红景天苷在制备补体抑制剂药物中的用途的制作方法

本发明涉及红景天苷的新用途，具体地，在制备补体抑制剂药物中的用途。
背景技术：
：补体系统是一组存在于人和动物体液中及细胞表面，经活化后具有生物活性，可介导免疫和炎症反应的蛋白。补体系统广泛参与机体微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。补体系统在机体内不仅具有重要的防御作用，而且在各种生理活动和稳态平衡中扮演着重要的角色，可以参与免疫复合物的分解代谢、坏死细胞的清除以及调节适应性免疫应答。在正常生理条件下，补体系统的激活和抑制处于平衡状态；而在病理状态下，补体系统处于过度激活的状态，从而加速病情的恶化。其中，补体系统有三条激活途径：经典途径、旁路途径以及凝集素途径(图1)。不同补体途径激活后，形成c3转化酶(c4b2b或c3bbb)，导致补体因子c3活化。活化的c3在c3转化酶的作用下裂解成c3a和c3b。c3a是一种过敏毒素，与其受体(c3ar)结合后，可以募集肥大细胞和嗜碱性粒细胞，加剧炎症反应。c3b则参与补体介导的调理作用和免疫粘附作用，并且参与形成c5转化酶，促使c5在c5转化酶的作用下酶解成c5a和c5b，激活补体下游级联反应。c5b与c6、c7、c8、c9共同形成膜攻击复合物(membrane-attackcomplex)，在目标细胞的细胞膜上产生孔。与c3a相似，c5a具有过敏毒素的作用，与其受体结合后，可以募集肥大细胞和嗜碱性粒细胞，加剧炎症反应，使病情恶化。补体系统的异常与许多疾病的发生发展密切相关，并且，这些疾病多属于罕见病，尚无特效治疗药物。由于补体系统成分多样，结构复杂，给药物开发带来了诸多挑战，尤其是小分子化合物。同时，补体系统涉及的疾病多样，患者个体差异较大，在开发补体系统药物时也需要考虑特定的适应症和患病人群。(季鸣，补体系统药物研究进展，《中国生化药物杂志》，2016年第12期第36卷)红景天苷[(4-羟基-苯基)-β-d-吡喃葡萄糖苷]，其结构式如图2所示，分子式：c14h20o7，分子量：300.3044，是红景天属(rhodiold)植物中广泛存在的酚苷类化合物，可从植物根、茎提取，亦可通过生物合成途径、化学合成途径、生物催化合成途径等其他途径合成。红景天苷为低含量浅棕色粉末，99％含量为白色粉末；味甜，极易溶于水，易溶于甲醇，溶于乙醇，难溶于乙醚。作为药物，红景天苷的临床应用尚欠缺，关于红景天苷的各方面临床应用鲜有报道，且没有报道关于红景天苷作用于补体系统，治疗补体系统过度激活导致的炎症疾病。技术实现要素：本发明提供了红景天苷的新用途，具体地，是在制备补体抑制剂药物中的用途。本发明提供了红景天苷在制备补体抑制剂药物中的用途。其中，所述的药物是治疗神经炎症或神经退行性疾病的药物。其中，所述的红景天苷由高山红景天(rhodioldroseal.)原药材制备而成。其中，所述的红景天苷结构式如下：本发明还提供了一种抑制补体系统的药物组合物，它是由有效量的红景天苷为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。本发明还提供了所述的药物组合物在制备补体抑制剂药物中的用途。其中，所述的药物组合物是治疗神经炎症或神经退行性疾病的药物。本发明红景天苷药物可以作用于补体系统中的凝集素途径，经典途径，直接抑制神经细胞，血管内皮细胞和其它脑细胞的补体系统激活，发挥神经保护作用。可有效治疗治疗神经炎症或神经退行性疾病，药效明确，且质量可控，安全，为临床提供了一种新的选择。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1补体系统激活途径：经典途径、旁路途径以及凝集素途径图2红景天苷化学结构式图3红景天苷对cocl2诱导pc12细胞凋亡的影响图4红景天苷对cocl2诱导的pc12caspase-3活性的影响图5红景天苷对pc12细胞低氧损伤后c3蛋白表达的影响图6加入c3a受体激动剂和拮抗剂后，红景天苷对其caspase-3活性的影响图7缺血性再灌注24小时后igm和vegf的变化情况图8红景天苷对颅内缺血性再灌注引起的igm和annexiniv的影响图9红景天苷对颅内缺血性再灌注引起的mbl-2的影响图10红景天苷对颅内缺血性再灌注引起的c1q的影响图11红景天苷对颅内缺血性再灌注损伤后c3蛋白表达的影响图12红景天苷对颅内缺血性再灌注损伤后c3和c3a的影响图13红景天苷和c3ara在颅内缺血性再灌注损伤后24小时内对neun的影响图14红景天苷和c3ara在颅内缺血性再灌注损伤后48小时内对neun的影响具体实施方式实施例1本发明抑制补体系统的药物的制备取市售红景天苷(纯度为98％)，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分，制备成药剂，即可。