抗菌仿生多孔钛植入体及其制备方法和应用与流程

本发明属于骨科植入体制备技术领域，涉及一种抗菌仿生多孔钛植入体及其制备方法和应用，尤其涉及一种冷冻铸造和热氧化技术制备抗菌仿生多孔钛植入体的方法。

背景技术：

钛及钛合金作为骨替代材料具有良好的生物相容性和力学性能等众多优点，但由于钛及钛合金植入体的弹性模量远远高于自然人体骨皮质，作为承载骨替代材料植入体内后，与骨组织之间仅以机械整合而非牢固的生物性结合，尤其是当植入体表面细菌的生长和繁殖引起的植入体松动及周围骨组织炎症反应等严重并发症，将增加骨植入手术后失败的风险从而限制其在临床上的应用。

新型骨植入体需要与骨组织活体细胞之间产生特殊的响应及相互作用，从而在生理环境下能诱导成骨细胞发展成有生命力的新生骨组织或器官，即良好的骨整合性能。因此，获得类似人体骨组织孔隙形貌和孔径大小同时具有良好力学性能的仿生多孔钛植入体成为骨植入体的重要研究方向之一。形成良好的骨植入体-骨结合界面是种植体种植成功的关键所在，调控成骨细胞在材料表面的行为和成骨细胞的黏附增殖能力，以及抑制骨植入体-骨结合界面细菌的生长和繁殖对于形成良好的骨结合界面至关重要，所以如何同时实现植入体的纳米化表面改性及使其具备抗菌性能的研究也成为研发新一代抗菌仿生多孔钛植入体的热点之一。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种兼具良好的抗菌功能、优异的骨整合性能和力学性能的抗菌仿生多孔钛植入体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种抗菌仿生多孔钛植入体，所述抗菌仿生多孔钛植入体呈圆柱体结构，具有沿圆柱体外周向圆柱体中央呈放射状各向异性的多孔结构，所述多孔结构的孔径沿圆柱体外周向圆柱体中央呈由小到大的梯度分布，所述多孔结构的孔基底表面具有针状微纳结构。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体中，优选的，所述抗菌仿生多孔钛植入体的孔隙度为40％～70％、开孔率为90％～99％、平均孔径大小为80μm～150μm、压缩强度为30mpa～165mpa，弹性模量为1gpa～4gpa，所述抗菌仿生多孔钛植入体对革兰氏阴性菌的灭菌率大于90％，对革兰氏阳性菌的灭菌率大于85％。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法，包括以下步骤：

(1)浆料制备：将钛粉末与介质溶剂在水浴加热条件下持续搅拌混合，得到浆料，浆料中钛粉的体积分数为10％～20％；

(2)冷凝固化：将步骤(1)所得浆料倒入预冷的模具中于20℃～25℃下进行冷凝固化，模具内设有圆柱形腔体，模具保持密封隔热，冷凝固化后，脱模干燥，得到干燥坯样；

(3)烧结：将步骤(2)所得干燥坯样先在真空条件下以速率1℃/min～5℃/min加热升温至400℃～600℃，然后在惰性气氛下以速率5℃/min～10℃/min升温至1200℃～1300℃进行烧结，烧结持续时间为1h～4h，然后冷却至室温，得到多孔钛植入物试样；

(4)表面微纳结构处理：将步骤(3)所得多孔钛植入体试样进行超声清洗并干燥，将所得干燥坯样在惰性气氛下以速率10℃/min～15℃/min升温至850℃～900℃后，在惰性气氛的气流中持续加入丙酮，并控制惰性气体的流速为50sccm～300sccm进行烧结，烧结持续时间为45min～60min，烧结后冷却至室温，得到抗菌仿生多孔钛植入体。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(1)中，所述介质溶剂为莰烯，所述水浴加热的温度为60℃～65℃。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(1)中，所述搅拌的时间为2h～4h，所述搅拌的速度为800r/min～1000r/min，搅拌同时在搅拌容器上放置覆盖物以减少溶剂蒸发。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(2)中，所述模具的预冷温度与冷凝固化温度相同，所述模具的预冷时间为30min～120min，所述冷凝固化的时间为4h～6h。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(2)中，在冷凝固化后和脱模干燥前，于-18℃～-20℃低温下保存12h～24h，进一步固化试样；所述干燥为真空冷冻干燥，所述干燥的时间为24h～48h。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(4)中，所述超声清洗先后采用丙酮、无水乙醇和双蒸水作为清洗液，各清洗15min～20min；所述干燥的温度为60℃～80℃，所述干燥的时间为4h～6h。

