含纳米银抗菌溶液的MIC，由此说明，实施例1对大肠杆菌和绿脓杆菌的抗菌性能优于市售含纳米银的抗菌溶液。

表2实施例1的纳米金溶液与市售含纳米银的抗菌溶液的抗菌性能比较结果

试验例3

通过不同纳米金含量的敷料抑菌圈实验，来说明含该纳米金的抗菌壳聚糖敷料的抑菌活性。

按照《药品微生物检验手册》第18章第1节管碟法进行试验，对实施例1-3和对比例1-3进行抑菌圈试验。试验结果见表3。空白壳聚糖的抑菌圈为10mm，抑菌圈大小为壳聚糖样品的原始大小，没有抑菌效果。

测试结果可见，尽管各实施例的纳米金质量百分比和类型不同，但均可观察到明显的抑菌圈，说明含纳米金的壳聚糖敷料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌效果。且同一浓度同一类型的含纳米金的壳聚糖敷料的抑菌圈均大于纳米金抗菌溶液，说明含纳米金的壳聚糖敷料的抑菌效果要优于有相同纳米金含量相同纳米金类型的纳米金抗菌溶液。

试验例4细胞毒性实验

细胞毒性试验操作过程：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养。在96微孔板的每个孔中加入10⁴个HUVEC细胞，每个孔中分别加入含不同浓度的纳米颗粒(2-巯基-4,6-二氨基嘧啶/二甲双胍双组分修饰的纳米金颗粒)的纳米金溶液(可得自对比例1)、商购纳米银、商购硝酸银溶液200微升。微孔介质中在37℃下培养48小时，没有加入抗菌剂的HUVEC细胞作为对照。培养完后，微孔中的溶液用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介质中，在37℃下培养2小时。在酶联免疫检测仪450nm处测量各样品孔以及对照孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。各样品孔细胞相对活力定义为：各个孔吸光值/对照孔的吸光值×100％。试验结果见图2。

从图2所示的试验结果可知，本发明采用的含金纳米颗粒在不同浓度下的细胞毒性均明显低于商购纳米银和商购硝酸银溶液。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。