以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。试验例1本发明红景天苷对补体系统的抑制作用1实验材料:1.1实验细胞:pc12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。1.2实验试剂:见表1-3表1实验试剂盒表2实验试剂表3抗体名称货号/规格厂家egr1(588)抗体sc-110santacruzegr4(u-25)抗体sc-133540santacruzarc(c-7)抗体sc-17839santacruzβ-actin抗体aa128碧云天1.3实验仪器表4实验仪器红景天苷(纯度为98％)，市售品。2实验方法：2.1细胞培养：pc12细胞接种于25cm培养瓶中，加入含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的改良型rpmi-1640培养液，置于37℃、5％co2饱和湿度的恒温培养箱中常规培养、传代。2.2实验分组与处理：取对数生长期的pc12细胞经0.25％的胰酶消化，收集于离心管后离心，弃去上清液加入培养基后重悬摇匀，接种于培养板上培养过夜，细胞按照要求分为5组：正常对照(normal)组、control组、cocl2+0.1μmsal组、cocl2+1μmsal组、cocl2+10μmsal组，待细胞长到80％后pbs洗一遍，各组加入含cocl2的培养基(cocl2的终浓度为200μm)，之后给药组立即给药不同浓度的红景天苷，正常对照组则加入相同的培养基，细胞继续培养48h，收集样品，用于实验。2.3tunel染色观察细胞凋亡：取对数生长期的细胞以2×105个/ml的密度均匀接种于6孔板中，每孔3ml，板孔内预先放有经过灭菌处理并用多聚赖氨酸包被过的长条玻片，进行细胞爬片。待细胞长到80％后pbs洗一遍，200μm氯化钴处理，同时给药组立即加入不同浓度的红景天苷，给药48h后，取出各组爬片，按tunel试剂盒使用说明进行操作，抗荧光淬灭封片液封片，避光。荧光显微镜下观察拍照，记录结果，各组随机选取5个视野计数细胞总数和凋亡细胞数，细胞凋亡率(％)＝凋亡细胞数/总细胞×100％。2.4caspase-3活性的检测：测定各组pc12细胞中caspase-3活性，方法按照试剂盒操作说明书进行。简述如下：按2×105个/ml接种于96孔板，每孔100μl，待细胞长到80％后pbs洗一遍，经cocl2造模红景天苷给药处理细胞48h后，预冷的pbs漂洗一遍后，加入25μl试剂盒中的细胞裂解液，冰上静置5min，再加入200μlac-devd-amc(caspase-3四肽荧光底物)，于37℃避光孵育1h后在多功能酶标仪上测定荧光强度，激发波长380nm，发射波长为420nm，单位以relativefluorescenceunits(rfu)表示。2.5westernblot法分析pc12细胞相关蛋白表达：2.5.1提取细胞总蛋白：(1)将细胞培养板置于冰上，用预冷的pbs漂洗细胞1遍后，尽量吸尽pbs。(2)加入细胞裂解液(含有1％pmsf)，用1ml带针头的注射器反复吸吹数次，充分裂解后，用ep管收集裂解液，4℃12000rpm离心5min。(3)吸取上清液，按蛋白：上样缓冲液＝4:1的比例加入上样缓冲液，100℃水浴锅中放置10min使蛋白充分变性，之后4℃12000rpm离心5min，即得细胞总蛋白，置于4℃保存备用。2.5.2目的蛋白检测：(1)配胶：根据目标蛋白分子量大小，按照sds-page凝胶配制试剂盒说明书配置合适浓度的分离胶。(2)上样：用移液枪将样品蛋白依次加到样品槽中，加入彩色预染蛋白质分子量标准作为标识。(3)电泳：浓缩胶40v30min，分离胶90v90min，电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部时终止电泳。