一种细胞制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物学
技术领域：
，具体涉及一种细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：银屑病是一种免疫细胞介导的慢性炎症性皮肤病，在全世界发病率为2～3％，在我国发病率为0.13-1.23％。我国银屑病患者已经达到170万人。由于银屑病常伴随剧烈瘙痒且极易复发，不仅严重影响患者的生活质量，而且给患者带来极深的心理、生理和经济负担，有调查表明银屑病病人生活质量与肿瘤、心脏疾病患者等同甚至更差。大约1/4的患者会发展成银屑病关节炎，银屑病关节炎患者会产生继发的机体功能残疾。因此，银屑病仍然是急需解决的皮肤病界难题。银屑病的治疗常根据疾病严重程度进行分类治疗，常用的药物有：(1)局部用皮质甾类治疗：常见包括丙酸氯倍他索、丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、去羟米松；(2)节制激素疗法：维生素d类似物、维a酸类、他克莫司等，维a酸和维生素d类似物被认为是降低kc增殖并诱导分化；(3)口服药物治疗严重银屑病：主要有甲氨蝶呤、环孢菌素(降低t细胞活化进而抑制钙神经素的转录和活化t细胞的核因子)、阿维a(主要用于维持疗法或与光疗法联合应用)。由于其严重的不良反应和作用范围，这些药物对银屑病患者的要求较高。总之，目前银屑病的治疗还不十分理想，存在诸多不良反应和用药限制性，因此还需要人们积极开发安全、有效、经济的药物。干细胞具有自我增生、能分化成多种组织细胞的特性，用于治疗银屑病具有良好的应用前景，其中cn103191154b已经提供了间充质干细胞在治疗银屑病中的应用。皮肤干细胞是各种表皮细胞的祖细胞,来源于胚胎的外胚层，具有双向分化的能力。一方面可向下迁移分化为表皮基底层,进而生成毛囊；另一方面则可向上迁移，并最终分化为各种表皮细胞。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种含有皮肤干细胞的细胞制剂在制备预防和治疗银屑病药物中的应用，以及相关细胞制剂的制备方法。本发明提供了一种细胞制剂，包括皮肤干细胞、b淋巴细胞、il-37、吴茱萸碱和医学上可接受的溶剂。其中，b淋巴细胞为主要定居于淋巴结皮质浅层的淋巴小结和脾脏的红髓和白髓的淋巴小结内。b淋巴细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体(免疫球蛋白)，在机体体液免疫过程中发挥重要的作用。il-37具有抑制角质形成细胞的作用，能够限制炎症。目前的研究表明，il-37可促进半成熟角质形成细胞的形成，这些细胞迁移到淋巴结，但是不能以产生免疫反应的方式呈递抗原，il-37有助于角质形成细胞保持在一种半成熟的就绪状态，使角质形成细胞变得对新抗原不敏感，从而抑制角质形成细胞发挥炎症作用。吴茱萸碱可抑制nf-κb通路，可用于治疗改善银屑病。nf-κb信号通路为经典的炎症通路，降低nf-κb表达能够减少下游炎症因子的表达，如tnf-α炎症因子表达水平下降，从而减轻银屑病的病理学症状。优选地，所述皮肤干细胞的浓度为2×107～10×107个/ml；所述b淋巴细胞的浓度为1×106～3×106个/ml；所述il-37的浓度为30～50ng/ml；所述吴茱萸碱的浓度为10～30mg/ml。优选地，所述皮肤干细胞的浓度为10×107个/ml；所述b淋巴细胞的浓度为2×106个/ml；所述il-37的浓度为50ng/ml；所述吴茱萸碱的浓度为20mg/ml。优选地，所述b淋巴细胞来源于脾脏。优选地，所述溶剂为注射用生理盐水或5％葡萄糖注射液。本发明所述的细胞制剂用于发挥其治疗作用的关键在于提高b淋巴细胞和皮肤干细胞在制剂中的存活率，保证细胞的治疗率。因此制剂中的保存条件为至关重要的因素之一。优选地，所述细胞制剂的保存条件为0～4℃。本发明还提供了一种上述细胞制剂的制备方法，包括：将所述il-37、吴茱萸碱和溶剂混合，得到混合液；将所述混合液重悬所述皮肤干细胞和b淋巴细胞，得到所述细胞制剂。本发明还提供了上述细胞制剂或上述制备方法在制备预防和治疗银屑病药物中的应用。本发明的有益效果在于：(1)淋巴细胞作为治疗细胞，皮肤干细胞作为修复细胞，恢复皮肤功能，彻底治疗银屑病；(2)联合使用il-37，促进b淋巴细胞的功效，增强免疫调节作用，控制病情；(3)对供体的影响较少，只需要通过少量皮肤干细胞，就能全方位改善皮肤功能，逆转皮肤红斑、表皮增厚等现象。