包含来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的慢性肺病的治疗用组合物的制作方法

本发明涉及包含来源于凝血酶处理干细胞的外泌体(exosome)作为有效成分的慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的预防或治疗用药学组合物、含有其的药学制剂及其制备方法。

背景技术

支气管肺发育不良(bpd:bronchopulmonarydysplasia)主要发生在早产儿，是由于呼吸衰竭及由此而进行的人工呼吸道治疗而引发的发展性慢性肺病，近来，随着对因肺发育不全尤其严重而使得bpd发病危险性更高的初生体重不足1000gm的超微儿的治疗活跃进行，该疾病的发病率也急剧增加。bpd不仅是导致新生儿(尤其是早产儿)死亡的主要疾病，而且对于存活儿，也同样需要长期住院，并且会诱发肺动脉高血压等严重的后遗症，即使出院后，也因病毒性急性细支气管炎与肺炎等而需要再次住院的情况达50％以上。而且，由于长期的支气管过敏性增加而转变为支气管哮喘的情况出现较多，最终导致脑性瘫痪等严重的神经病后遗症。

目前，作为早产儿的bpd治疗方法，主要是减少对新生儿及早产儿进行人工通气治疗时因正压通气的压力、脑体积损伤、氧气浓度而进行治疗的物理性努力为主，还同时采用过作为减少肺炎症损伤的类固醇疗法，但用于早产儿时，会导致神经学性的不良预后，特别是有报道指出与脑性瘫痪的增加有关，因而其使用受到限制。因此，由于新生儿/早产儿的bpd难以治疗，急需研发出有效且明确的治疗方法。

众所周知，间充质干细胞由于其多能性，是参与组织的再生、治疗及免疫应答的细胞，因上述特性，将间充质干细胞从脐带血、骨髓等进行分离培养，从而持续进行作为治疗bpd等慢性肺疾病的治疗剂的开发。但是，上述利用干细胞自身的治疗方法一直以来具有以下局限性与副作用。

第一，基本上，细胞治疗剂无法排除因dna转移的致肿瘤性(tumorogenicity)的可能性，

第二，由于干细胞自身尺寸较大，会诱发血管阻塞(vascularobstruction)或心肌梗塞(参考circheartfail.2010；3:e5-e6)，

第三，使用同种细胞(如脐带血)进行移植(同种移植)时，存在因细胞表面抗原(surfaceantigen)而引起排斥反应的问题，

第四，通常，细胞治疗剂制备工艺苛刻，在存储运输方面存在许多制约，具有生产成本高的局限性。

由于干细胞具有的先天局限性，作为减少副作用的同时提升治疗效果的方案，开发出了通过基因操作而改善功效的方法，但现实是，还未出现明确的解决方案。

一方面，外泌体是由多种细胞分泌的具有膜结构的小囊泡(直径约30-100nm)，在通过电子显微镜的研究中观察到，外泌体并非直接从原生质膜中分离，而是来源于被称为多泡体(multivesicularbodies,mvbs)的细胞内的特定区域，并被向细胞外释放与分泌。即，当多泡体与原生质膜的融合发生时，囊泡被释放到细胞外环境，并将其称为外泌体。并没有明确的研究表明这种外泌体是由何种分子机制而产生，但所知的是，不仅红细胞，包括b淋巴细胞、t淋巴细胞、树突细胞、血小板、巨噬细胞等在内的多种免疫细胞及肿瘤细胞、干细胞等，在存活的状态下，可以产生和分泌外泌体。

尤其，来源于干细胞的外泌体不仅含有受体及蛋白质，还含有核成分，从而可以起到细胞间通讯的作用。并且，上述来源于干细胞的外泌体与干细胞相比，所含有的动物血清相对较少，从而可以排除由于动物血清感染的症状(动物传染病(zoonosis))的危险性。考虑到上述外泌体的特性，可以期待利用外泌体的细胞治疗方法能够成为克服现有干细胞治疗方法局限性的新模式。