(4)转膜。转膜成功后tbs洗一遍，把pvdf膜浸泡在封闭液中，置于摇床上室温封闭2小时。(5)加入一抗：封闭好的pvdf膜用tbs洗涤10min，加入一抗稀释液，各一抗稀释倍数分别为egr1一抗(1:800)、egr4一抗(1:600)、arc一抗(1:600)、β-actin(1:3000)。4℃孵育过夜。(7)次日加入相应稀释比例二抗，室温孵育2小时。弃二抗稀释液，用tbs洗涤(10min×3)，显影。(8)分析：用凝胶图像处理系统分析目标条带的灰度值，分别计算各组目的蛋白与β-actin内参灰度值的比值，并统计各组之间的差异。2.6rt-qpcr检测c3、egr4mrna的表达：2.6.1用qiagenminikit提取细胞总rna：(1)配置rpe工作液：将4倍的无水乙醇加入rpe工作液后充分混匀，裂解细胞。(2)在6孔细胞培养板中，每孔加入350μlrlt缓冲液(含1％β-巯基乙醇)，用移液枪反复吹打细胞数次，使孔内细胞充分裂解均匀。(3)每孔加入350μl70％乙醇，充分混匀后，用移液枪吸取700μl混合液放入rneasy离心柱中，盖紧盖子，4℃8000g离心15s，弃离心液。(4)吸取700μlrw1缓冲液加入rneasy离心柱中，盖紧盖子，4℃8000g离心15s，弃离心液。(5)吸取500μlrpe工作液放入rneasy离心柱中，盖紧盖子，4℃8000g离心15s，弃离心液。(6)吸取500μlrpe工作液放入rneasy离心柱中，盖紧盖子，4℃8000g离心2min，将离心柱取出放入新的1.5ml无酶ep管中，加入30μlrnase-free水，4℃8000g离心2min，得下清液，将的到的下清液样品置于-80℃保存备用。(7)每个样本取1μl，于紫外分光光度计测量样品的浓度和纯度。总rna的od260/od280＝1.8～2.0之间表明纯度较高(小于1.8说明所提rna降解，大于2.0说明有蛋白质被污染)。2.6.2cdna的合成、以及cdna为模板建立rt-qpcr反应体系：(1)cdna的合成，以及rt-qpcr反应体系同上，操作步骤详见第一章2.6.2和2.6.3。(2)引物序列、产物长度和退火温度如下：2.6.3结果分析：(1)以gapdh为内参，校正每个样品的ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，得δct值。以2-δδct法计算各组间mrna的表达量。δδct＝各组(ct目的基因—ctgapdh)一对照组(ct目的基因—ctgapdh)，2-δδct＝各组基因表达量/对照组基因表达量。(2)每组实验重复三次。2.7利用cocl2诱导pc12细胞低氧损伤为模型，按分组分别加入c3a受体激动剂和其拮抗剂，检测caspase-3活性的变化:取对数生长期的细胞，实验按要求分为nomal组，control组，c3ar激动组，c3ar激动+10μmsal组，c3ar拮抗组，c3ar拮抗+10μmsal组，10μmsal组，实验经cocl2造模红景天苷给药方法同2.2，之后按照说明书步骤，根据分组要求相应的加入c3ar受体激动剂、拮抗剂，处理48h后收集样品，检测caspase-3活性的变化，方法同2.4。2.8统计学分析：用spss18.0统计软件进行统计学处理，所有结果用均数±标准误(x±sem)来表示。各组间数据比较采用t检验和单因素方差分析(one-wayanova)，以p<0.05为有显著性差异。3.实验结果：3.1红景天苷对cocl2诱导pc12细胞凋亡的影响：tunel法染色显示，200μmcocl2处理pc12细胞48h后，凋亡细胞数目明显增多，经不同浓度红景天苷给药后，凋亡细胞数目显著减少，且呈剂量依赖性，10μm红景天苷作用的效果最好，对各组细胞凋亡率进行统计，不同浓度给药组较模型组存在显著性差异，如图3，图4所示，图3中，a为normal组，b为control组，c为cocl2+0.1μmsal组，d为cocl2+1μmsal组，e为cocl2+10μmsal组，与control组比较，**p<0.01。3.2红景天苷对pc12细胞低氧损伤后caspase-3活性的影响:200μmcocl2处理pc12细胞48h后，与normal组比较，control组中caspase-3活性显著升高，经不同浓度红景天苷处理后，细胞caspase-3活性明显下降，且呈剂量依赖性，10μm红景天苷作用的效果最好，实验结果见图5。