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为空白组小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图2为模型组小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图3为实验组1小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图4为实验组2小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图5为实验组3小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图6为对照组1小鼠背部皮肤破损处的he染色图片；图7为对照组2小鼠背部皮肤破损处的he染色图片。具体实施方式本发明所要解决的技术问题是提供一种含有皮肤干细胞的细胞制剂在制备预防和治疗银屑病药物中的应用，以及相关细胞制剂的制备方法。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例11.皮肤干细胞制备(1)皮肤干细胞的分离培养皮肤干细胞的分离培养过程参考王菁等在文献中报道的方法参考文献：王菁，李毅明，程波，等.快速贴壁法分离小鼠皮肤干细胞的研究，皮肤病与性病[j].2013，4：187-188，212。(2)皮肤干细胞的收集用10ml/皿的pbs对皮肤干细胞进行清洗2次，并弃去上清。加入1ml0.25％胰酶-0.02％edta至平皿中，待细胞皱缩变圆，加入5ml10％fbs+dmem高糖培养基终止消化，轻柔吹打细胞并转移细胞悬液至50ml离心管中，800g离心5min。离心结束后弃清液，往细胞沉淀中加入20ml的生理盐水重悬细胞，重复离心1次并重悬后得到所述皮肤干细胞。2.b淋巴细胞的制备(1)b淋巴细胞的分离培养和体外扩增的方法参考李文娟等在文献中报道的方法。参考文献：李文娟，邹家琦，韩欣欣，等.小鼠脾脏b淋巴细胞纯化培养方法的建立，中国组织工程研究[j].2015，2:207～212。(2)b淋巴细胞的收集用10ml移液管充分重悬b淋巴细胞，把细胞悬液全部转移至多个50ml离心管中，500g离心5min，弃上清，用生理盐水重悬细胞，800g离心5min，弃上清，用含有生盐水重悬后得到所述b淋巴细胞。3.本发明所述的细胞制剂的制备(1)按照il-37(30ng/ml，购自广州医药集团有限公司)和吴茱萸碱(30mg/ml，购自上海扶生实业有限公司)的浓度溶解于生理盐水中，混匀；(2)用含il-37和吴茱萸碱的生理盐水溶液重悬皮肤干细胞和b淋巴细胞，并调节皮肤干细胞浓度至10×107个/ml，调节b淋巴细胞浓度至3×106个/ml，混匀即得到本发明所述的细胞制剂。该细胞制剂于0～4℃保存或运输。4.干细胞制剂的质量检测将制备的细胞制剂送检，分别检测制剂中细菌、真菌、内毒素和五大病毒(甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、hiv)，检测结果显示，制剂在细菌、真菌、内毒素及五大病毒的检测中，均呈阴性，说明了该干细胞制剂的质量合格。实施例21.造模选取在健康、体重相近的balb/c小鼠60只，随机分为5组，12只/组，一组作为空白组，其余4组作为模型组。实验前耳部用脱毛膏去毛，面积约为1cm×1cm大小，空白组不作其他处理，模型组用5％咪喹莫特乳膏涂抹小鼠耳部皮肤进行诱导，每日涂抹一次，连续8天，剂量为22mg/cm2。在咪喹莫特诱导1-3天时，小鼠耳部皮肤出现红斑、有少量的鳞屑；在第六天时银屑病样症状达到顶峰。2.分组和给药按照表1所述的皮肤干细胞、b淋巴细胞、il-37和吴茱萸碱成分浓度配置的4组细胞制剂，并分别对应4组模型组进行给药，给药方式为：剃毛皮肤和银屑皮肤处进行皮肤内真皮层分散点打，1cm2的注射总体积为0.5ml；每周回注2天/次，连续8打次，观察疗效。表1.本发明的各成分比例3.检测指标每日观察局部皮肤变化，并记录。根据银屑病面积和严重程度评分标准，从红斑、表皮鳞屑、皮肤的肥厚程度3项指标进行评分，每个特征用0-4分评价：无症状为0分；轻度症状为1分；中度症状为2分；重度症状为3分；极重度为4分，累加得到总分，其中0分为最低分，12分为最高分。4.实验结果含有不同浓度的皮肤干细胞、b淋巴细胞、il-37和吴茱萸碱制成的细胞制剂治疗效果评分如表2所示，数据显示，空白组的皮肤损伤总评分为0.0，即未出现鳞屑、皮肤的肥厚程度，实验组1小鼠银屑病小鼠皮肤损伤总评分为9.0；而实验组2～4的皮损总评分分别为5.0、4.0、4.0，均低于实验组1，表明了实验组2～3对于改善银屑病红斑、表皮鳞屑和皮肤的肥厚具有更优的治疗效果。故本发明的最优方案为：30～50ng/mlil-37+10～30mg/ml吴茱萸碱+2×107～10×107个/ml皮肤干细胞+1×106～3×106个/mlb淋巴细胞。表2.