技术实现要素：

技术问题

为此，为克服干细胞治疗剂所具有的局限性同时改善对包括bpd在内的慢性肺病的治疗效果而进行的研究结果，本申请的发明人确认了来源于干细胞的外泌体(尤其是来源于经过凝血酶处理的干细胞的外泌体)能够显著增强针对细胞凋亡的保护效果及血管新生效果的事实，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种包含来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的预防或治疗用药学组合物。

但是，本发明所要实现的技术方案并非限于上述问题，未言及的其他问题也可以通过下述内容由本领域普通技术人员所明确理解。

技术方案

本发明提供一种包含来源于凝血酶处理干细胞的外泌体(exosome)作为有效成分的慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的预防或治疗用药学组合物。

本发明的一种实施方式，其特征在于，所述干细胞是选自以下的干细胞：间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞(mesenchymalstromalcell)、人组织来源间充质干细胞、多能干细胞及羊膜上皮细胞。

本发明的另一种实施方式，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述慢性肺病是支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)、慢性支气管炎(chronicbronchitis)、肺气肿(emphysema)、囊肿性纤维化(cysticfibrosis)或末梢小气道疾病(peripheralsmallairwaydiseases)。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述慢性肺病是支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，将所述药学组合物施用到对象的气道或血管内。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述药学组合物还包括选自以下的辅助成分：培养基、细胞因子、生长因子及基因。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述外泌体中的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子的表达增加。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述生长因子是脑源性神经营养因子(bdnf，brain-derivedneurotropicfactor)、成纤维细胞生长因子(fgf，fibroblastgrowthfactor)、肝细胞生长因子(hgf，hepatocytegrowthfactor)、神经生长因子(ngf，nervegrowthfactor)或血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)。

并且，本发明提供一种包含所述组合物的慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的预防或治疗用药学制剂。

本发明的一种实施方式，其特征在于，所述制剂为注射剂型、输液剂型或喷雾剂型。

本发明的一种实施方式，其特征在于，所述制剂还包括在药学上可接受的载体。

并且，本发明提供一种所述药学组合物的制备方法，

其包括如下步骤：

步骤a，培养干细胞后处理凝血酶；

步骤b，从所述步骤a的培养液中分离外泌体；及

步骤c，制备包含从所述步骤b中分离的外泌体作为有效成分的组合物。

本发明的一种实施方式，其特征在于，所述步骤a的凝血酶以1-1000个单位/ml的浓度被包含在培养基内。

本发明的另一种实施方式，其特征在于，将所述步骤c的外泌体利用离心分离。

本发明的又一种实施方式，其特征在于，所述离心分离是在5,000-500,000g下进行10分钟至5小时。

并且，本发明提供一种慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的治疗方法，其包括向对象施用来源于凝血酶处理干细胞的外泌体(exosome)的步骤。

而且，本发明提供一种制备用于预防或治疗慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的制剂中所使用的来源于凝血酶处理干细胞的外泌体(exosome)的用途。

发明效果

根据本发明的基于外泌体的治疗剂是无细胞制剂而不包含dna，因此致肿瘤性的危险性较低，并且，不存在细胞表面抗原而不存在移植排斥反应的问题。

并且，与细胞相比尺寸非常小，在全身给药时不存在毛细血管阻塞的顾虑，而且，由于是分离物质而非细胞，可以以成品的形式开发药剂，降低生产成本。

而且，与未处理干细胞相比，来源于经过凝血酶处理的干细胞的外泌体即使在少量的情况下也具有优异的慢性肺病治疗效果，因此，能够显著减少用于产生治疗剂量的外泌体而要求的干细胞的需求量，具有显著降低治疗剂生产成本的优点。