与control组比较，*p<0.05，**p<0.01。3.3红景天苷对cocl2诱导pc12细胞低氧损伤后c3蛋白表达水平的影响：如图6所示：与normal组比较，control组中c3蛋白高度表达，存在清晰的阳性表达条带；不同剂量给药组中c3蛋白有阳性条带表达，但显然没有模型组清楚，而且随剂量的递增条带的表达减弱。根据结果表明，红景天苷对补体c3有明显的抑制作用，而且这种作用存在剂量依赖性。图6中，与control组比较，**p<0.01。3.4对pc12细胞中c3ar激动剂和拮抗剂后，红景天苷对其caspase-3活性的影响：如图7所示，与control组比较，对pc12细胞中c3a受体激动后caspase-3明显升高，对c3a受体拮抗后，caspase-3活性显著降低，经给药红景天苷后，细胞中caspase-3活性显著降低，具有统计学意义。图7中，与control组比较，*p<0.05，**p<0.01。4.小结本发明先采用cocl2诱导pc12化学性缺氧模型，模拟体内脑缺氧情况，从体外研究红景天苷对缺氧神经细胞补体系统的作用。本发明发现红景天苷能抑制cocl2诱导pc12神经细胞c3蛋白水平的提高；红景天苷和c3a受体拮抗都能抑制细胞凋亡指标caspase-3的活性，两者抑制程度相当，而且没有叠加作用；相反地，红景天苷能逆转c3a受体激动剂增强caspase-3的活性。这些结果表明红景天苷能抑制缺氧神经细胞补体c3的激活，从而发挥神经保护作用。实验例2红景天苷抑制缺血性脑损伤大鼠补体系统的激活1实验材料1.1实验动物spf级sd大鼠，雄性，体重280±20g，144只，由福建中医药大学实验动物中心提供，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2007000509960，许可证号：scxk(沪)2012-0005，适应性饲养7d后用于实验。1.2实验药物红景天苷(纯度为98％)，市售品。1.3实验试剂表5实验试剂表6实验仪器名称型号厂家电热恒温培养箱dhp-9052上海一恒快速混匀器sk-1常州国华高速台式冷冻离心机primorthermo荧光定量pcr仪7900htappliedpcr仪c1000bio-rad紫外可见分光光度计nd2000cthermo基础电泳仪电源powerpacbasic小型垂直电泳槽miniprotean小型转印槽minitrans-blot石蜡切片机hm325thermo激光共聚焦显微镜lsm710zeiss脑立体定位仪51900stoeltingqsi微量注射泵53311stoelting颅骨钻78001瑞沃德1.5主要溶液配制1)4％多聚甲醛：磷酸二氢钠3.0g，十二水合磷酸氢二钠35.0g，多聚甲醛40.0g，加入到1l蒸馏水中充分溶解至溶液澄清。2)柠檬酸盐缓冲液：柠檬酸盐缓冲液粉末加入到2l蒸馏水中充分溶解。3)免疫组化pbs缓冲液：pbs缓冲液粉末加入到2l蒸馏水中充分溶解。4)tbs缓冲液：氯化钠17.6g，trisbase12.1g加入到2l蒸馏水中充分溶解，用盐酸调ph值在之间7.0-7.2之间，加入0.1％曲拉通x-100溶解。2实验方法2.1大鼠mcao模型的制备采用颈内动脉线栓法制备mcao模型。步骤：动物麻醉后，仰卧固定于手术台上。剪去颈前的鼠毛，沿颈部正中切开皮肤，用止血钳钝性分离皮下组织，分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离见到颈动脉鞘。分离动脉鞘后可见光滑的颈总动脉，分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉。结扎颈内动脉的线先不系紧，用来插线栓时防止出血用。动脉夹夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口，插入线栓，线栓进入颈内动脉后，颈总结扎线稍向右拉，线栓弧度稍向右向下。插入成功后，拿开动脉夹，结扎颈内动脉，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。缝合伤口，并在皮肤外面的线栓一端绑上手术线，便于再灌拔线时观察。