本发明涉及铁皮石斛技术领域，具体涉及一种铁皮石斛叶的提取方法及其提取物和应用。
背景技术：
铁皮石斛（dendrobiumofficinalekimuraetmigo），为兰科多年生附生草本植物。味甘，微寒，归胄、肾经。历代中药典籍《神农本草经》、《本草纲目拾遗》等都有记载，以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热、养胃生津、补肾益精之功效。
然而现有技术中，只有茎才是作为名贵的药材，至于铁皮石斛其它部分，例如铁皮石斛叶和铁皮石斛花应用都非常少。而实际检测，铁皮石斛叶中含有18%以上的多糖，基本与茎接近，而且铁皮石斛叶中还含有丰富的生物总黄酮，如花色素、柚皮素、木酚素、二氢异黄酮等抗氧化、抗衰老、类雌激素作用的功效成分，其生物总黄酮的含量经检测甚至比铁皮石斛茎条的含量还高1倍以上。另外铁皮石斛叶的粗蛋白质含量在10%以上，具有很好的营养价值，铁皮石斛多糖和生物总黄酮无论是药用还是养生保健、美容美体方面都具有确切的疗效和机理机制。
但是未经提取的铁皮石斛叶人体难以吸收，因此铁皮石斛叶难以广泛应用，大部分人对于铁皮石斛叶的功效认知是十分有限的，事实上，目前铁皮石斛茎被采集后，铁皮石斛叶往往是被丢弃或者作为饲料，利用效率极低。
为此，亟待一种铁皮石斛叶的提取方法，但是现有的铁皮石斛叶的提取方法基本只是简单醇沉方法，如专利申请号为201610155974.6的发明专利，并不能提高铁皮石斛叶的利用效率，提取收率和功效成分纯度均有一定的限制。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种提取收率和功效成分纯度比较高、可以提高铁皮石斛叶的利用效率的铁皮石斛叶提取方法。
本发明的另一目的在于提供一种利用该提取方法得到的提取物，该铁皮石斛叶提取物含有丰富的蛋白质、多糖、总黄酮等功效成分，在医药品、护肤品、化妆品等领域中有巨大的应用前景。
本发明的另一目的在于提供一种利用该提取方法得到的提取物在护肤品的应用，将铁皮石斛叶提取物应用到护肤品中，可以提高护肤品祛痘改善色斑和抗衰老抗氧化的作用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-20～0℃，保温12～36h，然后加热至80～100℃，保温1-3h，再冷却至-20～0℃，保温12～36h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至80～100℃，保温1～3h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂。
本发明的核心创新点之一在于反复冻融技术和酶解技术的联合使用。
由于皮石斛液的细胞壁相对比较厚，未木化，纤维束外韧性，内含碳酸钙针晶束，多细胞组成外表层。因此普通加热、粉碎等方式难以使细胞内的物质析出，本发明通过采用反复冻融技术，在水的热涨冷缩和渗透的作用下，破坏铁皮石斛叶的细胞壁，破壁率可以达到90%-100%，该技术操作简单，成本低廉，特别适合大规模工业化生产。优选地，将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-10℃，保温24然后加热至100℃，保温2h，再冷却至-10℃，保温24后，温至浆液状，破壁率可以达到100%。
此外，虽然铁皮石斛多糖和生物总黄酮可以溶于水，但是含量丰富的蛋白质却不容易水，也不容易被人体利用吸收，因此本发明利用蛋白酶将破壁之后从细胞裸露出来的蛋白质进行切割，从而大分子蛋白被切割成可以溶于水的小分子蛋白、多肽甚至氨基酸，并且小分子蛋白、多肽或氨基酸更易被人体吸收。
综上，本发明反复冻融破壁和酶解技术的联合使用，可以让本发明铁皮石斛叶的提取收率在60%以上，蛋白质、多糖、总黄酮等功效成分的纯度达到90%。
其中，所述步骤（1）调浆中的铁皮石斛叶浆液的制备方法为如下两种中的一种：
a、将铁皮石斛叶与水混合后进行湿法粉碎；
b、将铁皮石斛叶进行干法粉碎至1～20目，然后加入水中。
两种方法因地制宜，a方法更适合含有一定水分的鲜铁皮石斛叶，b方法更适合干的铁皮石斛叶。
另，所述步骤（1）中铁皮石斛叶粉与水的重量比重对反复冻融的效果有很大的影响，水相对太多，则冷冻耗费的资源就越高，维持浆液的冷冻也就更难，不稳定；水相对太少，则冻融不充分，破壁率低，因此所述步骤（1）中铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别优选为1～40份和50～98份。
其中，所述步骤（3）中蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的至少一种，所述蛋白酶的用量为0.1～5重量份。木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶均为植物酶，对于铁皮石斛的蛋白质具有较高的酶解效率，更为优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，作为另一优选方式，所述蛋白酶由木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按重量比1:1的比例组成。
更进一步地，为了提高木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶的酶解效果，所述步骤（3）酶解的温度为35～55℃，酶解的时间为3～5h。
其中，所述步骤（4）的加热的方法为蒸气加热。蒸气加热的好处在于蒸气的温度远远高于铁皮石斛叶浆液的温度，并且可以提供一定的压力，使蛋白酶失活更快，从而减少铁皮石斛叶浆液中热敏性营养的损失。
其中，所述步骤（5）中所述浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以15000～20000r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液。离心浓缩可在常温进行，对铁皮石斛的功效成分损害极低。