因此，根据本发明，在解决现有干细胞治疗剂所具有的问题的同时，还能够显著改善治疗功效，可以有效被用于包括支气管肺发育不良(bpd)的多种慢性肺病的治疗中。

附图说明

图1为确认对干细胞进行凝血酶处理时，外泌体的分泌得到活化的过程的tem图像分析结果。

图2为确认在来源于凝血酶处理干细胞的外泌体中是否正常发现外泌体标志物cd63及cd9的免疫印迹法(westernblotting)结果。

图3为显示通过凝血酶处理使外泌体内(bdnf、fgf、hgf、ngf、vegf)，抗炎性细胞因子(il-6)等的表达增加的免疫分析结果。

图4为显示来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体外肺细胞凋亡抑制效果的mtt分析结果。

图5为显示外泌体依赖于浓度而发挥肺细胞凋亡抑制效果的mtt分析结果。

图6为显示来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体内支气管肺发育不良(bpd)动物模型的肺泡损伤治疗效果的h&e染色结果，图6a为组织染色显微镜照片，图6b为量化肺泡损伤程度的图。

图7为显示来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体内支气管肺发育不良(bpd)动物模型的细胞凋亡(apoptosis)保护效果的tunel分析结果，图7a为tunel染色显微镜照片，图7b为量化tunel良性细胞数的图。

图8为显示来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体内支气管肺发育不良(bpd)动物模型的血管新生诱导效果的血管性血友病因子(vwf)的分析结果，图8a为抗vwf免疫荧光染色照片，图8b为将其进行量化的图。

具体实施方式

本发明提供一种包含来源于凝血酶处理干细胞的外泌体(exosome)作为有效成分的慢性肺病(chronicpulmonarydisease)的预防与治疗用药学组合物。

本发明中“干细胞”是指未分化的细胞，其具有自我复制能力的同时具有可以分化成两种以上的不同种类的细胞的能力。本发明的干细胞可以是自体或同种来源干细胞，可以来源于包括人类及除人类外的哺乳动物的任意类型的动物，无论上述干细胞来源于成体或胚胎，本发明都并非限定于此。

本发明的干细胞包括胚胎干细胞或成体干细胞，优选为成体干细胞。所述成体干细胞可以是间充质干细胞、人组织来源间充质基质细胞(mesenchymalstromalcell)、人组织来源间充质干细胞、多能干细胞或者羊膜上皮细胞，优选为间充质干细胞，但并非限定于此。所述间充质干细胞可来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜及胎盘等，但并非限定于此。

本发明中“脐带血”是指从连接胎盘与胎儿的脐静脉中采集的血液。脐带血是分娩时自然产生的附带产物，相比要求多次手术的骨髓等一般的间充质组织采集更加容易；相比骨髓移植，脐带血的存储产业较为活跃，因此已经建立有基础设施，因此更容易寻找捐献者。进一步地，脐带血来源细胞是在组织或器官移植中未发现引发排斥反应的最主要原因的组织相容性抗原hla-dr(ii类)的细胞，可以避免或最小化现有的移植手术中诱发的排斥反应等免疫反应，因此，不仅可以使用自体脐带血还可以使用他体脐带血。

本发明中“外泌体(exosome)”是指由多种细胞分泌的具有膜结构的小囊泡(直径约30-100nm)，是因多泡体与原生质膜融合而向细胞外环境释放的小囊泡。所述外泌体包括自然分泌的外泌体或者人工分泌的外泌体。

本发明中的“慢性肺病”是指随着肺部出现异常炎症反应而逐渐出现气流限制，导致肺功能下降与诱发呼吸困难的呼吸道疾病。例如，可以包括支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)、慢性支气管炎(chronicbronchitis)、肺气肿(emphysema)、囊肿性纤维化(cysticfibrosis)或者末梢小气道疾病(peripheralsmallairwaydiseases)，但并非限定于此，优选为支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)。

本发明的“慢性肺病的预防或治疗”包括慢性肺病的减轻、缓解及症状的改善，并且包括降低患慢性肺病的可能性的含义。

本发明的由“凝血酶(thrombin)处理的干细胞”与未处理干细胞相比，在对细胞活力、氧化功能等细胞稳定性不带来变化的情况下，提高作为干细胞的主要作用机制的旁分泌性能而可以强化干细胞的功能/功效。进一步地，通过凝血酶处理，不仅可以加强干细胞来源的外泌体的治疗功效，还可以增加外泌体的分泌量。