将大鼠放入笼中，2h后再灌拔线。假手术动物进行相同的操作，除了不栓塞中脑动脉。2.2侧脑室注射方法将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上。接着，用手术剪将大鼠头皮剪开，用大动脉夹将两侧的皮肤固定，保证清晰视野，用棉花擦开表面两层膜，找到大鼠前卥，用记号笔标记。接着，将坐标进行校正归零后，定位坐标：前卥旁开2.0mm，后下1.5mm。接着，用颅骨钻在头骨钻孔后，用微量推进器定于头骨下方3.5mm。让大鼠缓冲5min后，按0.5μl/min的速率注入试剂。注入完成后，让大鼠缓冲5min再对大鼠的伤口进行缝合。2.3神经功能评分按照zea-longa等神经行为缺损评分标准，0分为正常，无神经学征象；1分：动物不能完全伸展对侧前肢；2分：动物行走时向偏瘫侧转圈；3分：动物行走向偏瘫侧跌倒；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺损评分在≥2分为模型成功，评分过程至少由2人参与完成。2.4分组及给药2.4.1造模后红景天苷给药实验大鼠72只，随机分成假手术(sham)组24只，和造模组48只，造模成功后，抽签法随机分为mcao模型对照(mcao)组24只，红景天苷给药(mcao+sal)组24只，给药组每天腹腔注射50mg/kg红景天苷，其它组均给予腹腔注射等量生理盐水，分别连续给药1d和2d。6d的动物样品选用第一章的实验样品。2.4.2侧脑室注射c3ar抑制剂后造模并红景天苷给药实验大鼠72只，随机分为侧脑室注射人工脑脊液36只，侧脑室注射c3ar抑制剂36只(c3ar抑制剂注射量为1mg/kg)，30min后制作mcao模型，实验分为6组，即人工脑脊液+假手术(sham)组，c3ar抑制剂+假手术(c3ara+sham)组，人工脑脊液+mcao模型(mcao)组，c3ar抑制剂+mcao模型(c3ara+mcao)组，人工脑脊液+mcao+红景天苷给药(mcao+sal)组，c3ar抑制剂+mcao+红景天苷给药(c3ara+mcao+sal)组，于再灌注1h后，红景天苷给药组大鼠每天腹腔注射50mg/kg红景天苷，其它组均给予腹腔注射等量生理盐水，分别给药1d和2d，且每天侧脑室注射1次，末次给药后取大鼠缺血侧脑组织。2.5免疫组织化学荧光法检测蛋白表达1)灌注取脑：大鼠麻醉后，固定于鼠板上，剪开腹部，用采血针采集静脉血后用动脉夹夹紧血管，剪开胸腔至颈部，暴露心脏，心尖插入剪平的灌注针头，剪开右心耳，先灌注0.9％生理盐水约300ml，至右心耳流出无血色液体且大鼠四肢及两肺变白可改换灌注4％多聚甲醛，直至大鼠心肝肺颜色变白、四肢僵硬，迅速断头，取脑，确保脑组织完整性，将脑组织用4％多聚甲醛在4℃固定24h，接着用蒸馏水清洗脑组织至无味，平均切成6片，置于70％乙醇中，进行包埋。2)包埋脑组织：按80％乙醇浸泡40min、90％乙醇浸泡40min、95％乙醇浸泡40min、100％乙醇ⅰ浸泡30min、100％乙醇ⅱ浸泡30min、100％乙醇ⅲ浸泡20min、石蜡ⅰ浸泡20min、石蜡ⅱ浸泡30min、石蜡ⅱ浸泡30min的条件依次进行组织脱水后，用石蜡按包埋盒，组织，模具的顺序将组织包埋，冷却后，放-20℃冷冻15min，接着掰下完整组织块。3)切片：修正蜡块，用石蜡切片机先10μm粗修至组织出现，再5μm切片至组织完整出现，在42℃的蒸馏水中摊片，组织片完全摊开，无褶皱，无气泡，用粘附载玻片捞片，60℃下烘烤3h，可室温储存组织片。4)组织脱蜡、复水：组织片60℃下烘烤30min后按二甲苯ⅰ浸泡15min、二甲苯ⅱ浸泡15min、100％乙醇浸泡5min、95％乙醇浸泡5min、90％乙醇浸泡5min、80％乙醇浸泡5min、70％乙醇浸泡5min、蒸馏水浸泡5min的条件依次进行组织脱蜡、复水。5)抗原修复：用微波炉煮沸适量的柠檬酸缓冲液，将装有组织片的架子放入柠檬酸缓冲液中，在沸水浴中加热13min后，室温自然冷却。6)取出装有组织片的架子，用pbs缓冲液清洗3次，每次5min。7)将甩去组织片上液体后，放入装有蒸馏水的湿盒中，用免疫组化笔沿着组织外围画圈。8)封闭：用含10％羊血清的5％bsa封闭液室温封闭2h。9)一抗孵育：甩去组织片上液体后，用5％bsa稀释的一抗4℃孵育过夜。