其中，所述步骤（5）的干燥的方法为喷雾干燥或真空干燥。喷雾干燥和真空干燥可因地制宜，喷雾干燥能耗较低，但容易损失提取物的功效成分，真空干燥成本高、时间长，但是提取物的提取收率更高。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛叶提取物的应用，将如上所述方法提取到的铁皮石斛提取物应用到护肤品上，可以有效提高护肤品祛痘改善色斑和抗衰老抗氧化的作用。
具体地，可应用在一种祛痘抗衰老面膜中，所述祛痘抗衰老面膜包括a相组分和b相组分；
所述a相组分包括如下重量份数的原料：
保湿剂18.5-27份
防腐剂0.20.5份
增稠剂0.60.8份
透明质酸钠0.2-4份
以及适量水
所述b相组分包括如下重量份数的原料：
铁皮石斛叶提取物5-10份
黄芩提取物0.1-5份
番红花提取物0.1-1份
血竭提取液0.1-1份
助溶剂12-17份
以及适量水；
所述a相组分和b相组分的水合计为10-60重量份。
具体保湿剂、防腐剂、增稠剂等原料的选择以及相应的制备方法可以参考申请人日前申请的专利号为201611259762.9的发明专利，关于该些用剂的效果也已经在该专利中充分阐述，此处不再累述。
本发明与日前申请的专利最大的不同之一在于b相组分中采用了利用前述方法提取的铁皮石斛叶提取物。虽然该专利中b相组分采用的铁皮石斛提取液并未限定提取的是铁皮石斛的什么部位，但是由于关于铁皮石斛叶的提取方法、功效成分分析以及在护肤品上的效果相关研究均比较少，在护肤品中所采用的铁皮石斛提取液一般仅仅代指铁皮石斛茎的提取液（铁皮石斛花有季节限制），即使采用现有技术提取得到的铁皮石斛叶提取液，用在该面膜中，由于对于铁皮石斛功效成分保留程度的不同、提取过程中涉及多糖片段、总黄酮分子结构的变化均会导致铁皮石斛叶提取物的表现效果。而本发明提取得到的铁皮石斛叶提取物的总黄酮在清除自由基的活性要远远高于现有的铁皮石斛叶提取物或铁皮石斛提取物，尤其在本面膜中，效果突出（下文辅以数据证明）。
此外，本发明还在b相组分引入了番红花提取物和血竭提取物，协同黄芩提取物，提高活气行血的功效，从而促进皮肤对铁皮石斛叶中的多糖、总黄酮的吸收，提高了祛痘修复功能，从而突出了面膜祛痘和抗衰老的功效，同时也兼具原本美白的功效。
本发明的有益效果在于：1、本发明的提取方法通过采用反复冻融破壁和酶解技术的联合使用，可以让铁皮石斛叶的提取收率在60%以上，蛋白质、多糖、总黄酮等功效成分的纯度达到90%；2、本发明提取得到的铁皮石斛叶提取物含有丰富的蛋白质、多糖、总黄酮等功效成分，在医药品、护肤品、化妆品等领域中有巨大的应用前景；3、本发明提取到的铁皮石斛提取物应用到护肤品上，可以有效提高护肤品祛痘改善色斑和抗衰老抗氧化的作用，从而使皮肤更加紧致并富有弹性。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成，其中，铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别为20份和75份；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-10℃，保温24h，然后加热至100℃，保温2h，再冷却至-10℃，保温24h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应，其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述蛋白酶的用量为2.5重量份，酶解的温度为45℃，酶解的时间为4h；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至90℃，保温2h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂，其中，浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以17500r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液，所述干燥的方法为喷雾干燥。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成，其中，铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别为1份和50份；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-20℃，保温12h，然后加热至80℃，保温1h，再冷却至-20℃，保温12h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应，其中，蛋白酶为菠萝蛋白酶，所述蛋白酶的用量为0.1重量份，酶解的温度为35℃，酶解的时间为3h；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至80℃，保温1h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂，其中，浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以15000r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液，干燥的方法为真空干燥。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成，其中，铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别为40份和98份；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至0℃，保温36h，然后加热至90℃，保温3h，再冷却至0℃，保温36h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应，其中，所述蛋白酶由木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按重量比1:1的比例组成，所述蛋白酶的用量为5重量份，酶解的温度为55℃，酶解的时间为5h；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至100℃，保温3h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂，其中，浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以20000r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液，干燥的方法为喷雾干燥。