各组的皮损总评分比较(0-12分)组别例数(只)2d4d6d8d总评分空白组120.00.00.00.00.0实验组1124.02.02.01.09.0实验组2123.01.01.00.05.0实验组3122.01.01.00.04.0实验组4122.01.01.00.04.0实施例31.造模选取在健康、体重相近的balb/c小鼠70只，随机分为7组，10只/组，其中1组为空白组，其余6组为模型组，将模型组小鼠按实施例2所述的银屑病小鼠造模方法进行造模。2.分组和给药将造模大鼠分为模型组、实验组1、实验组2、实验组3、对照组1和对照组2，各组给药、给药方式、给药时间如表3。其中实验组1、2和3分别对应给予细胞制剂5、6和7，细胞制剂为下列组分含量按照实施例1的方法制得的细胞制剂：细胞制剂5：10×107个/ml皮肤干细胞+1×106b淋巴细胞+30ng/mlil-37+20mg/ml吴茱萸碱细胞制剂6：10×107个/ml皮肤干细胞+2×106b淋巴细胞+50ng/mlil-37+20mg/ml吴茱萸碱；细胞制剂7：10×107个/ml皮肤干细胞+3×106b淋巴细胞+30ng/mlil-37+20mg/ml吴茱萸碱；阳性对照1：将生地8-20克，茺蔚子8-20克，白鲜皮8-20克，红花7-15克，紫草8-20克，茯苓7-15克，黄柏9-16克，苦参7-15克，七寸蛇5克，甘草5克，浮萍7-15克按照专利cn103272072a所述的制备方法制得的中药组合物；阳性对照2：车前子6-12克，黄芪6-10克，辛荑8-15克，生地10-15克，连翘9-20克，甘草8-16克按照专利cn103239555a所述的制备方法制得的中药组合物。表3.实验分组及给药、给药方式、给药时间分组给药给药方式给药时间空白组生理盐水外涂1次/天，连续2周模型组生理盐水外涂1次/天，连续2周实验组1细胞制剂5皮肤内真皮层分散点打1次/2天，连续2周实验组2细胞制剂6皮肤内真皮层分散点打1次/2天，连续2周实验组3细胞制剂7皮肤内真皮层分散点打1次/2天，连续2周对照组1阳性对照1组合物外涂1次/天，连续2周对照组2阳性对照2组合物外涂1次/天，连续2周3.细胞制剂对银屑病小鼠皮肤破损处皮层厚度的影响末次给药24h后处死小鼠，选取小鼠背部皮肤破损处，取材进行he染色以测量皮肤破损处皮层厚度，图1至图7为小鼠背部皮肤破损处的he染色图片。各组小鼠皮肤破损处皮层平均厚度如表4所示，模型组与空白组的表皮层厚度进行比较，表皮层厚度均增加达8倍，说明造模成功。对照组1和2、实验组1～3都与模型组的表皮层厚度进行比较，p<0.001，同样具有极显著差异，说明本发明所述的细胞制剂于阳性对照均能改善皮损表皮层厚度，且从数据可知，实验组1～3的表皮层厚度更小，效果更优。表4.细胞制剂对银屑病小鼠皮肤破损处皮层厚度的影响**表示与模型组相比，p<0.001，具有极显著差异。4.细胞制剂对银屑病小鼠皮肤破损处细胞增殖的影响末次给药24h后处死小鼠，选取小鼠背部皮肤破损处，取材进行免疫组织化学染色，并孵育增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)抗体，并用苏木精复染，以pcna细胞数/总细胞数占比作为评价指标评价小鼠皮肤破损处细胞增殖。细胞制剂对银屑病小鼠皮肤破损处pcna/总细胞数如表5所示，数据显示，模型组小鼠pnca占比明显升高，占比达到12.46％，损伤部位出现较为严重的炎症浸润和细胞增殖。给予不同浓度的细胞制剂和中药组合物治疗的各组银屑病小鼠细胞增殖情况有显著的改善(p<0.05)，其中给予本发明所述的细胞制剂的银屑病小鼠pcna占比下降近一半，达到5.82％，说明本细胞制剂对银屑病具有较好的治疗效果，且效果优于阳性对照组。表5.细胞制剂对银屑病小鼠皮肤破损处皮层细胞增殖的影响*表示与模型组相比，p<0.05，具有极显著差异。5.细胞制剂对银屑病小鼠尾鳞片颗粒层形成的影响末次给药24h后处死小鼠，在距尾根部约2cm处取背面皮肤一长条(1.5cm×0.2cm)，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，he染色。光镜下观察鼠尾鳞片颗粒层形成，计数连续100个鳞片中有颗粒层的鳞片数，并对各组数据进行统计学处理。细胞制剂对银屑病小鼠尾鳞片颗粒层形成的影响如表6所示，数据显示，模型组与空白组的鳞片表皮颗粒层进行比较，模型组有颗粒层的鳞片数显著增加，显示约有24.61％的鳞片出现了颗粒层。实验组1～3与模型组的鳞片表皮颗粒层进行比较，有颗粒层的鳞片数明显减少(p>0.05)，与此同时，阳性对照组1和2对颗粒层的鳞片数无显著影响，表明本发明所述的细胞制剂在改善银屑病小鼠尾鳞片颗粒层形成方面优于上述两个发明所述的中药组合物。表6.细胞制剂对银屑病小鼠尾鳞片颗粒层形成的影响*表示与模型组相比，p<0.05，具有统计学意义。当前第1页12