一种治疗脑胶质瘤和肝癌的药物组合物的制作方法

本发明属药物
技术领域：
，具体涉及一种治疗特定恶性肿瘤的药物。
背景技术：
：肿瘤的发病率约为0.28％。死亡率约0.18％，是严重威胁人类健康和心理的重要疾病。目前对肿瘤特别是恶性肿瘤的临床治疗药物虽然种类很多，但还存在治疗效果不理想、毒副作用大和费用较高的缺点。开发出能提高临床治疗效果，降低毒副作用和成本的抗癌药物，一直是药物研发人员追求的目标。蒿甲醚(Artemether，ART)为青蒿素的脂溶性衍生物，临床上已用于治疗疟疾，更为重要的是利用该药具有透过血脑屏障的特性，用于治疗脑型疟疾具有显著疗效。近年的研究发现，蒿甲醚在体内外有明显抗肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的作用，其主要的作用机制如下：1、细胞周期阻滞：青蒿素或及其衍生物青蒿琥酯可诱导Kaposi’s肉瘤细胞周期时间明显缩短，青蒿素及其衍生物二氢青蒿素可使人乳腺癌MCF-7细胞阻滞在G0/G1期；2、诱导细胞凋亡：青蒿琥酯可诱导Kaposi’s肉瘤细胞凋亡，且具剂量依赖性，对正常细胞无损伤；3、抗血管生成作用：青蒿素类药物可以通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达而阻止肿瘤血管的生成；4、青蒿素类药物可以调节肿瘤相关基因的表达，从而实现抑瘤的作用，如可抑制脑胶质瘤细胞U87增殖及凋亡，并导致细胞内癌症相关基因的表达发生变化；5、铁离子介导的细胞损伤：恶性肿瘤细胞中的铁离子含量较正常细胞大很多，青蒿素类药物可通过铁离子介导形成内过氧化桥，产生活性氧离子(ROS)和以碳为核心的自由基，进而使细胞发生分子损伤和死亡。由于蒿甲醚能够透过血脑屏障，因此治疗脑实体瘤还有特定优势，即能诱导脑胶质瘤细胞凋亡。蒿甲醚毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用。双氢青蒿素或青蒿琥酯或蒿乙醚也具有与蒿甲醚类似的功效和优点。辅酶Q10(CoenzymeQ10)是一种脂溶性抗氧化剂，为人类生命不可缺少的重要物质之一。辅酶Q10能激活单核巨噬细胞提高细胞活性，有效清除氧自由基，提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力，医学上广泛用于心血管系统疾病。辅酶Q10口服易吸收：Wistar系雄性大白鼠和家兔一次经口给予0.6mg/Kg的辅酶Q10，分别在1小时和2小时后达到最高血药浓度，之后呈双相性在血中消失；大白鼠在投药后4小时肺、心脏、肝脏和肾等组织的药物浓度增加，10小时后肾上腺、肝脏和胃组织药物浓度增加，给药后7天，大白鼠尿中排出1.9％，粪中排出85％，家兔尿中排出2.9％，粪中排出91％。辅酶Q10现已是一种市场广泛使用的保健品，低毒，安全可长期服用。专利文件ZL201410152515.3公布了“一种治疗脑胶质瘤的药物组合物”。该药物以蒿甲醚和替莫唑胺为活性组分，但替莫唑胺有很强的毒副作用。实验报道在Ames/沙门氏菌和HPBL试验中显示有致突变作用，并在人外周淋巴细胞测定中能引起染色体畸变。在临床上主要的不良反应包括恶心、呕吐、倦怠和血液学反应。恶心、呕吐、头痛和倦怠的发生频率最高。临床观察发现：胶质瘤患者的3级或4级血小板减少和中性白细胞减少的发生率分别为19％和17％。骨髓抑制是可以预见的(一般在开始几个周期的第21-28天)。还报告全血细胞减少、白细胞减少和贫血；淋巴细胞减少也很常见。所以该药物不能长期使用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种治疗脑胶质瘤和肝癌的药物组合物，和现有技术相比，有更好的安全性和抑瘤效果，更低的价格。本发明药物组合物的特征在于以蒿甲醚或双氢青蒿素或青蒿琥酯或蒿乙醚，以及辅酶Q10为活性组分，组合物中所含上述活性组分之间的相对重量份额为蒿甲醚或双氢青蒿素、或青蒿琥酯、或蒿乙醚为40～70份，辅酶Q100.5～4.0份。优选蒿甲醚。进一步优化方案是按重量份额蒿甲醚65～67份，辅酶Q100.5～2.0份。本发明药物的剂型以胶囊为首选，但也可以是其他剂型，如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、颗粒剂、冲剂、散剂、混悬剂等。本发明药物的临床使用剂量推荐为：按蒿甲醚与辅酶Q10的总量计、每天每千克体重使用40～74mg。蒿甲醚和辅酶Q10联用，二者具有协同作用，优势互补，呈现出毒副作用低，疗效显著，能穿透血脑屏障，价格低廉，可长期服用等优点。