pH响应型磁性纳米粒子组装体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及无机纳米材料的组装，具体涉及一种ph响应型磁性纳米粒子组装体及其制备方法和应用。

背景技术：

在全球疾病中，肿瘤的致死率居第二位，仅次于心血管疾病。然而，对于大多数实体瘤，由于大多数患者在确诊时已属中晚期，错过了最佳治疗时机，故整体预后较差，如果可以在早期发现并且采取合适的治疗，其5年生存率可超过60％。因此，肿瘤的早期诊断和治疗具有重大的临床意义。

磁性纳米粒子由于其自身的磁性性能，在mr成像领域备受关注。其中，氧化铁纳米粒子、氟化钆钠、氧化锰等磁性纳米粒子得益于其优良的生物相容性和生物安全性，被广泛地研究和应用在临床上。

磁性纳米粒子mr成像包括t1加权成像和t2加权成像，粒径较大的磁性纳米粒子可以使周围氢质子具有较高的横向弛豫时间(t2)，经常被用来做t2加权成像；粒径较小的磁性纳米粒子可以使周围氢质子具有较短的纵向弛豫时间(t1)，常被用来做t1加权成像。t1加权成像的效果使肝部颜色变亮；t2加权成像的效果使肝部颜色变暗。相比之下，因为t1加权成像在实际诊断中更易分辨出肿瘤部位(明暗对比更明显)，临床上倾向于使用t1成像进行肿瘤的诊断。

多种纳米粒子包括脂质体、可降解的聚合物纳米粒子、铂纳米粒子聚集体和氧化铁纳米粒子，已经被研究用来作为纳米医药中的药物载体并表面修饰靶向因子进行hcc相关的肿瘤治疗。但是，现有技术中的磁共振纳米造影剂往往对比不够明显、毒性高、不具备智能响应的功能。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种ph响应型磁性纳米粒子组装体，该组装体在体内呈现良好的磁共振造影效果，不仅可以在肿瘤部位呈现明亮的t1造影效果，而且在正常组织部位呈现暗的t2造影效果，达到双重对比。

本发明所提供的技术方案为：

一种ph响应型磁性纳米粒子组装体，包括磁性纳米粒子，修饰在其表面的水溶性高分子以及通过短单链dna修饰在其表面的i-motifdna。

上述的技术方案中，ph响应型氧化铁纳米粒子组装体是由具有t1造影效果的磁性纳米粒子和ph响应的具有特定序列的双链i-motifdna经过组装得到的复合材料。该ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在癌症组织部位呈现明亮的t1造影效果，而且在正常组织部位呈现暗的t2造影效果。由于肿瘤部位为弱酸性微环境，ph响应的双链i-motifdna质子化，其中一条单链在氢键作用下形成四螺旋结构，即i-motif结构，从而导致组装体结构的改变，使得小尺寸的磁性纳米粒子分散开，达到t1造影效果，在图像上表现为肿瘤部位变亮；而正常组织部位的ph不会使组装体解组装，达到t2造影效果，在图像上表现为正常组织部位变暗。

优选的，所述磁性纳米粒子包括金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子或者半导体纳米粒子；所述水溶性高分子包括改性纤维素、改性淀粉、聚合类树脂、缩合类树脂中的一种或几种。

优选的，所述磁性纳米粒子包括粒径为小于5nm的氧化铁纳米粒子、氟化钆钠纳米粒子或氧化锰纳米粒子；所述水溶性高分子包括聚乙二醇、聚甲基丙烯酸、聚多巴胺、聚丙烯酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺、葡聚糖、聚丙烯酸中的一种或几种。磁性纳米粒子可以采用现有技术中的制备方法制得，磁性纳米粒子具有t1造影效果，例如3nmγ-fe2o3(kimbh,leen,kimh,etal.large-scalesynthesisofuniformandextremelysmall-sizedironoxidenanoparticlesforhigh-resolutiont1magneticresonanceimagingcontrastagents.journaloftheamericanchemicalsociety,2011,133(32):12624-12631)。