10)隔天将组织片取出，复温30-45min后，用pbs缓冲液清洗3次，每次5min。11)二抗孵育：甩去组织片上液体后，用5％bsa稀释的二抗室温避光孵育1.5h。12)用pbs缓冲液避光清洗3次，每次5min。13)甩去组织片上液体后，用dapi核染8min，避光。14)用pbs缓冲液避光清洗3次，每次3min。15)甩去组织片上液体后，加入半滴抗淬灭剂，用confocal专用盖玻片封片。16)用荧光显微镜低亮度初步观察，确定有荧光后，再用激光扫描共聚焦显微镜观察，采用zenlight软件读取荧光信号。2.6实时荧光定量pcr法检测基因表达2.6.1总rna的提取及浓度检测将冻存左侧大脑取出，在液氮的辅助下，用研钵研磨脑组织成粉末，混匀之后对总rna进行提取和浓度检测，操作如下：1)取30mg粉末于1.5mlep管，加入600μlrna裂解液(rlt+1％β-巯基乙醇)；2)用1ml针管破碎充分后加入等量的70％乙醇，混匀后；3)分两次离心，每次取600μl加入到rneasy柱子中，12000r，15s，弃下清液；4)取700μlrw1到rneasy柱子中，12000r，15s，弃下清液；5)取500μlrpe工作液(rpe缓冲液：无水乙醇＝1：4)到rneasy柱子中，12000r，15s，弃下清液；6)取500μlrpe工作液到rneasy柱子中，12000r，2min，弃下清液；7)移柱子至1.5mlep管，加30μl无酶水，12000r，2min，得下清液；8)每个样品取1μl，在紫外可见分光光度计上检测总rna的浓度，并测得总rna的a260与a280的比值在1.8～2.0之间，样品-80℃储存。2.6.2将rna逆转录成cdna采用二步法，第一步取11μl样品rna加入200μl无酶ep管后加入1μlrandomhexanerprimer，混匀离心后在65℃条件下孵育5min。第二步即分别将4μl5xreactionbuffer，1μlribolockrnaseinhibitor，2μl10mmdntpmix，1μlrevertaidm-mulvreversetranscriptase加入12μl孵育样品中，混匀离心后在25℃条件下孵育5min，在42℃条件下孵育60min，在70℃条件下孵育5min，即可逆转录成cdna。2.6.3rt-pcr扩增按10μlsybrselectmastermix，2μlforwordprimer，2μlreverseprimer，2μlcdna，4μlddh2o的pcr反应体系，以cdna为模板，95℃预变性10min，95℃变性15s，退火60℃15s，40个循环为反应条件进行pcr扩增。每次做两个复孔，重复检测三次，计算两个复孔的ct值，以gapdh为内参计算2-δδct值。pcr引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照genbank中大鼠il-6、neun、c3、c3a、c1qa、egr1、egr2、egr4、arc、gapdh的引物序列。表7il-6、neun、c3、c3a、c1qa、egr1、egr2、egr4、arc、gapdh引物序列基因引物序列产物长度/bpil-6f:5'-agacttcacagaggataccacccac-3'129bpr:5'-caatcagaattgccattgcacaa-3'neunf:5'-gggttttgggtttgtaacttttgaa-3'188bpr:5'-agactgctcctaccacagggtttag-3'c3f:5'-aaaatggaatctctacgaaggtca-3'157bpr:5'-agtcgcaggtcaatgaagaagtc-3'c3af:5'-gtctgcggaagtgttgtgagga-3'129bpr:5'-gtgatatagttgcagcagtccatga-3'c1qaf:5'-accaggagaatccataccagaacc-3'120bpr:5'-aggaggacacgatagacagacaaag-3'egr1f:5'-ctgacatcgctctgaataacgaga-3'169bpr:5'-acaaggccactgactaggctgaa-3'egr2f:5'-actgctaccccctacaatccgc-3'138bpr:5'-gaacctcctgtcgcaaccctct-3'egr