试验研究结果显示：蒿甲醚和辅酶Q10联用对体外培养的SD大鼠脑胶质瘤C6细胞株抑制作用明显。蒿甲醚和辅酶Q10联用或单用的效应均为时间和浓度的依赖关系，两药合用为协同关系。两药联用时的IC50值低于二者单用时；动物实验充分证实，蒿甲醚与辅酶Q10联用表现良好的抑瘤效果，效果强于二者单用时；病理切片结果显示，蒿甲醚与辅酶Q10联用时，脑胶质瘤的微血管数量明显减少，抗血管生成作用强于二者单用时。实验1：测定蒿甲醚与辅酶Q10单用与联用对C6脑胶质瘤细胞的抑制作用。实验试剂：RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司，噻唑蓝(MTT)购自美国SIGMA公司，DMSO购自美国SIGMA公司。主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；无菌操作台(美国Forma公司)。细胞株及细胞培养：SD大鼠脑胶质瘤细胞株C6细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基于37℃，5％CO2恒温培养箱中常规培养。药物：蒿甲醚(昆明制药集团股份有限公司，50mg)。辅酶Q10(玉溪建坤生物药业有限公司50mg)。试验方法：四甲基偶氮唑盐法(MTT法)：取对数生长期C6细胞，调整细胞悬液为1×105个/m1。取三个96孔板，在细胞板的外周各孔均加入200μ1的生理盐水，其它各孔每孔用移液器加入细胞浓度为1×105个/m1的细胞悬液200μ1，使每孔细胞数2.0×104个，其中设置空白对照组1个包括6个复孔、实验组9个在此后的实验中依次用于加入不同浓度的药液(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml)，每个浓度的药物组均设6个复孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h；取出96孔板，用移液器小心吸去上清液，实验组每孔分别加入用完全培养液配制的相应浓度的药物溶液200μl，每个浓度6个复孔。空白对照组加200μl的完全培养液，置37℃，5％CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h；称取10mgMTT溶于2mlPBS中，过滤，取滤液1.5ml与13.5ml完全培养基混匀；取出已培养到相应时间的培养板，用25ml注射器吸干孔内的液体，每孔加入200μlMTT溶液，放入培养箱内继续孵育4h，去除MTT，每孔加入150μlDMSO，暗处振荡15min，450型ELISA-Reader酶标仪(Bio-Rad公司)490nm主波长，630nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度蒿甲醚对C6和CT-26结直肠癌细胞增殖的抑制率：细胞抑制率(％)＝(1－药物组吸光度/对照组吸光度)×100％。借助SPSS17.0软件求的IC50值。实验结果：两药单用及合用时不同浓度的效应：两药单用及合用时随着药物浓度增加对细胞抑制率也增加，见表1。表1：不同浓度的药物单用及合用对C6细胞的抑制率两药单用及合用时不同作用时间的效应：两药单用或联用随作用时间的延长其效应也增加，见表2。表2：200μg/ml的ART、500ng/ml的辅酶Q10单用及合用不同作用时间对C6细胞的平均抑制率时间(h)244872ART组75.12±1.1278.14±1.1780.21±1.36辅酶Q1048.52±1.8551.89±1.7657.44±1.68ART+辅酶Q10组84.67±1.6990.07±1.3491.07±1.75蒿甲醚与辅酶Q10联用可协同抑制大鼠脑胶质瘤C6细胞株生长，两药单用及联用均呈时效及量效关系。实验2：蒿甲醚与辅酶Q10单用和联用对C6细胞形态的影响主要试剂：RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司，0.25％的胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)；无菌操作台(美国Forma公司)。细胞株及细胞培养：大鼠脑胶质瘤细胞株C6用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基于37℃，5％CO2恒温培养箱中常规培养。药物：蒿甲醚(昆明制药集团股份有限公司，50mg)。