优选的，所述短单链dna能够与i-motifdna末端进行碱基互补配对。所述短单链dna的序列为：5’-nh2-cgacgacgacga-3’。

优选的，所述i-motifdna富含四段重复胞嘧啶序列，其末端可与短单链dna末端进行碱基互补配对。所述i-motifdna的两条dna序列分别为：5’-ccctaaccctaaccctaaccctatacttcgtcgtcgtcg-3’，5’-gggttaggtagcactgctcgtttcgtcgtcgtcg-3’。

本发明还提供一种如上述的ph响应型磁性纳米粒子组装体的制备方法，包括如下步骤：

(1)磁性纳米粒子进行配体交换，之后对其进行聚乙二醇的表面修饰；

(2)继续对其进行短单链dna的表面修饰；

(3)之后将i-motifdna修饰到短单链dna上，得到ph响应型磁性纳米粒子组装体。

所述步骤1)中对磁性纳米粒子进行配体交换主要是为了实现磁性纳米粒子的相转换，使得磁性纳米粒子由油相转换成水相；此外，配体交换时还可以引入基团例如溴基、氨基等，便于后续进行聚乙二醇和短单链dna的表面修饰。

优选的，选用2-溴代异丁酸和柠檬酸进行配体交换时，使得磁性纳米粒子由油相转换成水相，同时使其表面修饰了溴基。相应地选择一端氨基修饰的聚乙二醇对其进行表面修饰，同样的短单链dna也选择相应具有一端氨基修饰的短单链dna，通过氨基与溴基结合来实现组装。

优选的，选用多巴胺或磷脂聚乙二醇等进行配体交换，可引入氨基等基团。

优选的，ph响应型磁性纳米粒子组装体的制备方法，包括如下步骤：

1)油酸包覆的氧化铁纳米粒子选用2-溴代异丁酸和柠檬酸进行配体交换，得到溴基修饰的氧化铁纳米粒子；

2)加入聚乙二醇-氨基进行表面修饰，得到聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子；

3)将氨基修饰末端的短单链dna修饰到聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子表面，得到短单链dna修饰的氧化铁纳米粒子；

4)将短单链dna修饰的氧化铁纳米粒子和i-motifdna在中性缓冲液中混合，得到ph响应型磁性纳米粒子组装体。

优选的，所述步骤1)中油酸包覆的氧化铁纳米粒子的制备方法包括：

1.1)将油酸钠、氯化铁溶解于乙醇、正己烷和去离子水的混合液中，升温反应，经萃取干燥后得到油-铁复合物；

1.2)将油-铁复合物溶解于油酸、油醇和二苯醚混合液中，升温反应，经不良溶剂沉淀，得到油酸包覆的氧化铁纳米粒子。

优选的，所述步骤1.1)中油酸钠与氯化铁的投料摩尔比为2.5-3.5:1。进一步优选为3:1。

优选的，所述步骤1.1)中乙醇、正己烷和去离子水的体积比为3.5-4.5:6.5-7.5:3。进一步优选为4:7:3。

优选的，所述步骤1.1)中将油酸钠和氯化铁溶解在乙醇、正己烷和去离子水的混合液中，65-75℃油浴搅拌3.5-4.5h，反应产物在分液漏斗中用去离子水萃取多次，取上层深色有机相，旋蒸除去残余的正己烷、乙醇和水，最终得到蜡状固体形式的油-铁复合物。

优选的，所述步骤1.2)中油-铁复合物、油酸和油醇的摩尔投料比为1:0.5-1.5:2.5-3.5。进一步优选为1:1:3。

优选的，所述步骤1.2)中将油-铁复合物溶解于油酸、油醇和二苯醚混合液中，升温至85-95℃，脱气以除水除氧，并通入氩气，加热到240-260℃，该温度下反应25-35min；反应结束后用乙醇快速降温，经不良溶剂如乙醇或丙酮沉淀，得到油酸包覆的纳米氧化铁纳米粒子，将其分散于三氯甲烷中待用。