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成，其中，铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别为30份和60份；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-15℃，保温20h，然后加热至95℃，保温1.5h，再冷却至-5℃，保温30h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应，其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述蛋白酶的用量为4重量份，酶解的温度为40℃，酶解的时间为4.5h；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至85℃，保温2.5h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂，其中，浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以18000r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液，干燥的方法为真空干燥。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
一种铁皮石斛叶的提取方法，包括如下步骤：
（1）调浆：取铁皮石斛叶浆液，所述铁皮石斛叶浆液由铁皮石斛叶粉和水组成，其中，铁皮石斛叶浆液的铁皮石斛叶粉与水的重量份数分别优选为10份和80份；
（2）反复冻融：将所述铁皮石斛叶浆液冷却至-5℃，保温16h，然后加热至85℃，保温2.5h，再冷却至-215℃，保温32h，然后升温至浆液状；
（3）酶解：往所述步骤（2）反复冻融处理后的铁皮石斛叶浆液中加入蛋白酶进行酶解反应，其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述蛋白酶的用量为1重量份，酶解的温度为20℃，酶解的时间为3.5h；
（4）灭活：将所述步骤（3）酶解处理后的铁皮石斛叶浆液加热至92℃，保温1.2h；
（5）成品：将所述步骤（4）处理后的铁皮石斛叶浆液进行浓缩、干燥，得到铁皮石斛叶提取物，所述铁皮石斛叶提取物为浸膏剂或固体粉剂，其中，浓缩的方法为：将步骤（4）灭活处理后的铁皮石斛叶浆液以16000r/s的转速进行离心，离心后取下层浓缩液，干燥的方法为喷雾干燥。
应用例1
将实施例1提取得到的铁皮石斛叶提取物制成面膜，面膜包括a相组分和b相组分，
所述a相组分包括如下重量份数的原料：
保湿剂22份
防腐剂0.35份
增稠剂0.7份
透明质酸钠2.1份
水15份
所述b相组分包括如下重量份数的原料：
实施例1得到的铁皮石斛叶提取物7.5份
黄芩提取物2.5份
番红花提取物0.5份
血竭提取液0.5份
助溶剂14.5份
水15份。
所述保湿剂为丙二醇，所述防腐剂为羟苯甲酯，所述增稠剂为卡波姆，所述助溶剂为丙二醇。
应用例2
将实施例2提取得到的铁皮石斛叶提取物制成面膜，面膜包括a相组分和b相组分，
与应用例1的区别在于：
所述a相组分包括如下重量份数的原料：
保湿剂27份
防腐剂0.5份
增稠剂0.8份
透明质酸钠4份
水30份
所述b相组分包括如下重量份数的原料：
实施例2得到的铁皮石斛叶提取物10份
黄芩提取物5份
番红花提取物1份
血竭提取液1份
助溶剂17份
水30份。
应用例3
将实施例3提取得到的铁皮石斛叶提取物制成面膜，面膜包括a相组分和b相组分，
与应用例1的区别在于：
所述a相组分包括如下重量份数的原料：
保湿剂18.5份
防腐剂0.2份
增稠剂0.6份
透明质酸钠0.2份
水5份
所述b相组分包括如下重量份数的原料：
实施例3得到的铁皮石斛叶提取物5份
黄芩提取物0.1份
番红花提取物0.1份
血竭提取液0.1份
助溶剂12份
水5份。
对比例1
本对比例与应用例1的区别在于：将乙醇回流法提取得到的相同重量分数的铁皮石斛叶提取物替换应用例1中的铁皮石斛叶提取物。
对比例2
本对比例与应用例1的区别在于：将现有的铁皮石斛茎提取物替换应用例1中的铁皮石斛叶提取物。
对应用例1-3和对比例1-2的面膜进行皮肤影响测试，测试方法如下：
将受试人群分为5组，分别为第1-第5组，每组10人，受试人群客观分组，并且对产品成分不知情，排除心理因素对产品整体评价的影响。
在使用面膜前，受试者使用相同的温和清洁剂清洗脸部，在受试者脸部左右两侧对称位置选定约5×5cm2大小的区域作为实验区域，第1至第5组均在在脸部左侧覆盖约4×4cm2的应用例1的面膜，第1至第5组分别在脸部右侧覆盖等面积等量的应用例2、应用例3、对比例1、对比例2、清水，使用频率为早晚各一次，连续每天使用。
在使用面膜前，在每位受试者测试区域用callegarisoftplus皮肤测试仪的弹性探头检测每个试验部位初始弹性m0值（取10个人的均值），使用面膜第1、3、5周的次日，用callegarisoftplus皮肤测试仪的弹性探头检测相应个试验部位弹性m值（取10个人的均值），计算第1、3、5周相应试验部分的（m-m0）/m0的数值（即计算一定周期后相应部分弹性值相对该部位初始弹性的提升率），得到下表。
由上表的第1组-第2组的数据可以看出，本发明的铁皮石斛叶提取液做成的面膜对恢复皮肤弹性有显著的作用，也即可以理解为本发明的面膜抗衰老效果显著，其中，以应用例1的效果最为显著。由第3组和第4组数据可以分别看出，以乙醇回流法提取得到的相同重量分数的铁皮石斛叶提取物做成的面膜（对比例1）和现有的铁皮石斛茎提取物做成的面膜（对比例2）效果均不如本发明应用例1的显著，可以推断本发明提取的铁皮石斛叶提取物在护肤品应用上效果更好。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。