辅酶Q10(玉溪建坤生物药业有限公司50mg)。实验方法：分别取对数生长期的C6和CT-26细胞1×106/ml接种在6孔板，实验设对照组、蒿甲醚组(200μg/ml)辅酶Q10组(5ng/ml)、两药合用组。作用48h后，收集对照组和实验组细胞，PBS小心清洗后，室温下3％甲醛固定10min，PBS小心清洗后，倒置显微镜下观察对照组和实验组细胞形态变化并拍照。实验结果：观察可见，对照组细胞呈不规则贴壁生长；实验组细胞经药物作用48h，可见不同程度的变化，其中两药合用组变化最明显：细胞变圆、缩小，折光性增加，许多细胞脱落漂浮，出现细胞气泡化及细胞碎片。实验3：蒿甲醚与辅酶Q10联用对大鼠C6原位脑胶质瘤协同抑制作用的研究。材料：SD大鼠C6脑胶质瘤细胞株由中国科学院昆明动物研究所提供。实验动物：成年SD大鼠，体重200-250g，48只，雄性(由昆明医科大学提供，批准文号：SCXK滇P0005-0008)。试剂：RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司，0.25％的胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。仪器：二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)；无菌操作台(美国Forma公司)；脑部立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。药物：蒿甲醚(昆明制药集团股份有限公司，50mg)。辅酶Q10(玉溪建坤生物药业有限公司，50mg)。实验方法：C6细胞复苏成功后接种于50cm2的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中。培养基为10％FBSRPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。待贴壁细胞为对数生长期时，先倾去培养液，然后用0.25％的胰酶消化并放于37℃，5％CO2的恒温培养箱中，当在显微镜下观察到细胞开始皱缩时，加入1640培养基中和，反复轻柔吹打使之脱壁，1000rpm离心5分钟弃上清，用0.01MPBS洗涤两次，计细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬浮于含质量数为1％的琼脂糖双倍1640中待接种，细胞浓度为1×105/μl。SD大鼠原位C6脑胶质瘤模型：取成年，体重在200-250g的成年雄性SD大鼠48只，体重约250-300g，随机分为4组，即对照组(生理盐水组)、单用蒿甲醚组、单用辅酶Q10组和两药联用组，每组12只。10％戊巴比妥那腹腔注射麻醉(0.3ml/100g体重)；将麻醉后的大鼠头部固定在脑立体定向仪上，常规备皮，消毒，铺巾；内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，分离暴露颅骨。以牙科电钻(转速2000r/min)在颅骨上钻一小孔，注射位点为冠状缝前1mm，中线右旁开3mm，深5mm；用25μl微量注射器实验组抽取C6细胞悬液10μl(1×106)而对照组抽取同体积的0.9％生理盐水，注射速度为2.5μl/min，共注射4min，注射完毕后留针3-5min，缓慢拔针。骨孔用明胶海绵填充后，骨蜡封闭。实验给药及标本获取：对照组(生理盐水0.4ml/20g/日)、蒿甲醚单用组(66.6mg/kg/日)、单用辅酶Q10组(70mg/kg/日)、两药联用组(66.6mg/kg/日+70mg/kg/日)。各组均在接种C6脑胶质瘤细胞当天，采用灌胃给药法连续给药14天,间隔6天，于接种后的第20天解剖出大鼠经活体左心室灌注4％多聚甲醛固定肿瘤的全脑标本，进行肉眼观察并拍照。按大鼠的表面接种穿刺点做冠状切口，按垂直和水平方向测量肿瘤大小，肿瘤体积＝a2bп/6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)，肿瘤生长的抑制率＝[(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积/对照组肿瘤平均体积)]×100％来表示。肿瘤标本用4％多聚甲醛固定。采用统计学分析软件SPSS13.0进行统计学分析，观察各组之间肿瘤体积及血管内皮生长因子(VEGF)阳性表达率有无统计学差异。