上述的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法中，优选的，所述步骤(4)中，所述丙酮为液态的丙酮；烧结后停止加入丙酮，控制惰性气体的流速为500sccm～600sccm条件下自然冷却至室温。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的抗菌仿生多孔钛植入体或者上述的制备方法制得的抗菌仿生多孔钛植入体的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明通过冷冻铸造法(即步骤(1)至步骤(3))控制模具中介质冷凝固化的方向，即控制冷凝固化时介质沿模具外周至模具中央的温差(即圆柱体内腔的径向温差，如外周20℃至中央60℃形成的温差)，实现多孔钛植入体呈向圆柱体中央放射状各向异性且孔径梯度分布的孔隙形貌，其多孔结构与天然人体骨骼组织非常相似。

(2)本发明通过控制和优化冷冻铸造中包括混合浆料的钛粉体积比、烧结温度、烧结速度和烧结时间等工艺参数，实现制备的抗菌仿生多孔钛植入体具备良好的孔隙率、孔径大小和优异的力学性能，有效的满足骨细胞长入多孔钛植入体内形成生物性的骨整合的条件。

(2)本发明通过热氧化法(即步骤(1))实现多孔钛植入体内所有三维孔隙基底表面均匀生长出纳米针状结构，针状结构的长约100～200nm。与传统多孔材料相比，本发明的仿生多孔钛植入体孔隙中均匀分布的针状纳米结构通过调控成骨细胞在材料表面的吸附作用、生物学响应等方面促进体外成骨细胞的增殖、分化性能和体内骨形成、沉积和钙化，随着植入时间的延长，成骨细胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合，具有很显著的进步。同时针状纳米结构通过物理效应有效抑制植入体周围的细菌的生长，是一种新型兼具抗菌功能和良好骨整合性能且具有良好生物相容性的表面改性仿生多孔钛植入体。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的抗菌仿生多孔钛植入体横断面的sem图。

图2为本发明实施例1制备的抗菌仿生多孔钛植入体孔基底表面针状微纳结构的sem图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种本发明的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法，包括以下步骤：

(1)浆料制备：将钛粉末与介质溶剂莰烯在60℃水浴箱中持续磁力搅拌混合2小时，搅拌速度为800r/min，在搅拌容器的上方放置覆盖物，减少溶剂莰烯蒸发。所得浆料混合物中钛粉的体积分数占10％。

(2)冷凝固化：将圆柱形模具置于水浴箱中预冷30分钟，预冷温度为20℃，将配制好的浆料缓缓倒入预冷的模具中，模具内腔为圆柱形，模具的上下端保持密封隔热，控制冷凝固化温度在20℃，冷凝固化时间为4小时。冷凝固化后，取出模具放置在-20℃低温下保存12h，进一步固化试样。取出试样脱模后放入冷冻真空干燥箱中干燥24h，得到干燥坯样。

(3)烧结：将干燥坯样置于烧结炉中，先在真空条件下以速率为1℃/min加热升温至400℃，然后在氩气气氛下以速率为5℃/min升温至1200℃进行烧结，烧结持续时间为1h，自然冷却至室温，得到多孔钛植入物试样。

(4)表面微纳结构处理：将烧结后得到的多孔钛植入体试样先后用丙酮、无水乙醇和双蒸水作为清洗液，在超声波清洗机中各清洗15min，然后于高温干燥箱中80℃干燥4小时。将干燥坯样置于烧结炉中，在氩气气氛下以速率为10℃/min升温至850℃，氩气流中持续加入25℃丙酮，控制氩气气体流速为50sccm进行烧结，烧结持续时间为45min，然后停止通丙酮，控制氩气气体流速为500sccm条件下自然冷却至室温，得到抗菌仿生多孔钛植入体，该抗菌仿生多孔钛植入体具有表面针状微纳结构。