此时，旁分泌可以是生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子的增加，尤其，生长因子是促进细胞的分裂或生长、分化的蛋白质性质的生理活性物质，可以包括脑源性神经营养因子(bdnf，brain-derivedneurotropicfactor)、成纤维细胞生长因子(fgf，fibroblastgrowthfactor)、肝细胞生长因子(hgf，hepatocytegrowthfactor)、神经生长因子(ngf，nervegrowthfactor)、血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)、白细胞介素-6(il-6，interleukin-6)等。

可以将本发明的药学组合物在不受特别限制的条件下以多种途径向对象进行施用，例如，可以以口服或非口服的方式施用，但优选为向气道或血管内施用。

本发明的药学组合物与来源于干细胞的外泌体一起，还可以包括一种以上具有慢性肺病治疗效果的公知的辅助成分。例如，选自以下的一种以上辅助成分：有效治疗慢性肺病的基因(例如抗炎性细胞因子(anti-inflammatorycytokine)基因、针对炎性细胞因子(inflammatorycytokine)的sirna或反义引物(antisenseprimer))或包含其的表达载体、或者提供自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)效果的细胞因子(例如白细胞介素(interleukin)-10)、生长因子(例如角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor))，及它们的组合。

本发明的药学组合物的优选的给药量根据对象的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及周期存在不同，可以由本领域技术人员适当选择。上述组合物的施用可以为一天一次，或分为数次，并非限定于此。

为治疗慢性肺病，可以单独使用本发明的药学组合物，也可以与手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗及使用生物反应调节剂的方法并用。

本发明的组合物还可以适当包括通常用于药学组合物制备的载体。例如，对于注射剂而言，还可以包括防腐剂、止痛剂、增溶剂或稳定剂等；对于局部给药用制剂而言，还可以包括基剂(base)、赋形剂、润滑剂或防腐剂等。

可以通过药学领域的一般方法将本发明的组合物以适合向对象身体内给药的单位给药型制剂进行配制而实现给药。符合上述目的的剂型，对于非口服给药制剂而言，优选为例如注射用安瓿的注射剂、例如输液袋的输液剂及例如气雾剂的喷雾剂等。上述注射用安瓿瓶可以在使用前与注射液进行混合而配制，注射液可以使用生理盐水、葡萄糖、林格氏液等。并且输液袋可以使用聚氯乙烯或聚乙烯材料。本发明的给药是指以任意的适合的方法向对象提供既定的本发明的组合物。

本发明的药学组合物的优选的给药量根据对象的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及周期存在不同，可以由本领域技术人员适当选择。上述组合物的施用可以为一天一次，或分为数次，并非限定于此。

并且，本发明提供上述药学组合物的制备方法，包括：步骤a，培养干细胞后进行凝血酶处理的步骤；步骤b，从所述步骤a的培养液中分离外泌体；及步骤c，制备包含从所述步骤b中分离的外泌体作为有效成分的组合物。

在本发明中，凝血酶处理浓度是加强干细胞/外泌体的功效的适当浓度即可，并无特别限制，但优选地，以1-1000个单位/ml的浓度被包含在培养基中。

本发明对于分离外泌体的方法没有限制，例如，可以是在培养液中，通过离心分离、超高速离心分离、过滤器过滤、凝胶过滤层析法、自由流动电泳、毛细管电泳及利用聚合物分离等方法及上述方法的组合进行分离，优选为离心分离/超高速离心分离。此时，离心分离/超高速离心分离优选为在4℃，5,000-500,000g中进行10分钟至5小时。