优选的，所述步骤1)中油酸包覆的氧化铁纳米粒子、2-溴代异丁酸与柠檬酸的摩尔投料比为3:90-110:8-12，溶解于氯仿和二甲基甲酰胺的混合溶液中，25-35℃加热反应过夜；反应结束后，乙醚沉淀洗涤产物，通过离心分离去除上清液，得到深色沉淀，即为溴基修饰的氧化铁纳米粒子。进一步优选，油酸包覆的氧化铁纳米粒子、2-溴代异丁酸与柠檬酸的摩尔投料比为3:100:10。

优选的，所述步骤2)中溴基修饰的氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-氨基的质量投料比为1:2-8。进一步优选为1:5。

优选的，所述步骤3)中将溶解于水中的氨基修饰末端的短单链dna与分散于水中的聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子按摩尔比1:90-110投料，搅拌5-7h后反应混合物离心，用水洗去未反应的氨基修饰末端的短单链dna。

优选的，所述步骤4)中短单链dna修饰的氧化铁纳米粒子与i-motifdna的摩尔比为1:1-10。进一步优选为1:5。

优选的，所述步骤4)中i-motifdna的制备包括：将具有ph响应解体功能的两条单链dna，在pbsph7.4中以1:1混合，经过热循环仪的淬火处理，使两条dna结合在一起。

本发明还提供一种如上述的ph响应型磁性纳米粒子组装体在制备磁共振纳米造影剂中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明所提供的ph响应型磁性纳米粒子组装体在体内呈现良好的磁共振造影效果，不仅可以在肿瘤部位呈现明亮的t1造影效果，而且在正常组织部位呈现暗的t2造影效果，达到双重对比。

(2)本发明所提供的制备方法的反应条件可控，产物尺寸均一，形貌良好，具有良好的临床转化可能性。

(3)本发明所提供的ph响应型磁性纳米粒子组装体，由于氧化铁纳米粒子及dna本身无毒或低毒，使得组装体对人体毒性极小。

附图说明

图1为实施例1制备的氧化铁纳米粒子的tem图；

图2为实施例4制备的ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在ph＝7.4和ph＝5.5时的tem图；

图3为配体交换后的氧化铁纳米粒子、聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子、单链dna修饰的氧化铁纳米粒子和ph响应型氧化铁纳米粒子组装体的动态光散射粒度分布图；

图4为应用例1中ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在ph＝7.4和ph＝5.5时的t1加权像和t2加权像图；

图5为应用例2中ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在ph＝7.4和ph＝5.5时的纵向弛豫率和横向弛豫率图；

图6为应用例3中ph响应型氧化铁纳米粒子组装体用于裸鼠肝部成像的t1加权像和t1信号强度变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1：氧化铁纳米粒子的制备

称取10.8g氯化铁(fecl3·6h2o，40mmol)和36.5g油酸钠(120mmol)，置于500ml圆底烧瓶中，80ml无水乙醇、60ml去离子水、140ml正己烷被作为溶剂加入，70℃油浴，并在反应过程中保持均匀的搅拌速度，反应4小时。待反应结束，30ml蒸馏水进行萃取，弃去下层水相，重复操作三次。萃取完毕，旋转蒸发除去正己烷、少量残余的乙醇和水，最终得到蜡状固体形式的油-铁复合物。

准确称取1.8g(2mmol)油-铁复合物置于50ml干燥的三颈烧瓶中，再加入0.57g(2mmol)油酸和1.61g(6mmol)油醇，加入10g二苯醚作为反应溶剂，90℃脱气2小时后，通入氩气，以10℃/min的恒定加热速率从90℃加热到250℃，反应30分钟，反应终止，用乙醇将含有纳米颗粒的反应溶液迅速冷却至室温，将反应液转移至离心管中，加入30ml丙酮沉淀，沉淀用乙醇洗涤两次，最终产物分散于三氯甲烷中。