4f:5'-cttcaacctcatgtctggcatctt-3'128bpr:5'-gggagtaaaggtccggcaac-3'arcf:5'-ggagaacaacttggacggctatg-3128bpr:5'-gcatctcacgcttgacccag-3'gapdhf:5'-caacgggaaacccatcacca-3'96bpr:5'-acgccagtagactccacgacat-3'2.7westernblot法检测蛋白表达2.7.1组织细胞总蛋白的提取取出冻存左侧大脑，称重后，在液氮的辅助下，用研钵研磨脑组织成粉末后按以下步骤对组织细胞总蛋白进行提取：1)按每0.1g组织加入1mlripa裂解液(在ripa裂解液使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm)；2)用1ml针管破碎充分，转移到ep管中，离心5min、14000r；3)取上清液于新ep管中，加入浓缩的sds-page蛋白上样缓冲液(1x)；4)金属浴100℃加热10min，以充分变性蛋白；5)冷却到室温后，离心5min、14000r，4℃储存。2.7.2细胞核和细胞质中nf-κb的p50蛋白提取取出冻存左侧大脑，称重后，在液氮的辅助下，用研钵研磨脑组织成粉末后按以下步骤对细胞核和细胞质中nf-κb的p50蛋白进行提取：1)取出冻存左侧大脑，称重后，在液氮的辅助下，用研钵研磨脑组织成粉末；2)按每0.1g组织加入1ml加入胞浆提取试剂(cer)(在使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终工作浓度为1mm)；3)用1ml针管破碎充分，转移到ep管内，冰浴放置30min；4)在振荡器上高速剧烈振荡混匀5s，4℃14000r，离心10min；5)立即吸取上清至一预冷的ep管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，加入浓缩的sds-page蛋白上样缓冲液(1x)，混匀，4℃储存；6)完全吸尽残余的上清，加入2倍体积的ner；7)在振荡器上高速剧烈振荡混匀15s，冰浴中孵育30mim，每隔5min再剧烈振荡混匀20s，4℃14000r离心10min；8)立即吸取上清至一预冷的ep管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，加入浓缩的sds-page蛋白上样缓冲液(1x)，混匀，4℃储存。9)金属浴100℃加热10min，以充分变性蛋白；10)冷却到室温后，离心5min、14000r，4℃储存。2.7.3蛋白的检测根据目标蛋白分子量大小，按照sds-page凝胶配制试剂盒说明书配置合适浓度的分离胶和浓缩胶后按以下的步骤进行蛋白检测：1)上样：拔出浓缩胶里的梳子，将凝胶固定在电泳槽中，加入电泳液，用移液器将样品蛋白依次加到样品孔中，最后一孔加入彩色预染蛋白作为标识。2)电泳：将电泳槽与稳压直流电源相连，调节电压40v，时间40min，待溴酚蓝条带进入分离胶后调电压90v，时间90min，电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部时终止电泳。3)转膜：电泳结束后将凝胶板从电泳仪中取出，用绿板从玻璃短板底部轻撬开玻璃短板，取出目的凝胶置于浸湿转膜液的凝胶夹板上，覆盖上pvdf膜(预处理：用甲醇浸泡3～5s)，放入已装有转膜液的转膜槽中，置于冰中，根据目的蛋白分子量设置电压与时间进行转膜。4)丽春红染色：将膜从电泳槽中取出，剪角做正反面记号，用丽春红染色液对pvdf膜染色，如果出现红色条带即转膜成功，再用缓冲液(tbs)在摇床上摇动清洗pvdf膜3次，每次10min直至洗去丽春红染色液。5)封闭：加封闭液，在摇床上缓慢地摇动，室温封闭2h。6)一抗孵育：封闭完后，取出膜，用tbs液在摇床上摇动清洗10min，参考一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，将膜完全浸没在已配制好的一抗中，4℃孵育过夜。7)二抗孵育：隔天将膜取出，用tbs液在摇床上摇动清洗3次，每次10min。参考二抗说明书，按照适当比例用二抗稀释液稀释二抗。将膜完全浸没在已配制好的二抗中，在摇床上缓慢地摇动，室温放置2h。