本发明中用于细胞培养的培养基是指包含糖、氨基酸、各种营养物质、血清、生长因子、无机物等细胞生长及增殖等所需的必需要素的在体外(invitro)使干细胞等细胞生长及增殖的混合物。本发明中可以使用的培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem，dulbecco'smodifiedeagle'smedium)、最小必需培养基(mem，minimalessentialmedium)、基础伊格尔培养基(bme,basalmediumeagle)、rpmi1640、达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物f-10(dmem/f-10，dulbecco'smodifiedeagle'smedium:nutrientmixturef-10)、达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物f-12(dmem/f-12，dulbecco'smodifiedeagle'smedium:nutrientmixturef-12)、α-最小必需培养基(α-mem，α-minimalessentialmedium)、格拉斯哥最小必需培养基(g-mem,glasgow'sminimalessentialmedium)、isocove改良达尔伯克培养基(imdm,isocove'smodifieddulbecco'smedium)及knockoutdmem等商业化制备的培养基或人为合成的培养基，但并非限定于此。

下面，为增进对本发明的理解，提出实施例。但是，下述实施例仅用于更容易地理解本发明，本发明的内容并非由实施例所限定。

[实施例]

实施例1:通过凝血酶处理干细胞诱导外泌体分泌及增强功效

1-1.通过凝血酶诱导外泌体分泌

将人脐带血来源间充质干细胞(3×10⁵个)分注至60mm培养皿(orangescientificcat#4450200)后培养了1周。确认细胞在培养皿饱和增殖后，替换为稀释有50个单位/ml凝血酶(reyonpharmaceutical.co.,ltd)的无血清培养基(memα培养基)，再次培养了6个小时。

此时，为确认通过凝血酶处理是否使得外泌体由间充质干细胞活跃地分泌，通过透射电子显微镜(tem,transmissionelectronicmicroscopy)图像确认了外泌体的分泌过程。其结果，如图1所示，可以得知通过凝血酶的刺激能够诱导外泌体的分泌。

之后，将所述培养液分装至离心分离试管，在4℃，100,000rpm条件下离心分离30分钟，并将上清液移至新的试管，去除了细胞碎片(debris)。再次，将所述上清液在4℃，100,000rpm条件下超高速离心分离2小时后，进一步去除上清液后，获得了外泌体(最终浓度:15μg/ml)。

此时，为确认所获得的产物是否为外泌体，通过免疫印迹法验证了公知的作为外泌体标志物的cd63及cd9(systembioscience,mountainview,ca,usa)的表达。其结果，如图2所示，从凝血酶处理干细胞所获得的外泌体正常表达cd63及cd9，确认为外泌体。

1-2.通过凝血酶增强外泌体功效

确认了由所述实施例1-1获得的外泌体是否通过凝血酶处理提高了类似生长因子或il-6等的抗炎性细胞因子的表达。

具体地，利用可溶裂解缓冲液(lysisbuffer)溶解所述外泌体膜后，分离外泌体中的蛋白质，从而用procarta免疫分析试剂盒(affymatrix,美国)测量了外泌体中bdnf、fgf、hgf、ngf、vegf及il-6的量。

其结果，如图3所示，通过凝血酶处理，外泌体中脑源性神经营养因子(bdnf，brain-derivedneurotropicfactor)、成纤维细胞生长因子(fgf，fibroblastgrowthfactor)、肝细胞生长因子(hgf，hepatocytegrowthfactor)、神经生长因子(ngf，nervegrowthfactor)、血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)、白细胞介素-6(il-6，interleukin-6)的表达，相比由未经过凝血酶处理的干细胞获得的外泌体(对照组,正常)有所增加。

因此，代表凝血酶处理干细胞来源的外泌体的细胞再生、血管再生、抗炎症效果得到了增强。

实施例2:对于来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体外肺细胞凋亡的抑制效果

2-1.肺细胞凋亡的抑制效果

对大鼠肺上皮细胞株(ratpulmonaryepithelialcells,韩国细胞株银行)l2细胞系进行1小时的h2o2处理，诱导氧化损伤(oxidativeinjury)，从而制作了高氧诱导肺疾病(hyperoxiclungdisease)的体外模型。