对氧化铁纳米粒子用透射电镜进行形貌表征，如图1所示，粒径约为3nm。

实施例2：氧化铁纳米粒子配体交换

分别称取2-溴代异丁酸0.5g和柠檬酸0.05g置于50ml圆底烧瓶中，加入已经合成的氧化铁纳米粒子15mg，再加入氯仿和二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶液(50/50v/v,15ml)溶解反应物，30℃油浴搅拌过夜。用乙醚沉淀，再用乙醚洗涤沉淀两次，经2-溴代异丁酸配体交换后的氧化铁纳米粒子分散于而二甲基甲酰胺中待用。

实施例3：聚乙二醇修饰配体交换后的氧化铁纳米粒子

称取聚乙二醇-氨基(上海子起生物有限公司)50mg，溶解于二甲基甲酰胺中，加入含有10mg配体交换后的氧化铁纳米粒子的二甲基甲酰胺溶液中，总体积为5ml,常温搅拌过夜，离心后分散于去离子水中，得到聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子。

实施例4：ph响应型氧化铁纳米粒子组装体的制备

用氨基修饰末端的短单链dna，利用氧化铁纳米粒子表面的溴基与氨基间的结合作用将短单链dna修饰到氧化铁纳米粒子表面。氨基修饰末端的短单链dna委托上海生工生物工程有限公司合成，hplc纯，序列为：5’-nh2-cgacgacgacga-3’。

(1)将溶解于水中的氨基修饰末端的短单链dna与分散于水中的聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子按摩尔比1:100投料，搅拌6小时后反应混合物在离心机中15000rpm离心20分钟，用水洗去未反应的短单链dna，得到短单链dna修饰的氧化铁纳米粒子。

(2)具有ph响应解体功能的两条单链dna(i-motifdna，委托上海生工生物工程有限公司合成，hplc纯度10od，两条dna序列分别为：5’-ccctaaccctaaccctaaccctatacttcgtcgtcgtcg-3’，5’-gggttaggtagcactgctcgtttcgtcgtcgtcg-3’)，在pbs(ph7.4)中以1:1混合，经过热循环仪的淬火处理，使两条dna结合在一起。将短单链dna修饰的氧化铁纳米粒子和i-motifdna按摩尔比1:5混合，37℃孵育2小时制得ph响应型氧化铁纳米粒子组装体。

(3)表征实验

使用透射电镜对得到的ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在ph＝7.4(图a)和ph＝5.5(图b)进行形貌表征，如图2所示，该种ph响应型氧化铁纳米粒子组装体具有良好的ph响应性。

利用动态光散射分析配体交换后的氧化铁纳米粒子(usionp-bmpa)、聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒子(usionp-bmpa-peg2000)、单链dna修饰的氧化铁纳米粒子(usionp-bmpa-peg2000-dna)、ph响应型氧化铁纳米粒子组装体(responsiveassembly)，分别在ph＝7.4(图a)和ph＝5.5(图b)的粒度分布，结果如图3所示。图a显示氧化铁纳米粒子在配体交换、聚乙二醇、单链dna及形成组装体后粒径逐渐增加。图b显示该种ph响应型氧化铁纳米粒子组装体在不同ph条件下结构发生改变。

应用例1：ph响应型氧化铁纳米粒子组装体用于磁共振成像

实验步骤如下：先配制ph为7.4的pbs缓冲液和ph为5.5的mes缓冲液，将制备好的ph响应型氧化铁纳米粒子组装体水溶液分别用pbs缓冲液和mes缓冲液进行稀释，最终得到铁浓度为1.78mmol/l、0.89mmol/l、0.445mmol/l、0.2225mmol/l、0.11125mmol/l的ph7.4和5.5的两组溶液，不含纳米粒子的缓冲液作为空白对照。