如图1和图2所示，为本实施例制备的抗菌仿生多孔钛植入体横断面和孔隙表面的sem图，由图可以看出，该植入体具有多孔结构，沿圆柱体外周向圆柱体中央呈放射状各向异性且孔径呈由小到大的梯度分布，该多孔结构与天然人体骨骼组织非常相似，多孔植入体的孔隙表面具有针状微纳结构，针状结构的长约100～200nm，说明本发明的方法可以制备出纳米针状表面改性的抗菌仿生多孔钛植入体。经测试，本实施例的多孔钛植入体的孔隙度58.32±1.08％、开孔率97.70％、平均孔径大小126.17±18.64μm、压缩强度58.51±20.38mpa及弹性模量1.70±0.52gpa。植入物生物相容性达到与临床应用要求。植入体孔隙中的针状纳米结构能促进体外成骨细胞的增殖、分化性能和体内骨形成、沉积和钙化，随着植入时间的延长，成骨细胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

本实施例制备的抗菌仿生多孔钛植入体可应用于骨科植入物领域，还可应用于其它相关的医学领域。

实施例2：

一种本发明的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)浆料制备：将钛粉末与介质溶剂莰烯在65℃水浴箱中持续磁力搅拌混合4小时，搅拌速度为1000r/min，在搅拌容器的上方放置覆盖物，减少溶剂莰烯蒸发。所得浆料混合物中钛粉的体积分数占20％。

(2)冷凝固化：将圆柱形模具置于水浴箱中预冷30分钟，预冷温度为20℃。将配制好的混合浆料缓缓倒入预冷的模具中，横具内腔为圆柱形，模具的上下端保持密封隔热。冷凝固化温度控制在20℃，固化时间为4小时。取出模具放置在-20℃低温下保存12h，进一步固化试样。取出试样脱模后放入冷冻真空干燥箱中干燥24h。

(3)烧结：将干燥坯样置于烧结炉中，先在真空条件下以速率为5℃/min加热升温至400℃，然后在氩气气氛下以速率为10℃/min升温至1200℃进行烧结，烧结持续时间为4h，自然冷却至室温，得到多孔钛植入物试样。

(4)表面微纳结构处理：烧结后的多孔钛植入体试样先后用丙酮、无水乙醇和双蒸水作为清洗液，在超声波清洗机中各清洗15min，然后于高温干燥箱中80℃干燥4小时。将干燥坯样置于烧结炉中，在氩气气氛下以速率为15℃/min升温至850℃，氩气流中持续加入25℃丙酮，控制氩气气体流速为300sccm进行烧结，烧结持续时间为45min，然后停止通丙酮，控制氩气气体流速为500sccm条件下自然冷却至室温，得到抗菌仿生多孔钛植入体。

经测试，利用上述本实施例的方法制备了纳米针状表面改性的抗菌仿生多孔钛植入体，该抗菌仿生多孔钛植入体呈圆柱体结构，具有沿圆柱体外周向圆柱体中央呈放射状各向异性的多孔结构，多孔结构的孔径沿圆柱体外周向圆柱体中央呈由小到大的梯度分布，多孔结构的孔表面具有针状微纳结构。本实施例的产品的孔隙度45.99±2.15％、开孔率92.50％、平均孔径大小94.35±2.01μm、压缩强度147.12±15.53mpa及弹性模量2.99±0.12gpa。植入物生物相容性达到临床应用要求。植入体孔隙中的针状纳米结构能促进体外成骨细胞的增殖、分化性能和体内骨形成、沉积和钙化，随着植入时间的延长，成骨细胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

实施例3：

一种本发明的抗菌仿生多孔钛植入体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)浆料制备：将钛粉末与介质溶剂莰烯在60℃水浴箱中持续磁力搅拌混合4小时，搅拌速度为800r/min，在搅拌容器的上方放置覆盖物，减少溶剂莰烯蒸发。所得浆料混合物中钛粉的体积分数占15％。

(2)冷凝固化：将圆柱形模具置于水浴箱中预冷30分钟，预冷温度为25℃。将配制好的混合浆料缓缓倒入预冷的模具中，模具内腔为圆柱形，模具的上下端保持密封隔热。冷凝固化温度控制在25℃，固化时间为4小时。取出模具放置在-20℃低温下保存12h，进一步固化试样。取出试样脱模后放入冷冻真空干燥箱中干燥24h。