之后，在将所述实施例1获得的外泌体(即从凝血酶处理干细胞获得的外泌体(10ug))处理所述体外模型后，通过mtt分析测量了肺细胞的存活率。

其结果，如图4所示，从凝血酶处理干细胞获得的外泌体(thexo)相比从未经过凝血酶处理干细胞获得的外泌体(ncexo)或由成纤维细胞获得的外泌体(fibroexo)，肺细胞凋亡得到显著抑制，由此，验证了本发明的凝血酶处理外泌体的肺细胞保护效果最为优异。

2-2.基于外泌体浓度的效果

利用所述实施例2-1的高氧诱导肺疾病(hyperoxiclungdisease)的体外模型，确认了外泌体的肺细胞凋亡抑制效果是否依赖浓度有所不同。

具体地，将所述实施例1获得的外泌体(即从凝血酶处理干细胞获得的外泌体)分别以2.5、5、10及20μg的浓度对所述体外模型进行处理后，通过mtt分析测量了肺细胞的存活率。

其结果如图5所示，可以确认外泌体依赖于浓度而抑制肺细胞凋亡(即对肺细胞保护发挥作用)。

实施例3:对于来源于凝血酶处理干细胞的外泌体的体内治疗效果

3-1.制作支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia)动物模型

所有动物实验获得了三星生物医学研究所实验动物委员会(researchanimallaboratorycommitteeofsamsungbiomedicalresearchinstitute,韩国)的批准，并遵循机构指导手册。

首先，为制作支气管肺发育不良动物模型,购买可以准确确认胎龄的怀孕的斯泼累格多雷白鼠(大韩biolink,韩国)后，在实验动物饲养设施中进行饲养。此时，在69.5×50.0×32.0㎝大小的丙烯酸桶(密封的树脂玻璃笼)中，在1个大气压下维持充分的湿度(40-60％)与温度(23-26℃)进行饲养。

此后，对由母鼠自然分娩的新生白鼠，在出生后立即(出生后10小时内)开始在维持85-90％以上氧气饱和度的状态下将高浓度氧气持续向笼内输入了14天。并且为防止母鼠因氧气毒性而引发肺浮肿，将母鼠以24小时为周期转移至室内空气或氧气条件，以这种方式持续饲养了14天。

3-2.验证外泌体给药后的治疗效果

将由所述实施例1的方法获得的外泌体(即通过凝血酶处理而使功效得到增强的外泌体)20ug，在无fbs的α-mem中悬浮，并将0.05ml的悬浮液利用26g针头向所述实施例3-1的暴露于高浓度氧气的出生5天的白鼠的气道内给药。

此后，在实验第14天，向新生白鼠的腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉后，固定四肢后切开胸廓露出心脏与肺组织。其中，对一部分白鼠利用冰冷pbs溶液实施心脏灌注后将心脏与肺同时摘除，并向支气管放入管并牢固地固定，并放入4％的福尔马林固定液，以25㎝h2o的压力进行一定的膨胀，之后，整晚使用固定液进行固定。此后，分别进行下述实验。

组织观察:h&e染色

将在4％福尔马林中固定24小时的所述肺组织切片包埋在石蜡之后，切成4μm的厚度进行苏木精/伊红组织染色，之后使用光学显微镜进行组织观察，从而对由高氧诱发损伤的肺组织进行干细胞与干细胞来源外泌体的治疗效果的比较评价。

其结果，如图6a所示，与正常白鼠的肺组织(nc)相比，诱发支气管肺发育不良的白鼠的肺组织(hc)的肺泡损伤更加严重，并且对该肺泡损伤，本发明的来源于凝血酶诱导的干细胞的外泌体给药组(h+msc-ev)与干细胞给药组(h+msc)呈现出类似的肺泡保护/治疗效果。相反，来源于成纤维细胞(fibroblast)的外泌体给药组(h+fibro-ev)与干细胞来源的外泌体不同，几乎没有治疗效果，由此可知，根据外泌体来源的来源细胞的特异性决定其治疗效果的发挥。