实验结果：1、两药单用与联用对SD大鼠肿瘤体积的影响接种C6细胞后的第20天解剖出大鼠经活体左心室灌注4％多聚甲醛固定肿瘤的全脑标本，按大鼠的表面接种穿刺点做冠状切口，按垂直和水平方向测量肿瘤大小，按照公式计算肿瘤体积及各用药组的抑瘤率,得到各组肿瘤体积大小，见表3。经过统计学分析，对照组肿瘤体积与蒿甲醚单用组、辅酶Q10单用组及两药联用组比较，均有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。两药联用组肿瘤体积明显比对照组肿瘤体积小，而且还明显小于蒿甲醚单用组和辅酶Q10单用组。表3：各组肿瘤体积*：P<0.05vs对照组；**：P<0.01vs对照组2、两药单用与合用对SD大鼠原位C6脑胶质瘤的抑制作用结果分析显示：蒿甲醚单用组、辅酶Q10单用组及两药联用组的肿瘤抑制率分别是，蒿甲醚单用组<辅酶Q10单用组<两药联用组,如表4所示。表4：各实验组的抑瘤率(％)蒿甲醚单用组辅酶Q10组两药联用组C6抑瘤率(％)63.82±0.71％46.87±0.69％86.71±0.72％3、两药单用与联用对脑胶质瘤的抗血管生成作用HE染色结果：对照组C6细胞呈浸润性生长，肿瘤细胞排列非常致密，宿主血管退化，新生肿瘤血管形成，并可见到栅栏状坏死。图1可见，蒿甲醚单用组、辅酶Q10单用组及两药联用组的肿瘤排列致密程度明显低于对照组，并与正常组织有明显的分界线。辅酶Q10组可见视野内肿瘤细胞散在分布，肿瘤细胞数量较蒿甲醚单用组明显减少，肿瘤细胞异形性没有对照组明显，细胞排列较为稀疏。两药联用组视野内肿瘤细胞散在、稀疏分布肿瘤细胞数量显著少于蒿甲醚单用组和辅酶Q10单用组，肿瘤细胞异形性没有对照组明显。VEGF免疫组化染色结果：由图2可以看出,对照组胞浆染色面积明显高于其它各用药组。蒿甲醚单用组、辅酶Q10单用组及两药联用组肿瘤细胞胞浆棕染色面积依次减少。肿瘤VEGF阳性表达率：表5显示，经过SPSS13.0进行方差分析可以看出，对照组的VEGF阳性表达率明显高于其它各组，与其他各实验组都有统计学差异(P<0.05)，蒿甲醚单用组、辅酶Q10单用组及两药联用组也有统计学差异(P<0.05)，并且阳性表达率依次降低。表5：各组VEGF阳性表达率(％)对照组蒿甲醚组辅酶Q10组两药联用组VEGF阳性表达率71.18±3.9745.10±4.1647.16±3.0825.34±2.01从以上实验可见，本发明药物抑瘤率可达86.71％，而ZL201410152515.3药物的抑瘤率为82.12。本发明的有益效果：产品不但有更好的安全性和更低的价格，而且还提高了抑瘤率。附图说明：图1为对照组病理切片(HE×200)；图2为蒿甲醚单用组病理切片(HE×200)；图3为辅酶Q10组病理切片(HE×200)；图4为蒿甲醚与辅酶Q10两药联用组病理切片(HE×200)；图5为对照组VEGF免疫组化染色结果(×200)；图6为蒿甲醚单用组VEGF免疫组化染色结果(×200)；图7为辅酶Q10组VEGF免疫组化染色结果(×200)；图8为蒿甲醚与辅酶Q10两药联用组免疫组化染色结果(×200)。上述图1～4显示出本发明所述药物组合物与对照药治疗后模型SD大鼠脑胶质瘤H.E染色病理切片比对情况。上述图5～8显示出本发明所述药物组合物与对照药治疗后模型SD大鼠脑胶质瘤免疫组化病理切片比对情况。具体实施方式：实施例1：药物中所含活性组分之间的相对重量份额为：蒿甲醚70份，辅酶Q1.0份，按现有制药工艺加上所需辅料制成颗粒剂。实施例2：药物中所含活性组分之间的相对重量份额为：蒿甲醚45份，辅酶Q3.5份，按现有制药工艺加上所需加上辅料制成肠溶衣片。实施例3：药物中所含活性组分之间的相对重量份额为：蒿甲醚60份，辅酶Q0.6份，按现有制药工艺加上所需加上辅料制成软胶囊。实施例4：药物中所含活性组分之间的相对重量份额为：蒿甲醚55份，辅酶Q3.0份，按现有制药工艺加上所需加上辅料制成硬胶囊。实施例1～4的本发明药物和ZL201410152515.3药物相比，均提高了抑瘤率，降低了毒副作用和价格，延长了患者可连续服用期限。实施例5：用实施例4的药物，于2016年12月28日-2017年10月15日，对一肝癌晚期患者(云南省第一人民医院诊断)进行给药观察，本病人从给药前的生活不能自理，到2017年10月15日时已可工作，临床症状基本消失。体检后肝脏未见异常(云南省第二人民医院检测)。以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应被视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3