(3)烧结：将干燥坯样置于烧结炉中，先在真空条件下以速率为1℃/min加热升温至400℃，然后在氩气气氛下以速率为10℃/min升温至1300℃进行烧结，烧结持续时间为1h，自然冷却至室温，得到多孔钛植入物试样。

(4)表面微纳结构处理：烧结后的多孔钛植入体试样先后用丙酮、无水乙醇和双蒸水作为清洗液，在超声波清洗机中各清洗15min，然后于高温干燥箱中80℃干燥4小时。将所得干燥坯样置于烧结炉中，在氩气气氛下以速率为10℃/min升温至850℃，氩气流中持续加入25℃丙酮，控制氩气气体流速为200sccm进行烧结，烧结持续时间为45min，然后停止通丙酮，控制氩气气体流速为500sccm条件下自然冷却至室温，得到抗菌仿生多孔钛植入物。

经测试，利用上述本实施例的方法制备了纳米针状表面改性的抗菌仿生多孔钛植入体，该抗菌仿生多孔钛植入体呈圆柱体结构，具有沿圆柱体外周向圆柱体中央呈放射状各向异性的多孔结构，多孔结构的孔径沿圆柱体外周向圆柱体中央呈由小到大的梯度分布，多孔结构的孔表面具有针状微纳结构。本实施例的植入体的孔隙度54.19±2.01％、开孔率94.49％、平均孔径大小104.16±16.05μm、压缩强度113.37±25.18mpa及弹性模量2.85±0.25gpa。植入物生物相容性达到与临床应用要求。植入体孔隙中的针状纳米结构能促进体外成骨细胞的增殖、分化性能和体内骨形成、沉积和钙化，随着植入时间的延长，成骨细胞在其孔隙中分化更加成熟，形成牢固的生物性骨整合。

体外抗菌实验：

本发明进行的体外抗菌实验证明，实施例1、实施例2和实施例3三种仿生多孔钛植入体能明显抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

以下是本发明进行的体外实验的例子，抗菌性能检测方法如下：(1)lb培养基制法：用天平称取10g胰化蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化钠、20g琼脂，将上述成分充分溶解于1000ml蒸馏水中，将配好的溶液用0.1mol/l的naoh溶液调节ph至7.0，分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃下灭菌20min后备用。(2)磷酸盐缓冲剂(pbs)制法：将2.84g磷酸氢二钠和1.36g磷酸二氢钾溶解于1000ml蒸馏水中，将配好的溶液调节ph至7.2～7.4，压力蒸汽121℃灭菌30分钟后备用。(3)本实验中分别对样品针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌性能进行了检测。其中革兰氏阴性菌选取的代表菌种是大肠杆菌，革兰氏阳性菌选取代表菌种为金黄色葡萄球菌。进行抗菌实验的样品是致密钛对照试样和本发明的抗菌仿生多孔钛试样，每种样品各4组。将样品用丙酮、无水乙醇及蒸馏水清洗后，在121℃下高压灭菌30分钟备用。将灭菌后试样放置在培养皿中，并在培养皿中滴入1000μl灭菌pbs缓冲液。用pbs液将接种后的菌种稀释成浓度为1×10⁵的标准菌液；移液枪吸取100μl菌液滴到试样表面，均匀涂开，并在37℃恒温培养箱中培养24h。移液枪从试样表面吸取80μl菌液并均匀滴在lb培养基的培养皿中，将菌液涂抹均匀。涂好的培养皿放在37℃恒温培养箱中培养。培养24h后取出培养皿，计算每个试样表面所含的菌落总数。抗菌率计算公式为：

其中k为样品抗菌率，a为空白样品即致密钛上的细菌平均数，b为抗菌仿生多孔钛测试样品上的细菌平均数。

抗菌试验结果显示：对致密钛对照试样和抗菌仿生多孔钛试样采用平板法进行了抗菌性能检测，并求出了灭菌率。表1为抗菌仿生多孔钛试样对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭菌率，结果显示本发明的抗菌仿生多孔钛植入体对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都表现出良好的抗菌效果。

表1抗菌仿生多孔钛的抗菌测试结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。