用磁共振成像仪进行扫描，分别得到t1加权像和t2加权像，如图4所示。在t1加权像中，当ph响应型氧化铁纳米粒子组装体溶液ph为5.5时，铁的浓度在一定浓度范围内(0～0.89mmol/l)随着浓度的增高，t1加权像越来越亮，即t1造影成像效果越来越好；当ph为7.4时，在一定浓度范围内(0～0.89mmol/l)，t1加权像越来越暗，即t1造影成像效果变差。在t2加权像中，在ph为7.4时，组装体的t2造影效果，即t2加权像变暗在一定浓度范围内是随着浓度增加的，而在ph为5.5时造影效果弱于ph为7.4时的。

这是因为在ph为7.4时，氧化铁纳米粒子由dna的双螺旋结构连接形成组装体，此时由于组装产生的大的磁矩使其具有很好的t2造影效果，t1造影效果差。

当ph为5.5时，由于胞嘧啶质子化形成的i-motif结构导致双螺旋解开，氧化铁纳米粒子组装体解组装，分散成单分散的纳米粒子，此时大的比表面积使其具有很好的t1造影效果，小的磁矩使其t2造影效果差。

应用例2：ph响应型氧化铁纳米粒子组装体弛豫率的测定

配制ph为7.4的pbs缓冲液和ph为5.5的mes缓冲液，将制备好的ph响应型氧化铁纳米粒子组装体水溶液分别用pbs缓冲液和mes缓冲液进行稀释，最终得到铁浓度为1.78mmol/l、0.89mmol/l、0.445mmol/l、0.2225mmol/l、0.11125mmol/l的两组溶液。

纵向弛豫率r1的测量：用反转恢复法(inversion-recovery)法测量两组溶液样品的纵向弛豫时间t1，根据等式：(1/t1)obs＝(1/t1)d+r1[m]，其中(1/t1)obs和(1/t1)d分别为样品溶液和纯溶剂中质子的弛豫速率，[m]为溶液中铁的摩尔浓度，由于铁的浓度已知，只要测量出(1/t1)obs和(1/t1)d即可得到r1的值。

横向弛豫率r2的测量：利用自旋回波序列(cpmg)测量测量两组溶液样品的横向弛豫时间t2，根据等式：(1/t2)obs＝(1/t2)d+r2[m]，即可得到横向弛豫率r2的值。

如图5所示，氧化铁纳米粒子组装体在ph为7.4的pbs缓冲液和ph为5.5的mes缓冲液中的纵向弛豫率r1、r1’以及横向弛豫率r2、r2’。图中直线的斜率即为弛豫率。ph为7.4时，具有较大的r2/r1值，为62.93，说明其t2造影效果好。ph为5.5时，具有较小的r2’/r1’值，为6.40，说明其t1造影效果好。

应用例3：ph响应型氧化铁纳米粒子组装体用于裸鼠原位肝癌的诊断

取已种植原位肝癌的裸鼠一只，将已制备好的ph响应型氧化铁纳米粒子组装体分散在ph为7.4的pbs缓冲液中，以12mg/kg的浓度通过尾静脉注射进入裸鼠体内，分别在注射前及注射后0.5小时、1小时、2小时、3小时对裸鼠肝部进行磁共振成像扫描，获得其在不同时间点的t1加权像及信号强度。

如图6所示，图a表明注射前肝部t1加权像无法观测到肿瘤，注射0.5小时后，可观察到明显变亮的肿瘤部位，注射两小时后达到最亮，如图b、c、d、e黄色箭头部分所示。图f表示在注射前、注射0.5小时、注射1小时、注射2小时、注射3小时后肿瘤部位和正常肝组织部位t1信号强度。注射后肿瘤部位信号强度逐渐增强，在2小时达到最强，而正常肝组织部位信号逐渐减弱。这是因为肿瘤部位的酸性微环境导致双链dna解开，氧化铁纳米粒子组装体解组装分散成小尺寸的氧化铁纳米粒，具有良好的t1造影效果，因此图像上肿瘤部位变亮，信号增强，而正常肝组织部位的生理环境使得氧化铁纳米粒子保持组装状态，t1造影效果差，因此图像上正常肝组织部位变暗，信号变弱。