将膜取出，用tbs液在摇床上摇动清洗3次，每次10min。8)显影：在凝胶成像系统密封暗箱板上铺一层保鲜膜，将膜蛋白面朝上，用移液器吸取发光工作液(化学发光试剂a液：b液按1:1体积混匀)，均匀地滴在pvdf膜上，关闭密封暗箱，显影。9)分析：用凝胶图像处理系统检测目标条带的灰度值，并分别计算各组与β-actin或者pcna灰度值的比值，并统计各组之间的差异。2.8统计学分析方法用spss18.0统计软件进行统计学处理，除了神经损伤评分分析(非参数检验，mann-whitneytest)，数据用表示，各组间数据比较采用单因素方差(one-wayanova)，以p<0.05为有显著性差3.实验结果3.1红景天苷不仅抑制缺血再灌注(iri)24小时后的凝集素激活途径，而且抑制缺血再灌注48小时后的c1q的蛋白水平本发明红景天苷对脑组织iri后补体激活的影响。在没有红景天苷的情况下，我们观察到igm的免疫荧光在iri后24小时与梗死区域的血管内皮细胞上的vegf免疫荧光重叠，实验结果见图8。同时，我们观察到igm和mbl-2，igm和annexiniv免疫荧光重叠，结果见图9，图10。定量分析显示，与假手术组相比，iri后24h和48h，igm，mbl-2和annexiniv的免疫荧光信号均显着增加。然而，凝集素通路的上游成分在第24h后趋于减弱。因此，在48h时，igm和mbl-2的水平显着低于iri后24h，而annexiniv在24h蛋白水平也比48h高。由iri引起的igm，mbl-2和annexiniv增加的免疫荧光信号均被红景天苷抑制(图9和图10)。相比之下，经典途径的关键组成部分，c1q的水平在iri后逐渐增加。与假手术组相比，c1q在iri24小时后有增加的趋势，到48小时后c1q有显着增加。在iri后24h，红景天苷没有显着改变c1q水平，但红景天苷阻止了在iri48h后c1q的增加，实验结果见图11。3.2红景天苷抑制有iri诱导的脑组织c3和c3a的增加我们观察到c3的免疫荧光部分与梗死区域的igm一致(图12)。c3除了与凝集素途径的分子在血管内皮细胞上有重叠，c3还有部分与脑梗死区域的神经元标记neun重叠(图12)。免疫荧光的定量分析表明，与假手术大鼠相比，iri后24h和48h的梗死前区域c3明显增加，而这些增加均被红景天苷抑制(图13a)。westernblot也证实红景天苷抑制iri之后脑组织c3的增加(图13b和图13c)。为了证实c3被活化，我们测量了c3活性片段c3a。与假手术组相比，iri后24h和48h脑组织c3a增加，这些增加均被红景天苷抑制。有趣的是，虽然我们发现补体激活的凝集素途径的一些成分在大脑iri后48小时显着减弱，但c3和c3a的水平以及红景天苷对这些下降的影响在24和48h之后没有显着差异iri.3.3红景天苷缺血性脑损伤的神经保护作用是通过抑制c3活化为了进一步证实红景天苷抑制补体激活具有神经保护作用，我们测量红景天苷对神经元标记物neun的作用。我们发现，红景天苷能保护iri后24小时后梗死区域周围的神经元密度(图14a)。westernblot证实红景天苷能逆转iri后24h脑缺血脑组织neun水平的降低(图14b)。而且，与单独使用载体相比，红景天苷和c3ara在iri后将neun24h的表达增加到相似的程度，而c3ara和红景天苷没有叠加的作用(图14b)。类似地，红景天在iri后48小时保护了脑梗死区域的神经元密度。红景天苷和c3ara在iri后将neun24h的表达增加到相似的程度，而c3ara和红景天苷没有叠加的作用。c3ara不影响假手术动物中neun的水平(图14b)。有趣的是，红景天苷和c3ara在保护neun的作用在24h和48h时间点没有显着差异(图14)，尽管与iri后24h对照组相比，48h后凝血素通路的成分显着降低，c1q显着增加。4.小结本发明以大鼠缺血再灌注脑损伤为模型，研究红景天苷对缺血性神经损伤诱导的补体系统激活的调控作用。我们首次发现红景天苷能抑制早期缺血再灌注血管内皮细胞凝集素途径的激活，而且能抑制缺血再灌注48小时后经典途径c1q的蛋白水平。而且，通过给予动物红景天苷和c3ara，我们发现红景天苷抑制补体系统的活性具有神经保护作用。综上所述，本发明红景天苷能够有效治疗治疗神经炎症或神经退行性疾病，药效明确，且质量可控，安全，为临床提供了一种新的选择。当前第1页12