并且利用平均线性指数对肺泡损伤程度进行定量分析的结果，如通过图6b所示可以得知，与正常组(nc)相比，支气管肺发育不良模型组(hc)的肺泡发育受到损伤，使得平均线性指数显著地更高，但在支气管肺发育不良模型中施用干细胞的组(hm)或施用来源于凝血酶诱导干细胞的外泌体的组(hm-ev)，肺损伤有所好转而使平均线性指数的数值显著降低。与此相反，来源于成纤维细胞(fibroblast)的外泌体给药组(hf-ev)与干细胞来源的外泌体不同，几乎没有治疗效果。

细胞凋亡分析:tunel分析

众所周知，tunel分析(末端脱氧核苷酸介导的dutp缺口末端标记分析(terminaldeoxynucleotidyl-mediateddutpnick-endlabelingassay))是测量细胞凋亡程度的染色方法。凋亡的细胞的dna与正常细胞不同，具有露出3'-ohdna末端的片段化的dna片段，因此可以利用被称为末端脱氧核苷酸转移酶(tdt,terminaldeoxynucleotidyltransferase)的酵素在3'-ohdna末端使用荧光素-12-dutp(核苷酸)进行标记，从而区分凋亡的细胞与正常细胞来进行测量，由此，tunel良性染色细胞数量越多，代表凋亡的细胞越多。

具体地，制作脱蜡的5μm肺切片后，利用原位细胞凋亡检测试剂盒(s7110apoptag,chemicon,temecula,ca,usa)，根据生产厂商的指导而进行分析。

其结果，如图7a及7b所示，可以得知与所述h&e组织染色的结果一致。即，与正常白鼠的肺组织(nc)相比，诱导支气管肺发育不良的肺组织(hc)的细胞凋亡更加严重，对该细胞凋亡，本发明的来源于凝血酶诱导的干细胞的外泌体给药组(h+msc-ev)与干细胞给药组(h+msc)呈现出类似的细胞凋亡抑制效果。相反，来源于成纤维细胞(fibroblast)的外泌体给药组(h+fibro-ev)与干细胞来源的外泌体不同，几乎没有出现细胞凋亡抑制效果，可以得知根据外泌体的来源的来源细胞的特异性而决定其治疗效果的发挥。

血管生成分析:血管性血友病因子(vwf)

为确认本发明的来源于凝血酶诱导干细胞的外泌体是否能够诱导血管生成而发挥治疗支气管肺发育不良的效果，通过观察当间充质细胞分化为血管内皮细胞时合成分泌的血管性血友病因子(vwf)的活性，而分析了血管生成(angiogenesis)的程度。

具体地，制作脱蜡的5μm肺切片后，为追踪vwf，使用抗vwf的1次抗体(内皮细胞标记物,兔多克隆,dako,glostrup,denmark)及生物素化的2次抗体进行了免疫荧光染色。此后，通过利用imagej(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth),usa)测量免疫荧光染色的荧光强度，从而对存在于肺切片的vwf的量进行评估。

其结果，如图8a及8b所示，相比正常白鼠的肺组织(nc)，诱发支气管肺发育不良的白鼠的肺组织(hc)的血管生成减少，对该血管生成减少，本发明的来源于凝血酶诱导的干细胞的外泌体给药组(h+msc-ev)与干细胞给药组(h+msc)具有类似的血管生成效果。相反，来源于成纤维细胞(fibroblast)的外泌体给药组(h+fibro-ev)与干细胞来源的外泌体不同，几乎不存在血管生成效果，如此可以得知，根据外泌体来源的来源细胞的特异性而决定其治疗效果的发挥。

上述对本发明的说明为示例说明，本发明所属领域的普通技术人员，在不改变本发明的技术思想与所必需的特征的情况下，可以容易地变形为其他具体形态。因此，上述叙述的实施例在任何方面仅作为示例，而非用于进行限定。

工业实用性

根据本发明的基于外泌体的治疗剂，可以解决现有干细胞治疗剂所具有的移植排斥反应或生产成本高等问题，同时，能够显著改善治疗效果，能够有益地被用于包括支气管肺发育不良(bpd)的多种慢性肺病的治疗。